全 文 ：第 51 卷 第 6 期
2 0 1 5 年 6 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 6
Jun．，2 0 1 5
doi: 10．11707 / j．1001-7488．20150608
收稿日期:2014 － 08 － 04; ; 修回日期:2014 － 09 － 24。
基金项目:国家林业局 948 项目“小分子 ＲNA 分离技术引进”(2011-4-55) ; 国际竹藤中心基本科研业务费专项资金项目“毛竹快速生长
期特异转录调控网络的构建及其应用”(1632015008)。
* 高志民为通讯作者。
毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 的克隆
及其逆境胁迫响应表达分析*
王丽丽 赵韩生 孙化雨 董丽莉 娄永峰 高志民
(国际竹藤中心 竹藤科学与技术重点开放实验室 北京 100102)
摘 要: 【目的】miＲNA 作为一种非编码基因在植物生长发育以及抗逆等过程中起着重要的调控作用。通过
分析毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 前体序列的结构特点，研究其组织表达特异性，分析其经光照、温度、干旱、NaCl 等
非生物胁迫以及激素处理后的表达变化，以期为进一步揭示其功能以及未来竹子抗逆育种的分子设计提供参
考。【方法】通过茎环引物法和 ＲT-PCＲ 技术，以毛竹为材料分离 miＲ397 和 miＲ1432 的前体序列，利用在线平
台 Web LOGO 分析 miＲNA 成熟序列的碱基保守性，用 MEGA 6. 0 软件构建基于 miＲNA 前体的系统进化树。借
助在线平台 ＲNAfold WebServer 预测二者前体二级结构。直接从 BambooGDB 下载 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 前
体上游的 1 500 bp 序列，利用在线平台 Plant CAＲE 分析其所含作用元件。采用实时定量 PCＲ 方法分析 phe-
miＲ397 和 phe-miＲ1432 在毛竹根、茎、叶和鞘中的表达情况，以及检测经黑暗、强光 (1 500 μmol·m － 2 s － 1 )、高温
(42 ℃ )、低温(4 ℃ )、NaCl(250 mmol·L － 1 )、GA3 溶液(100 μmol·L
－ 1 )、ABA 溶液(100 μmol·L － 1 )处理 2 h 后毛
竹叶片中 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表达变化。【结果】从毛竹中分别克隆出 miＲ397 和 miＲ1432 的前体序
列，均为 88 bp，且分别包含其成熟序列，均为 21 bp。前体序列均能形成稳定的茎环结构，且成熟序列均产生于
前体茎环结构 5端臂上。miＲ1432 家族成熟序列的碱基保守性整体高于 miＲ397 家族。毛竹二者前体上游调控
区均含有启动子基本作用元件，如 TATA-box，CAAT-box; 同时存在很多逆境(光、干旱、温度等)胁迫相关响应元
件以及激素响应元件等，意味着 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 可能受到逆境胁迫和激素的调节。 phe-miＲ397 和
phe-miＲ1432 均在叶鞘中表达丰度最高，最低丰度 phe-miＲ397 出现在幼茎中，而 phe-miＲ1432 则在叶片中。经强
光、黑暗、高温、低温、NaCl 等胁迫处理后，叶片中 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表达均下调; 干旱和 ABA 处理
后，phe-miＲ397 的表达下调，而 phe-miＲ1432 则上调; GA3 处理后，phe-miＲ397 的表达上调，phe-miＲ1432 则下调。
【结论】phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 作为毛竹中 2 个保守型 miＲNA，在受光照、温度、干旱和 NaCl 的胁迫以及
ABA 和 GA3 的处理时，其表达均呈现了不同程度的下调或上调，这暗示着它们可能在毛竹应对非生物胁迫的抗
逆过程中起重要的调控作用，且与内源激素的调节相关联。
关键词: 毛竹; miＲNA; 非生物胁迫; 激素
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2015)06 － 0063 － 08
Cloning and Expression Analysis of miＲ397 and miＲ1432 in
Phyllostachys edulis under Stresses
Wang Lili Zhao Hansheng Sun Huayu Dong Lili Lou Yongfeng Gao Zhimin
(Key Laboratory on the Science and Technology of Bamboo and Ｒattan，International Center for Bamboo and Ｒattan Beijing 100102)
