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Plan t Regenera tion from Hypocotyls of Acac ia au ricu liform is Cultured in vitro

大叶相思下胚轴离体培养再生植株的研究



全 文 :林业科学研究 2008, 21 (3) : 403~406
Forest Research
  文章编号 : 100121498 (2008) 0320403204
大叶相思下胚轴离体培养再生植株的研究
刘娟旭 1, 2 , 刘 玲 1 , 王 静 1 , 余义勋 13
(1. 华南农业大学园艺学院 ,广东 广州 510642;
2. Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Apopka, FL 3270328504, U. S. A. )
关键词 :大叶相思 ; 下胚轴 ; 植物生长调节剂 ; 植株再生
中图分类号 : S792. 99     文献标识码 : A
收稿日期 : 2007212206
基金项目 : 霍英东教育基金项目“反义 RNA及 RNA i技术延长月季切花自然保鲜期 (104031) ”;广东省自然科学基金项目“基因工程培
育具有芳香品质红掌的研究 (05300848) ”
作者简介 : 刘娟旭 , 女 , 博士后 , 主要研究方向 : 园林植物生物技术. E2mail: juanxuliu@ yahoo. com. cn3 通讯作者 :余义勋 , 男 , 博士 ,副教授 ,主要研究方向 :园林植物生物技术 ;电话 : 13268200418; E2mail:  yuyixun@ scau. edu. cn
Plan t Regenera tion from Hypocotyls of A cacia au ricu liform is Cultured in vitro
L IU Juan2xu1, 2 , L IU L ing1 , WANG J ing1 , YU Yi2xun13
(1. College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;
2. Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida, Apopka, FL 3270328504, U. S. A)
Abstract: The regenerated p lantlets of A cacia auricu liform is were obtained by the method of re2differentiation of the
callus from the hypocotyls exp lants. The effects of p lant regulator compositions on the induction of callus and the
differentiation of adventitious buds in vitro culture were studied. The op timum medium for callus induction was MS
medium containing 1. 0 or 1. 5 mg ·L - 1 2, 42D and 0. 5 mg ·L - 1 KT and 100% the callus induction frequency was
obtained. The op timum medium for re2differentiation of callus wasMS medium containing 1. 5 mg ·L - 1 62BA and
0. 2 mg ·L - 1 NAA and 84. 7% of adventitious shoot regeneration frequency with 5. 83 shoots per exp lants was
obtained. In addition, the op timum medium for the adventitious buds induced from the hypocotyls exp lants without
transferring the calluswasMS medium containing 2. 0 mg ·L - 1 62BA , 0. 1 mg ·L - 1 NAA and 0. 2 mg ·L - 1 KT.
Excised shoots were effectively elongated in MS medium without appending any hormones. Elongated shoots of 3. 0
cm rooted when they were transferred to MS medium containing 0. 1 mg ·L - 1 IAA and 0. 2 mg ·L - 1 NAA after 30
