全 文 ：　　1996—12—30收稿。
李横虹(研究生) ,邱并生, 史春霖 (中国科学院微生物研究所　北京　100080) ;金开璇(中国林业科学研究院森林保护
研究所) ;周琦,黄习军(中华人民共和国首都机场动植物检疫局)。
* 1996～1998年国家自然科学基金资助项目。本研究得到首都机场动植物检疫局陶玲珠,张炜,张建英,杨洁磊同志,
中以示范农场吴玉红同志的帮助,特此致谢。
樱桃带化病组织中植物菌原体 16 S rDNA PCR
扩增及其产物 RFLP 分析*
李横虹　邱并生　史春霖　金开璇　周　琦　黄习军
　　摘要　樱桃带化病是从以色列引种樱桃园中发现的新病害。本文报道了按照检测植物菌原体
( phyt oplasma )的方法提取 DNA, 扩增患病植株中植物菌原体的 16 S rDNA 片段,证明樱桃带化病
中有植物菌原体存在, 并对此扩增片段进行限制性酶切片段长度多态性( RFLP )分析。根据 RFLP
分析结果, 参照 Lee, I. M . 等的文献资料,对本次樱桃带化病病原进行鉴定与分类,初步定为Ⅶ类。
　　关键词　樱桃带化病　植物菌原体　巢式 PCR　RFLP
图 1　樱桃带化病植株
　　樱桃带化病发生在北京市中以示范农
场。1995年春,该场从以色列引进 1 年生经
嫁接的欧洲甜樱桃( P runus av ium L. )系统
的 6个品系苗木 3 500余株, 当年夏、秋调查
发现有的樱桃苗在生长期苗木罹带化病, 其
病状(见图 1)为新梢顶端变扁呈弯曲状, 尖
端卷曲或扭曲生长, 有的形成齐头铲状, 宽
度可达 4～5 cm ,在带化枝顶部着生簇状小
枝和小叶 [ 1] , 此病影响苗木正常生长及樱桃
结实。据 1995～1996年三次调查,樱桃带化
病株率约为 3% ,其分布特点是在一株发病
苗的周围常有几株樱桃同时感病。樱桃带化
病有进一步发展的趋势。国内外尚未见到樱
桃带化及其病原研究的报道。
1　材料和方法
1. 1　植物材料
用于鉴定的樱桃带化病株和健康对照材料采自北京市中以示范农场樱桃园。
1. 2　DNA提取
参照 Harrison N . A. 等[ 2]所介绍的 CT AB, 巯基乙醇提取法取韧皮部或叶脉组织, 提取
林业科学研究　1997, 10( 5) : 478～481
Forest Research 　 　　
DNA , - 20℃冰冻保存。具体方法如下:配制提取液:称取2. 05 g NaCl, 0. 05 g 巯基乙醇, 0. 5
g CTAB,溶于 20 mL 蒸馏水中, 加入 1 mL 0. 5 mol/ L EDT A( pH8. 0) , 2. 5 mL l mol / L T ris
Cl( pH8. 0) ,定容至 25 mL。取韧皮部,叶脉组织0. 3 g ,加入 0. 9 mL 提取液,研磨。于 60℃水
浴 30 min, 5 000 rpm 离心 5 min,取上清液,沉淀弃去。用氯仿异丙醇( 24∶1)抽提一次, 10 000
rpm 离心90 s,取上层水相。以 2/ 3体积异丙醇于- 20℃沉淀 30 min, 10 000 rpm 离心 5 min,
用 1 mL 70%乙醇清洗沉淀物,干燥后溶于 100
L TE, 使用 Shimadzu UV 2201型紫外分光
光度计测OD 260吸收值,确定 DNA 含量。
1. 3　PCR反应条件及所用引物对
参照 Lee, I. M . 等1) , 根据植物菌原体 16 S rDNA 序列设计的引物对, 选择 R16mF2/
R16mR1 作为第一引物对, R16F2/ R16R2作为第二引物对, 进行巢式 PCR( nested-PCR)扩
增。
引物对序列如下:
R16mF2= 5’-CAT GCAAGTCGAACGGA-3’　　R16F2= 5’-ACGACTGCT AAGACT GG-3’
R16mR1= 5’-CT TAACCCCAAT CAT CGAC-3’ R16R2= 5’-GCGGTGTGTACAAACCCCG-3’
PCR反应条件: 50
L PCR 反应体系中加入引物对 500 nmo l/ L , dNTP 100 mol/ L , DNA
提取液 20 ng(巢式 PCR时取第一引物对扩增产物 1