Abstract: 【Objective】Stress is one of the main factors affecting growth，development and formation of biological
production and quality of plant． As non-coding genes，miＲNAs play important roles in regulating plant growth and the
processes of stress resistance． To reveal the function of miＲ397 and miＲ1432 in bamboo and provide a basis for molecular
design of bamboo resilience breeding in future，the structural features of miＲ397 and miＲ1432 precursor sequences from
Phyllostachys edulis were analyzed，the tissue-specific expression analysis as well as the expression changes of miＲ397 and
miＲ1432 under abiotic stresses of drought，temperature，light，NaCl and hormone treatment were carried out．【Method】
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The precursor sequences of miＲ397 and miＲ1432 of P． edulis were isolated using stem-loop primer method and ＲT-PCＲ
technology，online platform Web LOGO was used for the conservation analysis of mature miＲNA． MEGA 6. 0 software was
used for the construction of phylogenetic tree with miＲNA precursor sequences． The secondary structure of the two
precursors was predicted with the online platform ＲNAfold WebServer． The sequences of 1500 bp upstream of the
precursor of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 were direct-downloaded respectively from BambooGDB and acting elements
analysis was performed using online platform Plant CAＲE． Ｒeal-time quantitative PCＲ method was used for the tissue-
specific expression analysis of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 in bamboo roots，stems， leaves and sheaths，and the
expression changes in bamboo leaf after 2 h treatments of darkness，high light intensity (1 500 μmol·m － 2 s － 1 )，high
temperature (42 ℃ )，low temperature ( 4 ℃ )，NaCl ( 250 mmol·L － 1 )，GA3 solution ( 100 μmol·L
－ 1 ) and ABA
solution (100 μmol·L － 1 ) respectively．【Ｒesult】The isolated precursor sequences of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 were
all 88 bp，containing 21 bp mature sequences correspondingly． The precursors of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 could fold
into stable stem-loop structure，and the mature sequences were generated at 5 end of the arm in the stem-loop structure