days and developed into healthy p lantlets, which resulted in a rooting rate of 85 %. The results of this study will
facilitate the app lication of genetic transformation methods in A. auricu liform is.
Key words:A cacia auricu liform is; hypocotyls; p lant growth regulator; p lant regeneration
大叶相思 (A cacia auricu laeform is A. Cunn. )为
含羞草科 (M imosaceae)金合欢属 (A cacia M ill. )的落
叶乔木 ,原产澳州 , 20世纪 60年代初引入广东省。
大叶相思适应性强 ,速生、耐干旱瘠薄 ,根瘤发达 ,固
氮能力较强 ,枯枝落叶量大 ,对改良土壤、提高肥力
很有利 ,是荒山造林、水土保持和改善生态环境的优
良树种之一。此外 ,大叶相思高大挺拔 ,花期满树黄
花 ,十分壮观 ,为华南地区的优良行道树。有关其它
相思类树种组培成功的报道较多 [ 1 - 5 ] ,陈本学等 [ 6 ]对
相思类树种的外植体在组培中的应用进行了综述 ,颜
慕勤等 [ 7 ]、翟应昌等 [ 8 ]、高洁等 [ 9 ]研究了大叶相思组
培 ,并获得成功 ,但多以快繁为目的 ,国外未见大叶相
思组织培养的报道。本研究以大叶相思下胚轴为外
植体 ,通过愈伤组织诱导途径建立大叶相思高效再生
林  业  科  学  研  究 第 21卷
体系 ,为开展大叶相思转基因研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料来源
2005年 4月在华南农业大学校园采收健康饱
满的大叶相思种子 ,贮藏于 4 ℃冰箱备用。
1. 2 方法
1. 2. 1 无菌苗的获得及诱导培养  2个月后从冰
箱中取出大叶相思种子 , 42 ℃温水浸泡 10 h后 ,用
自来水冲洗 10 m in,在超净工作台上用 70%的酒精
消毒 30 s,再用 0. 1%升汞溶液消毒 8~10 m in,无菌
水冲洗 4次 ,接种到 1 /2 MS培养基中。15 d后种子
膨大发芽 , 20 d后子叶长出 , 35 d后下胚轴伸长至
3. 5 cm左右时 ,切取幼苗的下胚轴 0. 5~1. 0 cm接
种到诱导培养基上培养。每培养瓶接种 5个下胚轴
切段外植体 ,每处理 8瓶 ,下同。
培养基内琼脂浓度均为 7 g·L - 1 ,蔗糖浓度为
30 g·L - 1 , pH值 5. 8~6. 0,培养条件为 24~26 ℃,
光照 12 h·d - 1 ,光照强度 3 000 lx。
1. 2. 2 2, 42D和 KT以及 62BA和 NAA组合对下胚
轴愈伤组织的诱导 诱导培养基的基本培养基为
MS,附加不同浓度的 2, 42D、KT、62BA和 NAA组成
愈伤组织诱导培养基。2, 42D 的浓度分别为 0. 0、
0. 5、1. 0、1. 5 mg·L - 1 , KT的浓度分别为 0. 0、0. 5
mg·L - 1 , 62BA的浓度分别为 0. 0、0. 5、1. 0、2. 0 mg
·L - 1 , NAA的浓度分别为 0. 0、0. 2 mg·L - 1。大叶
相思无菌苗下胚轴切 0. 5~1. 0 cm左右 ,平接于培
养基中进行愈伤组织诱导培养 , 30 d后统计愈伤组
织诱导率。
1. 2. 3 62BA和 NAA对愈伤组织再分化的影响  在
1. 2. 2节愈伤组织诱导培养基中继续培养 ,愈伤组织
难以自行分化成芽。预试验中 ,作者曾选用 TDZ、62
BA、Zt比较促进分化的效果 ,结果发现 62BA和 NAA
对大叶相思下胚轴愈伤组织的再分化有较好的效果。
以 MS为基本培养基 ,附加不同浓度的 62BA和 NAA
组成愈伤再分化培养基。62BA的浓度分别为 0. 0、
0. 5、1. 0、2. 0、3. 0 mg·L - 1 , NAA的浓度分别为 0. 2、
0. 4 mg·L - 1。35 d后统计萌发不定芽数 ,研究 2种
植物生长调节剂对愈伤组织再分化的影响。
1. 2. 4 62BA、NAA和 KT组合诱导下胚轴愈伤组织
和不定芽分化 在实验中 ,通过调整激素配比 ,下胚
轴可在含有 62BA、NAA和 KT的培养基中不经过转换
培养基诱导不定芽分化。以 MS为基本培养基 , 62BA
的浓度分别为 0. 0、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0、3. 0 mg·L - 1 ,
NAA的浓度分别为 0. 1、0. 3 mg·L - 1 , KT的浓度为
0. 2 mg·L - 1。经 30 d的培养 ,研究 3种植物生长调
节剂对愈伤组织诱导和再分化的影响。
1. 2. 5 62BA和 IBA对再生植株增殖的影响 以 MS