L) , 5
L 10×PCR 缓冲液(上海生工) ,
Taq DNA 聚合酶 1. 25U (上海生工)。变性温度 94 ℃, 复性温度 56 ℃,延伸温度 72 ℃,共 30
次循环。前 5个循环变性 1 m in,复性 1 min,延伸 2 m in; 后25个循环变性 30 s,复性1 min,延
伸 2 m in,最后72℃延伸 10 min。PCR 产物 1%琼脂糖( 0. 5
g / mL EB)电泳, 1×TAE 缓冲系
统,每孔加样 5
L,于紫外灯下观察并摄影记录。
1. 4　玻璃粉法纯化 PCR产物及克隆
使用发玛西亚 DNA 纯化试剂盒( Pharmacia Sephaglas Kit )从琼脂糖凝胶上回收扩增片
段, 与 PCR2. 1 T Vecto r( Invit rog en)进行连接反应,转化到大肠杆菌( Escherichia coli ) TG1
中。用单菌落电泳法筛选出含重组质粒的克隆。同时从筛选出的克隆做菌落直接 PCR,扩增产
物的大小如果与巢式 PCR产物一致,则证明存在目的片段( 16 S rDN A片段)。然后通过碱裂
解法制备质粒, - 20 ℃冰冻保存。
1. 5　限制性酶切片段长度多态性(RFLP)分析
以提取的质粒为模板, 进行 PCR扩增, PCR反应条件如前所述, 50
L 反应体系中加入模
板 10 ng ,引物对选用 R16F2/ R16R2。使用 Promega WizardTM PCR preps DNA purif ication
sy stem 快速纯化扩增所得产物,然后进行酶切反应, 37 ℃水浴 24 h使充分酶解。所选用的酶
有: AluⅠ, HinfⅠ, HhaⅠ, HpaⅡ, RsaⅠ, Sau 3A, T ru 91。酶切产物进行 5%聚丙烯酰胺电泳
( PAGE) ,使用 1×T BE 配制的 0. 5
g/ mL EB室温染色 40 m in,紫外灯观察并摄影记录。
2　结果与分析
2. 1　PCR结果
1) Lee I M . A new out look in detect ion, iden tif icat ion and clas sif icat ion of phytoplasmas.见:中国林科院编.第五届国际
植物菌原体研讨会论文摘要集.北京, 1996.
4795 期　　　李横虹等: 樱桃带化病组织中植物菌原体 16 S rDNA PCR扩增及其产物 RFLP 分析
　　以图2中左侧的分子量标记为对照可见,扩增片段大小约1. 2 kb,健康对照没有出现特异
扩增带,说明病株中有植物菌原体( Phy toplasma)存在。
　图 2　樱桃带化病巢式 PCR 产物
1%琼脂糖
( 0. 5
g/ mL EB)电泳
(从左至右依次为: 1. SPP1分子量
标记, 2.樱桃带化巢式 PCR产物, 3.樱
桃健康样品巢式 PCR产物, S PP1分子
量标记的片段 bp数大小从上到下依次
为: 8 000, 7 100, 6 000, 4 800, 3 500, 2
700, 1 900, 1 850, 1 500, 1 400, 1 150, 1
000, 680, 490, 370)
图 3　樱桃带化 PCR扩增产物 RFLP 分析, 5%聚丙烯
酰胺电泳
(右侧分子量标记从上到下各片段 bp数大小依次
为: 2 642, 1 500, 1 400, 1 300, 1 200, 1 100, 1 000, 900,
800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100)
2. 2　RFLP分析结果
将樱桃带化病病组织 PCR扩增产物 RFLP 图谱(图 3)与 Lee, I. M .等 [ 3]文献中所列的酶
切图谱进行比较。对照分子量标记, 读出每个酶切片段的大小( bp 数) ,列于下表进行比较。
Lee, I. M .文献中以Ash, Y.的酶切图谱与本文所测得的酶切谱型最为近似。因而此处列 Ash,
Y.的酶切图谱作比较。
表 1　樱桃带化病病组织 PCR扩增产物的限制性内切酶酶切图谱
与 Lee, I.M. 等[3]文献中所列分类型别及图谱比较
限制性
内切酶
本次樱桃带化 Ash, Y.