respectively． Overall，the nucleotide conservative in mature sequence of miＲ1432 family was higher than that of miＲ397
family． Both are containing the essential elements of promoter，such as TATA-box and CAAT-box，in the regulatory region
of the upstream precursors of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432． At the same time，many stress ( light，drought，temperature，
etc． ) related response elements and hormone-responsive elements were found，indicating phe-miＲ397 and phe-miＲ1432
may be regulated by stress and hormone． Both phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 expressed in leaf sheath with the highest
level，while the lowest in young stem for phe-miＲ397 and in leaf for phe-miＲ1432． The expression of phe-miＲ397 and
phe-miＲ1432 in leaf were all down-regulated after 2 h with the treatments of high light intensity，darkness，42 ℃，4 ℃
and NaCl． The expression of phe-miＲ397 was down-regulated under drought treatment as well as ABA，while that of phe-
miＲ1432 was up-regulated． The expression of phe-miＲ397 was up-regulated and phe-miＲ1432 was down-regulated for GA3
treatment．【Conclusion】As two conservative miＲNAs in bamboo，the expression of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 were
either up-or down-regulated under the stress treatments of light，temperature，drought and NaCl，as well as ABA and GA3
treatments，indicating that they might play important regulatory roles in respond to abiotic stress resilience in bamboo，
which were also associated with the regulation of endogenous hormones．
Key words: Phyllostachys edulis; miＲNA; abiotic stress; hormones
MicroＲNA(miＲNA)是一类长度为 21 ～ 30 nt 的
非编码小分子 ＲNA ( de Lima et al．，2012)，miＲNA
的转录和加工是在细胞核中进行的，而其最终发挥
功能的场所在细胞质中。已知 miＲNA 发挥作用的
机制包括降解靶 mＲNA(Kurihara et al．，2004)、抑制
靶 mＲNA 的翻译(Qi et al．，2005)以及对基因座位
上的 DNA 进行甲基化修饰(Bao et al．，2004)，在植
物中主要通过切割靶基因导致靶基因沉默的方式参
与生长发育过程。研究表明，miＲNA 在植物生长发
育、细胞周期调控以及植物抗逆性等方面起着非常
重要的作用(Lee et al．，2001)，其中许多 miＲNA 参
与了植物非生物逆境的应答调节，如在低温(4 ℃ )、
高温(38 ℃ )胁迫条件下，旱芹(Apium graveolens)中
miＲ160，miＲ164，miＲ394，miＲ395 和 miＲ408 的表达
均上调(Li et al．，2014); 在高温(42 ℃ )、NaCl(250
mmol·L － 1 )、干旱 (20% PEG 和 300 mmol·L － 1甘露
醇)等胁迫条件下，芥菜(Brassica juncea)miＲ395_2