为基本培养基 ,附加不同浓度的 62BA和 IBA, 30 d后
统计增殖倍数。62BA的浓度分别为 0. 0、1. 0、1. 5、2. 0
mg·L - 1 , IBA 的浓度分别为 0. 1、0. 3、0. 5、1. 0 mg
·L - 1。
1. 2. 6 不定芽的伸长、生根及移植  将再生不定芽
接种到不添加植物生长调节剂的 MS培养基中伸长培
养 ,伸长后的小苗接种到 MS + IAA 0. 1 mg·L - 1 +
NAA 0. 2 mg·L - 1培养基中 , 30 d后统计生根率。待
根长至 3 cm左右时 ,炼苗 2 d,之后将苗取出 ,洗去根
上的培养基 ,移植到经过消毒的混合基质 (园土∶泥炭
土 = 1∶1)中 ,每周浇 3次水 , 20 d后统计成活率。
2 结果与分析
2. 1 不同植物生长调节剂配比对植株再生的影响
2. 1. 1 2, 42D和 6 - BA对诱导愈伤组织的影响 下
胚轴分别接种于附加不同浓度的 2, 42D 和 62BA培养
基中 ,均可不同程度地诱导愈伤组织 (表 1) , 20 d后
下胚轴上部和下部伤口处均开始出现疏松浅黄色愈
伤组织 (图版Ⅰ,A)。在 2, 42D 1. 0 mg·L - 1或 1. 5 mg
·L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1组合中 ,愈伤组织诱导率最
高 ,可达 100%;而 62BA 2. 0 mg·L - 1 +NAA 0. 2 mg·
L - 1组合愈伤组织诱导率也可达 90. 0%。
表 1 M S培养基中 2, 42D和 KT及 62BA和
NAA组合对下胚轴愈伤组织的诱导率
MS培养基中激素组成 愈伤组织诱导率 /%
2, 42D 0. 5 mg·L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1 82. 5
2, 42D 1. 0 mg·L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1 100. 0
2, 42D 1. 5 mg·L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1 100. 0
62BA 0. 5 mg·L - 1 + NAA 0. 2 mg·L - 1 52. 5
62BA 1. 0 mg·L - 1 + NAA 0. 2 mg·L - 1 75. 0
62BA 2. 0 mg·L - 1 + NAA 0. 2 mg·L - 1 90. 0
2. 1. 2 62BA和 NAA对愈伤组织再分化不定芽的影
响 将愈伤组织块转移到含不同浓度的 62BA和 NAA
培养基上进行芽诱导 , 20 d后可分化出浅绿色不定芽
点 ,后逐渐分化出芽 (图版Ⅰ,B、C) ;培养 35 d后 ,统计萌
发不定芽数 (表 2)。由表 2可见 : 62BA浓度对大叶相
思不定芽分化有很大影响 ,只有 NAA时 ,不定芽分化率
为 0;最佳愈伤组织再分化培养基是 MS + 62BA 1. 5 mg
·L - 1 + NAA 0. 2 mg·L - 1 ,不定芽再分化率可达
404
第 3期 刘娟旭等 :大叶相思下胚轴离体培养再生植株的研究
84. 7% ,平均每个愈伤组织块的分化芽数达5. 83个。
表 2 M S培养基中 62BA和 NAA对
愈伤组织再分化不定芽的影响
62BA /
(mg·L - 1 )
NAA /
(mg·L - 1 )
不定芽分化率 /
%
平均不定芽数 /

0. 0 0. 2 0. 0 0. 0 d
0. 5 0. 2 52. 8 c 1. 95 c
1. 0 0. 2 54. 6 c 2. 38 b
1. 5 0. 2 84. 7 a 5. 83 a
2. 0 0. 2 82. 4 a 5. 41 a
3. 0 0. 2 66. 1 b 2. 59 b
1. 0 0. 4 42. 9 d 2. 48 b
1. 5 0. 4 82. 6 a 5. 31 a
2. 0 0. 4 81. 4 a 5. 49 a
3. 0 0. 4 66. 9 b 2. 41 b
2. 1. 3 62BA、NAA和 KT组合对下胚轴诱导愈伤
组织和分化不定芽的影响  下胚轴外植体接种至含
有 62BA、NAA和 KT的培养基中 ,部分下胚轴接种
20~25 d后产生浅绿至深绿色愈伤组织 ,质地较为
致密 ,表面粗糙 ,呈块状 ;这种愈伤组织随后可分化
出不定芽 ,逐渐长成小芽丛 (图版 Ⅰ, D~F)。由表 3
可见 :最佳培养基是 MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 +NAA
0. 1 mg·L - 1 + KT 0. 2 mg·L - 1 ,愈伤组织诱导率达
92. 5% ,不定芽分化率达 72. 5% ,平均每个下胚轴
分化芽数达 5. 94个。
表 3 M S培养基中 62BA、NAA和 KT组合对
下胚轴诱导愈伤组织和分化不定芽的影响
