全 文 ：第 1 卷 第 5 期
1 9 8 8 年1 0 月
林 业 科学研 究
FO R ES T R E S EA R C H
V o l
.
1 , N o
.
5
O Ct
。 ,
1 9 8 8
油松毛虫质型多角体病毒病的
组 织 病 理 研 究
王志贤 陈昌洁
(中国林业科学研究院林业研究所 )
摘 要
本文报道油松毛虫感染JD S 一 CP V 后的组 织病理变化过程 。 幼虫 感病后 , 食欲
降低 , 从感病到死亡的时间较长 , 一般为20 d 左 右 , 长的达一个月或者更长 。观察
了CPV 引起中肠上 皮细胞的病 变过程以及病毒发生基 质 (V S) 与多角体在细 胞质中
的发育形成 。 V S初 期 为许多不定形的 小块 , 以后 小块逐渐增 大 , 合并成团块 , 多
角体在这些团块中形成长大 。 幼曳病变限于中肠 , 其他组织尚 未发现病变 。 虽 然见
到围食膜有增厚现象 , 但未见到有多角体形成 。
关键词 松毛虫 ; 质型 多角体病毒 , 中肠 , 上皮细胞 ; 病毒发生基质
松毛虫是我国林业主要害虫 , 每年发生面积达 4 0 0。万亩以上 。 近年来 , 利用微 生 物 防
治松毛虫取得了较好效果 , 特别是病毒的利用发展很快 , 已取得理想的结果 I‘一 ‘1 。通过日本赤
松毛虫质型多角体病毒D en dl o l玄m u s sp e c t a乙ilfs C PV (JD S一CP V )对油松毛虫D . ta 右u la efo : -
而 :感 染 后的组织病理学研究 , 可以准确地了解JD S一CPV 的致病部位和进程 , 为病毒大量复
制的最适采收期提供了可靠的依据 。 现将试验结果报道于后 。
一 、 材 料和 方 法
(一 ) 材料
1
. 日本赤松毛虫质型多角体病毒(J D S一CPV )系 日本K . K at a g iri 和R . K oy a m a 赠送 ,
该病原在马尾松毛虫上复制 , 将复制材料离心提纯后 , 配制成2 . 5 x l o 7 C PB / m l的悬浮液备
用。
2
. 供试宿主为越冬后 5 一 6 龄的油松毛虫 , 在25 一27 ℃ , R . H . 70 %条件下 , 经一段
时间饲养后 , 选健康幼虫添食病毒 。
(二 ) 方法
1
. 接毒 将洗净的针叶浸入 2 . 5 x 10 ? C PB / m l悬液中 , 取出凉千后 , 饲养健康幼 虫 , 在
2 5一27 ℃ , R . H . 70 %条件下 , 饲养观察。
2
, 取样 幼 虫接毒后 , 每隔24 h 取 2 条虫 , 用B o ul 企D u bo sc q 固定液固定 , 共取样13
4 8 2 林 业 科 学 研 究 1 卷
次 , 同时设立未接毒幼虫为对照 。
3
. 病症观 察 接毒后每隔24 h 取感病幼虫中肠 , 在光学镜下作病变情况观察 。
4
. 石蜡切 片 取接毒后 1 、 3 、 5 、 7 、 9 、 1 1 、 13 d 和 对 照幼虫中肠 , 用常规石蜡
组织切片法进行脱 水 、 包埋 、 切片 , 厚度 为6一7 件。 用H a m m 氏改进染色法染色 [cJ , 光 学镜
观察并拍照 。
5
. 多角休 及病毒杜子的观察 取感染CPV 的松毛虫中肠 , 经 戊二醛 、 饿酸固定 后 , 用
8 12 环氧树脂包埋 , 超薄切片 , 1 %醋酸双氧铀和柠檬 酸铅双染色 , 电 镜 观察 。 提纯的多角
体用o . Z M碳 酸钠一碳酸氢钠缓冲液处理 , 将离心后的上清液浓缩 , 取其悬浮液滴于铜网上 ,
经负染后电镜观察 。
二 、 结 果
(一 ) 松毛虫质型多角体病毒病病变观案
1
. 外部病症 幼虫感病初期 , 外部病症不明显 , 解剖见到中肠仍为透明的淡绿色 , 中肠
p H 为6 . 5一 7 。 当感病 4 . 5 d 后 , 幼虫取食量逐渐减少 , 中肠上有分散的乳白色小斑 点 , 幼
虫行动表现萎糜 , 肠道上的白点增多 , 连成一片 , 白色程度增加 , 面积也越益增大 , 直到中
肠全部变为白色 , 呈不透明状 (图版 工一 1 0 )。 此 时 , 前肠堆积较多未消化的针叶 , 说明肠道
消化状况由于病毒的增殖而受到影响 , 取食量也越来越少 。 多数中肠表面会出现许多横纹皱