的表达上调，miＲ390_1 和 miＲ172_2 的表达均下调
(Bhardwaj et al．，2014 ); 葡萄 ( Vitis vinifera ) 的
Vvi-miＲ159b， Vvi-miＲ160f， Vvi-miＲ171e， Vvi-
miＲ171f，Vvi-miＲ171h，Vvi-miＲ393a 和 Vvi-miＲ393b
受外施 GA3 的诱导表达 ( Han et al．，2014a); 在
ABA 和盐胁迫条件下，欧洲山杨 ( Populus tremula)
miＲ398 呈现动态调节，在 3 ～ 4 h 内其表达受到诱
导，在 48 h 后开始下降，至 72 h 又开始积累，而盐胁
迫条件下拟南芥( Arabidopsis thaliana)中 miＲ398 的
表达稳定，并且在 ABA 胁迫条件下呈现与欧洲山杨
中相反的情况( Jia et al．，2009)。随着全球环境的
变化，干旱、高温、低温、盐碱等非生物胁迫已经成为
影响植物正常生长的关键因素，开展植物抗逆研究
对于培育植物抗逆新品种具有重要的价值。
竹子是重要的森林植物资源，在应对全球环境
的恶化、森林资源匮乏、能源危机等方面发挥着重要
作用。竹子在长期的进化过程中形成了对各种非生
物胁迫的保护与适应机制，具有较强的可塑性。对
竹子抗逆生理的研究主要集中于活性氧代谢、膜脂
过氧化、抗氧化酶系统、渗透调节系统和光合生理等
方面(刘玉芳等，2014)，随着认识的不断深入，单纯
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第 6 期 王丽丽等: 毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 的克隆及其逆境胁迫响应表达分析
从生理角度来认知竹子的抗逆机制存在着局限性，
人们开始从分子水平来进行相关研究。目前已分离
了甘油醛 － 3 －磷酸脱氢酶基因(杨洋等，2010)、液
泡膜 Na + /H + 逆向运输蛋白基因 ( 张智俊等，
2011)、BoBZF(高志民等，2012)、PheWＲKY1(Cui et
al．，2013)等许多抗逆相关基因，但多仅限于基因的
克隆分析或功能的初步研究。关于竹类植物
miＲNA 的研究也日趋受到重视，通过高通量测序技
术与生 物信息 学技术相结合的方 法，从 麻 竹
(Dendrocalamus latiflorus)叶片中获得了 84 个保守
的 miＲNA 和 81 个新 miＲNA，并对其中 30 个新
miＲNA 研究证明它们的表达受光照的诱导或抑制
( Zhao et al．，2013)。对毛竹(Phyllostachys edulis)和
麻竹叶片中的 miＲNA 比较分析并通过试验验证表
明，miＲ397，miＲ1432 和 miＲ7748 只存在于毛竹叶
片中(Zhao et al．，2014)。为研究 miＲNA 在竹子非
生物胁迫中的表达调控作用，本研究以毛竹为对象，
分离 miＲ397 和 miＲ1432 的成熟序列、前体序列，在
对前体上游启动子序列所包含的逆境应答元件分析
的基础上，研究了温度、光照、干旱、激素等非生物胁
迫对毛竹叶片中 miＲ397 和 miＲ1432 表达的影响，
以期为进一步研究其功能以及未来竹子抗逆品种的
分子设计提供参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
毛竹半年生实生苗，盆栽于本实验室的培养室
内，栽培基质为腐殖质土和蛭石(7 ∶ 3)，培养温度为
25 ℃，光照 200 μmol·m － 2 s － 1，光 /暗为16 h /8 h。
1. 2 基因组 DNA 提取、总 ＲNA 提取与 cDNA
合成
分别取毛竹的根、幼茎、顶端第 3 片叶的叶片及
叶鞘以及不同处理后的毛竹叶片(顶端第 3 片叶)，
迅速放入液氮中研磨成粉末状，采用改良的 CTAB
法 (高志民等，2006 )提取基因组 DNA，Trizol 法
(Gao et al．，2006)提取总 ＲNA。按照反转录试剂盒
说明书(Promega 公司)合成 cDNA。
1. 3 miＲNA 克隆与测序
分别根据毛竹 miＲ397 及 miＲ1432 成熟序列及
前体 序 列 ( PH01000093 /PH01011011 ) ( http: ∥
www． bamboogdb． org /)设计反转录颈环引物 ( Chen
et al．，2005)、正向引物( forward primer)和反向通用
引物(universal reverse primer)，其中茎环部分通用
序 列 为: 5-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA
TTCAGTTGAG-3(表 1)，由上海生物工程技术服务
有限公司合成。PCＲ 反应体系为:10 × PCＲ Buffer
2 μL，dNTP ( 2. 5 mmol·L － 1 ) 2 μL，正 向 引 物
(10 μmol·L － 1 ) 1 μL，反向引物 ( 10 μmol·L － 1 )
1 μL，DMSO 1 μL，cDNA 0. 5 μL，高 保 真 酶