62BA NAA KT
(mg·L - 1 )
愈伤组织
诱导率 /%
分化数
/个
不定芽分
化率 /%
平均不定
芽数 /个
0. 0 0. 1 0. 2 17. 5 0 0. 0 0. 0
0. 5 0. 1 0. 2 47. 5 8 20. 0 2. 93
1. 0 0. 1 0. 2 80. 0 19 47. 5 2. 49
1. 5 0. 1 0. 2 85. 0 21 52. 5 3. 71
2. 0 0. 1 0. 2 92. 5 29 72. 5 5. 94
3. 0 0. 1 0. 2 87. 5 27 67. 5 4. 16
1. 0 0. 3 0. 2 82. 5 17 42. 5 1. 37
1. 5 0. 3 0. 2 82. 5 18 45. 0 2. 96
2. 0 0. 3 0. 2 85. 0 27 67. 5 5. 13
3. 0 0. 3 0. 2 90. 0 14 35. 0 3. 26
  注 :各处理的外植体数均为 40个。
2. 2 再生植株的增殖
将获得的不定芽转入不同增殖培养基中进行丛
生苗诱导。从表 4看出 :当 62BA和 IBA分别为 1. 0、
0. 3 mg·L - 1时 ,平均增殖培数最高 ,达 4. 82倍 ,即
最佳增殖培养基为 MS + 62BA 1. 0 mg·L - 1 + IBA
0. 3 mg·L - 1。
表 4 M S培养基中 62BA和 IBA配比对增殖培数的影响
IBA /
(mg·L - 1 )
62BA / (mg·L - 1 )
1. 0 1. 5 2. 0
0. 1 1. 51 2. 98 1. 64
0. 3 4. 82 2. 89 2. 49
0. 5 3. 74 3. 50 2. 88
1. 0 2. 76 2. 31 1. 56
  注 :表中数据为增值培数。
2. 3 不定芽的伸长、生根及移植
再生不定芽接种到不添加植物生长调节剂的
MS培养基中伸长培养 , 4周后可伸长至 2. 5 cm (图
版Ⅰ, G) ,这些芽有的先形成羽状复叶 ,有的直接形
成叶状柄 ,还有的叶状柄上长出复叶。将伸长后的
芽接种到 MS + IAA 0. 1 mg·L - 1 + NAA 0. 2 mg·
L - 1培养基上 , 35~40 d后每株苗长出 3~4条粗细
均匀的根 ,生根率达 85%。待根长至 3 cm左右时 ,
炼苗 2 d,之后将苗取出 ,洗去根上的培养基 ,移植到
经过消毒的混合基质 (园土 ∶泥炭土 = 1∶1)中 ,每周
浇 3次水 , 2周后长出新叶表明移植成活 ,成活率达
90%以上。
3 结论与讨论
本研究利用大叶相思下胚轴为外植体 ,通过愈伤
组织诱导途径建立了高效再生体系。最佳愈伤组织
诱导培养基为 MS + 2, 42D1. 0 mg·L - 1或 1. 5 mg·
L - 1 + KT 0. 5 mg·L - 1 ,下胚轴愈伤组织诱导率达
100% ,如果继续在该培养基上培养 ,则不能形成不定
芽 ,其原因可能是 2, 4 - D对不定芽的分化具有抑制
作用 ,黄莺等 [ 10 ]在石竹组织培养研究中也有相类似
报道。将愈伤组织转移到再分化培养基 MS + 62BA
1. 5 mg·L - 1 + NAA 0. 2 mg·L - 1上 ,再分化率达
84. 7%。下胚轴切段在 MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 +
NAA 0. 1 mg·L - 1 + KT 0. 2 mg·L - 1上培养 ,下胚轴
可先形成愈伤组织 ,不需转换培养基就可以再分化不
定芽 ,愈伤组织诱导率和分化率分别达 92. 5%和
72. 5%。不定芽较适生根培养基为 MS + IAA 0. 1 mg
·L - 1 +NAA 0. 2 mg·L - 1 ,生根率达 85%以上。
在不定芽分化研究中发现 ,分化培养基中的植
物生长调节剂浓度较高时 ,不利于分化芽形成后的
生长 ,若不及时继代转瓶 ,容易产生畸形苗 ,如过细、
茎节分化不明显、植株玻璃化、长势弱等。因此 ,要
及时将分化芽转移到植物生长调节剂浓度较低的增
殖或伸长培养基中。
大叶相思原产于热带或亚热带地区 ,为热带造
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林  业  科  学  研  究 第 21卷
林与观赏树种 ,耐寒性差 ,这极大地限制了这一优良
树种在中国大面积推广和应用。本研究结果为利用
基因工程技术改良大叶相思的品质奠定了基础。
图版 Ⅰ A:在含有 2, 42D的培养基中下胚轴伤口处诱导出愈伤组织 ; B 和 C: 切下的愈伤组织块再分化出不定芽 ;
D、E和 F: 在 MS + 62BA 2. 0 mg·L - 1 +NAA 1. 0 mg·L - 1 + KT 0. 2 mg·L - 1培养基中 1次培养时下胚轴伤口处
诱导愈伤组织和不定芽 ; G:不定芽伸长 ; H: 不定芽生根。
参考文献 :
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