( Lee, I. M .等)
酶切片段数 片段大小
( bp)
酶切片段数 片段大小
(b p)
限制性
内切酶
本次樱桃带化 Ash, Y.

( Lee, I.M .等)
酶切片段数 片段大小
( bp)
酶切片段数 片段大小
( b p)
AluⅠ 4
700
240
140
80
4
700
240
140
80
HinfⅠ 2 770
380
2
770
400
HhaⅠ 2 1150
90
2
1050
170
HpaⅡ 3
700
350
90
2
750
350
RsaⅠ 2 690
480
2
690
480
Sau 3A 3
770
260
180
3
770
270
190
Tru 91 4
380
260
260
150
4
380
260
260
140
　　
国际上现将 Ash, Y. ( Ash Yellow s)分为Ⅶ-A 类。
480 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　　10 卷
　　根据上述结果可知,本次樱桃带化的酶切谱型与Ⅶ-A 类 Ash, Y.基本类似。证实了扩增
所得片段为植物菌原体16 S rDNA。有的酶切片段大小有微小差异, 如HhaⅠ, HpaⅡ等,这可
能是因亚型之间所存在的碱基变化而导致。PCR结果显示樱桃带化样品确实感染植物菌原
体,根据 RFLP 分析,初步分类定于Ⅶ类。这为控制樱桃带化病的进一步蔓延和防治提供了理
论依据。
参　考　文　献
　　1　 Jin Kaix uan , Wang Yue. MLO and BLO ass ociated w ith fasciated tr ee d iseases in C hina. Int . J. Tropical Plant Dis-
eas es , 1992, 10: 209～213.
　　2　Harrison N A, Rich ards on P A , Tsai J H, et al. PCR as say for detection of the phytoplasma associated with maiz e
bushy stunt diseas e. Plant Diseas e, 1996, ( 3) : 263～269.
　　3　Lee I M , Hamm ond R W, Daw is R E, et al . Universal amplif icat ion and analysis of p athogen 16 S rDNA for classif ica-
t ion and iden tif icat ion of mycoplasmalike organisms. phytopath ology, 1993, 83( 8) : 834～842.
PCR Amplif ication of 16 S rDNA of Phytoplasma Associated with
Cherry Fasciated Disease and RFLP Analysis
L i H enghong　Qiu Bingsheng　S hi Chunl in
J in K aixuan　Zhou Qi　H uang X ij un
　　Abstract　Cher ry fasciated disease is a disease w hich was found in the cher ry sapling
imported f rom Isr ael. DNA amplif icat ion by PCR was used to detect the phytoplasma associ-
ated with cherry fasciated disease. T he 16 S rDNA sequence amplified w as analy zed by r e-
st rict ion endonuclease digestion. T he RFLP pat tern( sum of resul ts analyzed by 7 rest riction
enzymes) was compared w ith the r esults of o ther phy toplasma pr eviously described by Lee, I.
M . et al. We propose that cherry fasciated disease should belong to Group Ⅶ.
　　Key words　cherry fasciated disease　phy toplasma　nested-PCR　RFLP
　　Li Hengh ong, Qiu Bin gsheng, Shi Chun lin ( In st itute of M icrobiology, Chinese Academy of S cien ce　Beijing　100080) ;
Jin Kaixuan ( Th e Research Ins ti tu te of Forest Protect ion , CA F) ; Zhou Qi, Huang Xijun ( Capital Airport An imal & Plant
Quaran tin e Bureau, PRC ) .
4815 期　　　李横虹等: 樱桃带化病组织中植物菌原体 16 S rDNA PCR扩增及其产物 RFLP 分析