(Pyrobest) 0. 1 μL (5 U·μL － 1)，加水补足至 20 μL。
反应条件: 94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 35
个循环。
回收 PCＲ 产物，进行加 A 反应，反应体系10 μL:
10 × PCＲ Buffer 1 μL，dATP(2. 5 mmol·L － 1 )1 μL，
PCＲ 产物 7. 9 μL，LA Taq 酶 0. 1 μL。反应程序:
72 ℃ 30 min。反应结束后连接到 pGEM-T easy 载
体上，转化大肠杆菌(Esherichia coli) DH 5α 感受态
细胞，阳性克隆经酶切检测分析后，送生物工程技术
服务有限公司测序。
1. 4 生物信息学分析
利用公共数据库 miＲBase 21 ( http: ∥ www．
mirbase． org / index． shtml)和 Bamboo GDB 下载水稻
( Oryza sativa )、二 穗 短 柄 草 ( Brachypodium
distachyon)、玉 米 ( Zea mays )、大 麦 ( Hordeum
vulgare)、毛竹等禾本科植物的 miＲ397 和 miＲ1432
的成熟序列及前体序列，利用在线平台 WebLOGO
( http: ∥ weblogo． berkeley． edu / logo． cgi ) 分 析
miＲNA 成熟序列的碱基保守性，用 MEGA 6. 0 软件
构建基于 miＲNA 前体的系统进化树。利用在线工
具 ＲNAfold WebServer(http: ∥rna． tbi． univie． ac． at /
cgi-bin /ＲNAfold． cgi)预测 miＲNA 的前体二级结构。
下载毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 前体上游的 1 500 bp
序列，利用在线平台 Plant CAＲE 分析其所含作用元
件( http: ∥ bioinformatics． psb． ugent． be /Webtools /
plantcare / html /)。
1. 5 胁迫处理
选取长势一致的毛竹，分别进行处理。光照处理:
将毛竹苗分别在黑暗处理 24 h、1 500 μmol·m －2 s － 1
光照处理 2 h; 温度处理:42 ℃ 处理 2 h、4 ℃处理2 h;
同时以实验室条件下生长的毛竹为对照。选取毛竹顶
端第 3 片离体叶片，干旱处理:将叶片放入开口的空培
养瓶中 2 h，同样以浸入蒸馏水中 2 h的叶片为对照(王
京京等，2012); NaCl 处理:浸于 NaCl 溶液(250 mmol·
L － 1)中 2 h，蒸馏水处理作为对照;激素处理:将叶片分
别浸入 GA3 溶液 (100 μmol·L
－ 1 )、ABA 溶液 (100
μmol·L － 1)中 2 h，分别以浸入甲醇、乙醇中 2 h 的叶片
为对照(Kayal et al．，2006)。处理后分别取第 3片叶片
存 －80 ℃备用。
1. 6 实时荧光定量 ＲT-PCＲ
分别用毛竹根、茎、叶和鞘不同组织以及不同胁
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林 业 科 学 51 卷
迫处理后的样品 ＲNA 和颈环反转录引物合成
miＲNA 特异性 cDNA，作为模板，进行 qＲT-PCＲ，并
用 U6 snＲNA 为内参 ( Ding et al．，2011 )。选用
Ｒoche 公司的 LightCycle 480 SYBＲ Green I Master 试
剂盒，PCＲ 反应体系为:Mix 5 μL，cDNA 0. 4 μL，正
向引物 0. 2 μL，反向通用引物 0. 2 μL，加水补足至
10 μL。反应程序为:95 ℃，10 min; 95 ℃ 10 s; 62
℃10 s，共 50 个循环。反应在 Analytikjena 公司的
q-Tower 仪上进行，重复 3 次，反应结束后应用
2 － △△ C t算法进行分析(Livak et al．，2001)。
表 1 miＲNAs 的 qＲT-PCＲ 引物
Tab． 1 List of qＲT-PCＲ primer sequences used for miＲNAs
名称
Name
引物
Primer
序列
Sequence(5→3)
miＲ397
ＲT primer CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCATCAACG
Forward primer ACGGGCGATCATTGAGTGCAG
miＲ1432
ＲT primer CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGTCGGTG
Forward primer ACGGGCGATTCAGGAGAGATG
Universal reverse primer CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC
U6