褶 , 从白色皱褶的真皮细胞中可镜检到大量的多角体 (图版 I 一 1 1 、 正一 1 4 )。 肠中食物甚少 ,
中肠的 p H 已上升到 8 左右。 在口 吐物和粪便中亦能查到无数的多角体。 虫体逐渐缩短 , 形
成头大体小的不正常病态 。 体内脂肪体也大大减少 , 但体液仍澄清 。 最后中肠完全被破坏 ,
成为乳液状 。 尾部常带有黄白色的稀 粪(图版 工一 9 ) , 通过 ;镜检可发 现大量的多角体 。 同时
也观察到少数感病 中肠肠壁光滑无皱褶 , 其它症状同前 。 在 自然 节况下 , 由于幼虫吞食病毒
量不同 , 所处条件也不尽相同 , 因此 , 患病幼虫致死的时间也有差异 , 个别的为10 d , 大 部
分 为15 一20 d 左右 , 最长的达一个月或更长时间。 部分感病轻微的幼虫可以化蛹甚 至 羽 化
为成虫 , 但蛹和成虫的休型均较小 , 在成虫的肠道及其排泄物中 也含有大址的多 角体 (图版
1 一28 )
。 山于卵表受到排 泄 物污染 , 初孵幼虫因取食卵壳而感病 , 造成下代幼虫大狱死亡 。
2
· 组织病 变
(1) 根据石蜡切片观察 , 幼虫组织病变主要在中肠 , 而前肠 、 后肠 、 脂肪、 血细胞 、 表
皮 、 神经等组织均未见异常 , 与正常幼虫组织相似(图版 工一 1 一 8 ) 。 中 肠 细胞病变一般 由
中肠后部开始 , 逐渐向中肠前部扩展 , 直到整个中肠 全部病变。 中肠的肠壁细胞病变也不完
全相同 , 有时半边肠壁感染严重 , 半边较轻或一块严重 , 一块较轻。 有时部分充满多角休的
细胞已经破裂 , 同时也可见到感染较轻的肠壁细胞 , 说明感染是先后进行的。
( 2 ) JD S
一
CPV 首先侵染中肠柱状细胞 , 而杯状细胞比柱状细胞感染晚 。 多角 体 在细胞
质内形成 , 被侵染的细胞较正常细胞肿大 。 感染初期 , 中肠细胞质的着色不均匀 , 尤其是近
微绒毛下的一侧 , 细胞着色比正常细胞深一些 (图版 亚一 16 ) , 核仁稍 膨 大。 感 病4 、 s d 后 ,
在中肠细胞的上 、 中部 (微绒毛的下面 )形成数量不等 、 形状不定 、 边缘不清的病毒发生墓质
(V S)
, 用H a m m 液染色 , V S着 色比细胞质染色稍深 (图版 兀一 1 7 ) , 呈 淡 灰蓝色 , 容易识另1。
5 期 王志贤等 : 油松毛虫质型多角体病毒病的组织病理研究 4 8 3
随着 V S增大染色也愈深 (图版 卫一 18 一2 0) , 各 V S 块逐渐相互连 结成不定形的大块 , V S 染
色呈蓝色。 随之 , V S 块增大 , 轮廓逐渐趋于清晰 , 呈椭圆形或楔形(图版 卫一别 、 2 1 ) , 并且染
色由蓝变为紫红色 , 在V S 内部形成形状较小还难以分辨的多角体。 从图版 1 一20 、 21 、 皿 一2
一25 可见到着色深的多角体团块 , 随时间增长 , 多角体渐渐增大 , 成熟的多角体在光学镜下
呈红色的六角形 、 方形或近圆形(图版 1 一 2 6 ) 。 在一个多角体团块中的多角体大小 相 {似 。 由
于多角体团块形成先后不同 , 故在一个切面上可见到大小不同的多角 体 (图版 皿一25 、 2 6 ) 。
当肠壁细胞充满多角体时 , 往往细胞核被挤在细胞底部。 在幼虫感病期 间 , 中肠肠壁内均可
找到CPV 形成过程中的不同阶段 (图版 l 一24 一2 6 )。 还观察到围食膜有增厚现象团 , 但未见
到有多角体形成。
(3) 幼虫感病后 3 d 内 , 细胞病变不很明显 , 第 4 天可见到中肠后部的细胞 中 出 现 V S
或个别的小多角体。 第 5 天中肠中部的细胞明显感染 。 第 7 天中肠前部已见到细胞病变 , 中
后部中肠细胞里充满多角体 (图版 皿 一23 ) , 有少量细胞破裂 , 多角体从中脱离。 第 8 天 由 于
病毒增殖而遭到破坏的细 胞 , 从肠壁脱落者愈来愈多 。 感病13 d 的中肠里食物残渣很 少 ,
而出现大量脱落的细胞碎片及多角体。 频死前 , 肠壁已不完整 , 多角体大部分被排出体外(图
版 l 二29 、 3 0 ) 。 因此 , 收 集 病原的时间不能等待幼虫死亡 , 而应在死亡前一段时间采收。
(二 ) 病原
1
. 多角体一般为六角形 , 少数为四方形或近圆形。 多角体大小差异 较 大 , 大 的可 达
5
.