Forward primer GGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAG
Ｒeverse primer AATTTGGACCATTTCTCGATTTATGCGTGT
2 结果与分析
2. 1 miＲNA 克隆与结构预测
分别用毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 前体及成熟序
列特异性引物进行 PCＲ 扩增，产物经 1%琼脂糖凝
胶电泳检测，结果显示二者前体特异引物扩增产物
均在 450 bp 左右有 1 条亮带，与预测的包含毛竹
miＲ397 和 miＲ1432 的前体序列的目的片段大小一
致; 成熟序列特异引物扩增产物均在 70 bp 左右有
1 条亮带，与预测的 miＲ397 及 miＲ1432 茎环法反转
录扩增序列大小一致。测序结果表明，前体序列特
异性引物扩增产物分别为 443 bp 和 439 bp，分别包
含 miＲ397 和 miＲ1432 前体序列，均为 88 bp; 成熟
序列特异性茎环引物扩增产物分别为 65 bp 和 66
bp，且分别包含其成熟 miＲNA 序列，均为 21 bp。
通过对前体序列二级结构的预测发现，毛竹
miＲ397 和 miＲ1432 的前体序列均能形成稳定的茎
环结构，且成熟序列均产生于前体茎环结构 5端臂
上(图 1 )，它们与其他单子叶植物 miＲ397 和
miＲ1432 的前体有着类似的结构，其前体分别命名
为 phe-MIＲ397 和 phe-MIＲ1432，成熟 miＲNA 分别命
名为 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432。
2. 2 miＲNA 序列分析
对单子叶植物 miＲ397 和 miＲ1432 成熟序列碱
基保守性分析结果表明，2 个 miＲNA 家族均具有较
高的保守性，但 miＲ1432 家族的碱基保守性整体高
于 miＲ397 家族。miＲ397 家族主要在第 6，8，10，
11，12，13，19 及 21 位上的碱基保守性较强些，phe-
miＲ397 的 成 熟 序 列 ( 5-UCAUUGAGUGCAGCG
UUGAUG-3)与其他单子叶植物 miＲ397 家族成员
大部分序列保持一致(图 2); 而来自单子叶植物的
miＲ1432 家族成员只有 6 个，其碱基保守性整体较
高，尤其在第 3，4，5，6，7，11，15 和 19 位的碱基在
不同家族成员间都是相同的，而 phe-miＲ1432 的成
熟序列 (5 -UUCAGGAAGUAGCUCGUAGGA-3)也
在第 4，5，6，7，11，15 和 19 位表现出较高的碱基
保守性(图 1)。由此表明，miＲ397 和 miＲ1432 两
个家族成员在单子叶植物的进化过程中是比较保
守的。
构建基于前体序列系统进化树的结果表明，来
自单子叶植物和双子叶植物的 MIＲ397 家族不同成
员大多数分别聚类到 2 个大的分支，与植物进化的
保守性相一致，当然也有例外，如来自葡萄的
vvi-MIＲ397a和欧丹参 ( Salvia sclarea) 的 ssl-MIＲ397
聚类到双子叶植物大分支之外的一个小分支，更有
来自双子叶植物毛果杨 ( Populus trichocarpa ) 的
ptc-MIＲ397c和单子叶植物玉米的 zma-MIＲ397a 聚
类在另一个与 2 大分支较远的一个小分支 (图 3
A); 另外，来自单子叶植物同一物种的 MIＲ397 家
族不同成员被聚类到不同的分支，表明植物 miＲNA
前体序列具有比较丰富的多样性。
目前在 miＲBase 21 中的 miＲ1432 的前体序列
仅有 6 条，且差异较大，聚类分支比较分散，毛竹
的 phe-MIＲ1432 虽与水稻的 osa-MIＲ1432 聚类到
相对 较 近 的 分 支，但 总 体 而 言 进 化 关 系 较 远
(图 3B)。
66
第 6 期 王丽丽等: 毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 的克隆及其逆境胁迫响应表达分析
图 1 前体二级结构预测
Fig． 1 Secondary structure prediction of precursor
图 2 miＲ397 和 miＲ1432 成熟序列碱基保守性分析
Fig． 2 Conserved nucleotide sequence
analysis of miＲ397 and miＲ1432
对毛竹 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 前体上游调
控区作用元件分析结果表明，二者均含有启动子基
本作用元件，如 TATA-box，CAAT-box; 同时存在很
多逆境(光、干旱、温度等)胁迫相关响应元件，另外
还包括一些其他调节元件，如激素响应元件等 (表
2)。这意味着 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 可能受
到一些逆境胁迫的调节，其表达将会因逆境胁迫而
上调或者下调。
2. 3 miＲNA 组织特异性表达分析
实时定量 PCＲ 结果表明: phe-miＲ397 和 phe-
miＲ1432 在毛竹根、茎、叶和鞘中都有表达，但是表
达丰度存在一定的差异，在茎、叶和鞘中 phe-miＲ397
和 phe-miＲ1432 的表达量与根中的相比，差异均达
到极显著水平(P ＜ 0. 01);虽然 phe-miＲ397 和 phe-
miＲ1432 均在叶鞘中表达丰度最高，但表达丰度最
低的部位，phe-miＲ397 出现在幼茎中，phe-miＲ1432
则出现在叶片中(图 4)。
2. 4 胁迫条件下 miＲNA 的表达分析
与对照相比，经过强光(1 500 μmol·m － 2 s － 1 )和
黑暗处理后 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的相对表达
量均呈现一定程度的下调，差异均达到极显著水平
(P ＜ 0. 01 )，其中黑暗处理比强光处理对 phe-
miＲ397 的表达影响更大，处理后其表达量约为对照
的 57% ; 而黑暗和强光处理对 phe-miＲ1432 表达的
抑制均比较明显，尤其是强光条件下其表达量仅为
对照的 30% (图 5A)。
经高温 ( 42 ℃ ) 和低温 ( 4 ℃ ) 处理后，phe-
miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表达均不同程度的下调，
差异均达到极显著水平(P ＜ 0. 01)，其中高温处理
后 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 表达量下降程度较
低，分别为对照的 70%和 58% ; 而低温处理后二者
的表达均受到较大程度的抑制，phe-miＲ397 和 phe-
miＲ1432 的表达量分别为对照的 8% 和 13% (图
5B)。
在干旱处理后 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表
达呈现相反的情况，phe-miＲ397 的表达下调为对照
的 89%，而 phe-miＲ1432 的表达却上调为对照的
1. 89 倍，差异均达到极显著水平(P ＜ 0. 01); NaCl
处理后 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表达均呈现一
定程度的下调，差异也均达到极显著水平 ( P ＜
0. 01)，其中 phe-miＲ1432 的表达下调更为明显，仅
为对照的 61% (图 5C)。
GA3 和 ABA 处理后，与对照相比，phe-miＲ397 和
phe-miＲ1432 的表达均呈现相反的情况，其中 phe-
miＲ397 在 GA3 处理后明显上调 (约为对照的 1. 7
倍)，phe-miＲ1432 明显下调(约为对照的 56% )，差异
均达到极显著水平(P ＜ 0. 01) (图 6 A); ABA 处理
后 phe-miＲ397 下调，差异达到极显著水平 ( P ＜
0. 01)，phe-miＲ1432 上调，但差异不显著(图 6B)。
3 讨论
环境的日益变化使得人们对非生物逆境条件下
植物自身调节机制的研究越来越重视，这是培育抗
逆新品种的前提条件之一。研究表明，在植物感受
逆境胁迫而做出适应性调整过程中 miＲNA 通过调
控靶基因的表达来参与植物逆境的调控( Sunkar et
al．，2004; Khraiwesh et al．，2012)，且许多 miＲNA 的
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林 业 科 学 51 卷
图 3 基于前体序列构建的系统进化树
Fig． 3 Phylogenetic tree based on the sequence of precursors
A:MIＲ397 系统进化树; B:MIＲ1432 系统进化树
A: Phylogenetic tree of MIＲ397; B: Phylogenetic tree of MIＲ1432
表 2 MiＲNA 前体上游启动子区域顺式调控元件
Tab． 2 Cis-elements in promoter region of miＲNA
miＲNA 名称
miＲNA name
启动子包含的应答元件
Ｒesponsive elements in promoter region
应答环境因子
Ｒesponsive environmental factors
phe-miＲ397
ACE，G-Box，G-box，GA-motif，GAG-motif，CATT-motif，I-box，TCT-motif 光 Light
HSE 温度 Temperature
ABＲE 激素 Hormones
MBS 干旱 Drought
AＲE 厌氧诱导 Anaerobic induction
phe-miＲ1432
Box4，Box I，G-box，GT1-motif，SpI，TCT-motif，chs-CMA2a 光 Light
HSE，LTＲ 温度 Temperature
GAＲE-motif，TGA-motif 激素 Hormones