1 8 5 卜m , 小的0 . 5 件m 左右 , 平均约2 件m (图版 兀共1 4 、 皿二2 8 )。
2
. 病毒粒子呈廿面体的圆球形 , 在其表面可见到对称的放射状突起 , 其 直 径 约50 n m
(图版 互一12 、 1 3 )。 据报道一个多角体内约有 1 0 0 个病毒粒子 闭 , 但多角体内病毒粒 子 数
量因多角体大小而有很大差异 , 有的小多角体切面仅 3 一 4 个病毒粒子 , 甚至没有多 而大多
角体切面病毒粒子的数量有上百个之多。 多角体的大小和病毒数量的差异是十分悬殊的。 因
此 , 为避免多角体的破裂而造成病毒粒子的散失 , 选择最适的保存条件是十分重要的。
三 、 结论 与讨 论
根据病毒寄主范围 、 病毒颗粒的形态 以及在感染细胞中产生多角体等 特 点 , JD S 一CPV
与呼肠孤病毒有明显的区别 〔落〕。 病毒复制部位仍限于中肠上皮细胞 , 含等轴病毒粒子 , 病毒
基因为双股R N A , 包括10 个基因片断 [s1 。 其病症 、 致病过程和感病组织部位与 X er 。报道对
家蚕C PV 研究情况相似 。 感病较轻的松毛虫在化蛹后 , 破碎的上皮细胞及多角体进入肠腔。
病蛹以及成 虫中肠均大于正常 虫的中肠 , 这与Is hi kw a等对感病家蚕的研究情况 类同。 JD S -
C PV 在松毛虫中肠组织病变和 V S形成 , 与秋尺蟆 (A ls o phila p o o e ta r ia ) C PV [。1 , 棉 铃 虫
(H eli 时肠 a1 二咭el a) CPV 等 L‘。’“ ]有相似处 , 但病程的差异随不同虫种生长发育期的长短而
有变化 。 病虫中肠内绝大部分多角体在幼虫死亡前均随粪便排 出体外。 此外 , 也观察到感染
最严重的幼 虫生殖腺似乎也出现病变现象 , 但是否与CP V 侵染有关 , 尚需进一步研究。
参 考 文 献
Ui 〕 K a t a g ir i, K . , 了仑5 1 , p e s t C o n tr o l by e y t o p la s m ie p o lyh e d r o 冬15 v ir u s , m ie r o b ia l e o n tr o 一 ? f
4 8 4 林 业 科 学 研 究 1 卷
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T h is Pa Pe r re Po r ts th e Pro c e ss e s o f h isto Pa tho lo g ie e h a n g e o f t he P in e
e a t e rP illa r la r v a e in fe e te d w ith JD S一C PV
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T h e in fec t iv e t is s u e 15 c o n fin ed to
t h e e p ith e lia l e e ll o f th e m id g u t
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T h e d e v e lo p m e n t a n d fo r m a tio n o f t h e v ir o g e
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n ie st r o m a ta (V S ) a n d po lyli e d ra o f th e v ir u s in eyto Pla s m w e re o bs e rv e d in
ea r ly sta g e o f in fec t io n
, th e V S o f CP V aPPe a r e d a s irr e g u la r sm a ll Piec e s
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Sinc e th e n
, th e g rea t m a邓 e s o f V S a n d CP B w e r e fo r m e d . It w a s a lso fo u n d
th a t t h e fu n n e d eh a n g ed in thie k n e ss
,
b u t d id n o t fin d a n y p o lyhed r o n bo d y
in it
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K e y w o r d s : Pin e e a t e r Pilla r : CPV : m id g u t : ePit h e lia l: v ir o g e n ie str o m a ta