MBS 干旱 Drought
AＲE 厌氧诱导 Anaerobic induction
86
第 6 期 王丽丽等: 毛竹 miＲ397 和 miＲ1432 的克隆及其逆境胁迫响应表达分析
图 4 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432
在不同组织中的表达分析
Fig． 4 Expression analysis of phe-miＲ397 and
phe-miＲ1432 in different tissues
表达都具有组织特异性(Meng et al．，2012; Han et
al．，2014b)。本研究对 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432
的表达分析发现，二者在根、茎、叶和鞘中均有表达，
这可能与其参与多种非生物胁迫调控有关。miＲNA
本身的表达受到自身启动子以及相关转录因子的调
控，植物可以通过启动子中顺式作用元件与转录因
子的相互协调作用，对光、温度、水分等非生物逆境
产生响应，来调控基因的表达。本研究通过对毛竹
phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 启动子结构分析显示，
它们都含有许多逆境胁迫相关响应元件，这意味着
它们参与多种逆境胁迫的调控，这在对 phe-miＲ397
和 phe-miＲ1432 的表达检测中得到了证实，二者的
表达均受到 NaCl、高温、低温、强光和黑暗等胁迫条
图 5 不同非生物胁迫处理毛竹叶片中 phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 表达分析
Fig． 5 Expression analysis of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432 in leaf of P． edulis under different abiotic stresses
A:光照处理; B:温度处理; C:干旱、NaCl 处理。＊＊表示极显著水平(P ＜ 0. 01)，下同。A: Treated with light; B: Treated with temperature;
C: Treated with drought and NaCl．＊＊ indicates a significant level(P ＜ 0. 01)，the same below．
图 6 GA3 和 ABA 处理毛竹叶片中 phe-miＲ397
和 phe-miＲ1432 表达分析
Fig． 6 Expression analysis of phe-miＲ397 and phe-miＲ1432
in leaf of P． edulis treated with GA3 or ABA
A:GA3 处理; B:ABA处理。A: Treated with GA3; B: Treated with ABA．
件的抑制。在干旱条件下，phe-miＲ397 表达受抑
制，而 phe-miＲ1432 表达则被诱导; 经 GA3 和 ABA
处理后，phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 的表达呈现相
反的表达趋势。
miＲNA 的表达与调控是一个极为复杂的网络
系统，存在 1 个 miＲNA 能够调控多个靶基因的情
况，决定了其所参与生物过程的广泛性; 同时也存
在多个 miＲNA 共同调控 1 个靶基因的情况，体现了
其精细调控，为植物细胞应对复杂的非生物胁迫环
境变化 做 出精 确的 反应，在植物 体 内 形 成 了
miＲNA －转录因子 －靶基因前反馈环路网络(Meng
et al．，2012)。在逆境胁迫条件下，植物 miＲNA 处
于较 为 复 杂的 调控 网络 之中，包括 其 他 相 关
miＲNA、激素、靶基因等多方面因素 ( Ding et al．，
2013)。phe-miＲ397 和 phe-miＲ1432 作为 2 个保守
型的 miＲNA，在受光照、温度、干旱、NaCl、激素等胁
迫时，其表达均呈现了不同程度的变化，或下调或上
调，说明二者可能参与了毛竹逆境胁迫的应答反应
与调控。另外，研究表明过量表达 miＲ397 的拟南
芥植株抗盐性有明显的提高 ( Liu et al．，2008 )，
miＲ397b 通过对木质素生物合成中漆酶的调控来实
现对拟南芥的木质素含量以及种子数量的调控
96
林 业 科 学 51 卷
(Wang et al．，2014)，说明具有多种功能，而在竹子
中 miＲNAs 是如何实现对靶基因精准调控的尚需进
一步研究。因此，将多个 miＲNA 及其靶基因相结合
起来，对逆境胁迫条件下的竹类植物进行研究，揭示
其网络调控机制，并进行分子设计，可能是未来竹类
植物抗逆分子育种的有效途径。
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(责任编辑 徐 红)
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