全 文 ：第 51 卷 第 12 期
2 0 1 5 年 12 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 51，No. 12
Dec．，2 0 1 5
doi:10．11707 / j．1001-7488．20151209
收稿日期: 2014 － 12 － 29; 修回日期: 2015 － 10 － 11。
基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金资助(BLX2013015) ; 林业公益性行业专项资助项目(201104054)。
* 贺伟为通讯作者。
欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ基因的功能分析*
李 宾1 李爱宁1 魏 强1 王海明2 贺 伟1
(1．北京林业大学林木有害生物防治北京市重点实验室 北京 100083; 2．山东省菏泽市林业局 菏泽 274000)
摘 要: 【目的】为了明确欧美杨细菌性溃疡病病原菌 hrcJ 基因在致病过程中的作用，解析病原菌Ⅲ型分泌系
统各基因的功能，为阐明病原菌的致病机制提供理论依据。【方法】利用同源重组原理，构建携带菌株 N-5-1 hrcJ
基因的自杀载体 pEX18Km-hrcJ，运用两亲结合方法把自杀载体导入野生型 N-5-1 菌株中，在含有相应浓度的卡纳
霉素和利福平抗生素的 LB 平板上筛选得到 hrcJ 基因的插入突变体，并通过 PCＲ 和 Southern 杂交验证。为进一步
验证 pEX18Km-hrcJ 是否定点整合入 hrcJ 基因，设计了 2 对引物组合进行 PCＲ 扩增。在室内生化培养箱内，分别以
野生型菌株 N-5-1、插入突变体菌株 ΔhrcJ 和互补载体菌株 HBhrcJ 接种 1 年生 107 杨苗干，进行致病性测定。
【结果】扩增出来的 PCＲ 片段大小均与预期一致，Southern 杂交信号带大小与预期相同，表明自杀载体 pEX18Km-
hrcJ 正确地整合入目的基因，即 hrcJ 基因由于发生同源交换而实现了插入突变。生物学特性测试表明: hrcJ 基因
的插入突变体在 1 年生 107 杨苗干上的致病能力显著下降，野生型菌株 N-5-1、插入突变体菌株 ΔhrcJ 和互补载体
菌株 HBhrcJ 的病情指数分别为 84. 4，31. 1 和 66. 7，并且丧失了在本氏烟草上的 HＲ 激发能力，功能互补突变体部
分恢复至野生表型; 生长能力测定显示，野生型菌株 N-5-1、插入突变体 ΔhrcJ 和互补载体 HBhrcJ 生长曲线无明显
差异，在液体 LB 培养基中均可正常生长; 通过结晶紫染色后，在培养 ΔhrcJ、HBhrcJ、野生菌株 N-5-1 的试管壁上均
可以观察到紫色环状的生物膜形成，3 种菌株的 OD570值相近; 游动性测试表明，hrcJ 基因突变体的运动能力比野
生菌株下降了 21%。【结论】利用自杀载体 pEX18Km 可成功构建欧美杨细菌性溃疡病病原菌基因插入突变载体，
为欧美杨细菌性溃疡病病菌的致病基因研究提供一种可选择的方法。欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ 基因与其对 107
杨的致病性有关，能够激发非寄主植物烟草的过敏性反应; 欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ 基因突变并未影响病原菌
的生长和生物膜的形成，但其游动性减弱。
关键词: 欧美杨细菌性溃疡病菌; hrcJ; Ⅲ型分泌系统; 致病性
中图分类号: S763. 1 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2015)12 － 0071 － 08
Functional Analysis of hrcJ Gene in Lonsdalea quercina subsp． populi
Li Bin1 Li Aining1 Wei Qiang1 Wang Haiming2 He Wei1
(1． Beijing Key Laboratory for Forest Pest Control，Beijing Forestry University Beijing 100083; 2． Heze Forestry Bureau of Shandong Province Heze 274000)
Abstract: 【Objective】The poplar bacterial canker caused by Lonsdalea quercina subsp． populi is a disease that is a
seriously harm to poplar industry． In order to clarify the role of the hrcJ gene playing in the pathogenesis of L． quercina
subsp． populi，it’s necessary to reveal the function of each gene in type Ⅲ secretion system of the pathogen and provide
a theoretical basis for elucidating the pathogenic mechnism of pathogens．【Method】The hrcJ inserted mutant was
constructed by homologous recombination． A suicide vector，pEX18Km-hrcJ，that carries hrcJ gene of the pathogen strain
N-5-1 was constructed． The suicide vector was introduced into the wild-type strain N-5-1 by using amphiphilic bonding
method． The hrcJ gene insertion mutants were screened on LB plates containing the corresponding concentration of
kanamycin and rifampicin． Then the hrcJ inserted mutant was verified by PCＲ and Southern blot． One-year-old seedling of
Populus × euramericana cv．‘74 /76’were inoculated in an incubator，with strains of the wild-type，the hrcJ gene
mutant，and the complemented mutant HBhrcJ respectively，for pathogenecity test．【Ｒesult】The PCＲ amplified fragment
sizes are consistent with those expectations and Southern hybridization signal stripe size was the same as expected，showing
that the suicide vector pEX18Km-hrcJ has been properly integrated into the target gene． That is the hrcJ gene has achieved
insertion mutation due to the homologous exchange． Pathogenicity test on one-year-old poplar branches indicated that the
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hrcJ gene mutant was significantly less virulent than wild-type，while the complemented mutant HBhrcJ restored the
virulence to the wild-type level． Growth analysis showed that growth capacity of hrcJ gene mutant had no significant change
compared with that of wild-type，and the ability of biofilm formation evaluated by OD570 was similar among strains N-5-1，
ΔhrcJ and HBhrcJ． Motility test showed that the motility of hrcJ gene mutant was decreased by 21 percent compared with
that of wild-type．【Conclusion】The suicide vector pEX18Km can be successfully used to construct pathogen gene insertion
mutation in Lonsdalea quercina subsp． populi，and an alternative method is provided for pathogenic gene research of the
pathogen． This result suggests that the hrcJ gene is required for pathogenicity of L． quercina on host plant poplar and
hypersensitive reaction on non host plant tobacco． The hrcJ gene mutant of L． quercina did not affect growth of the
pathogen and the formation of biofilm，but the obviously decreased motility．
Key words: Lonsdalea quercina subsp． populi; hrcJ; type-Ⅲ secretion system; pathogenicity
2006 年 5 月在我国河南省濮阳县 4 年生的中
林 46 杨(Populus × euramericana cv． Zhonglin 46)林
地中首次发现欧美杨溃疡病，这是世界上首次报道
此病害(郭利民等，2008)。该病主要危害中林 46
杨、107 杨(P． × euramericana cv． 74 /76)等欧美杨
枝干，产生大量伤流，耗损树木养分，严重影响树木
的健康生长(郭利民等，2012)。本实验室通过科赫
假定回接试验、形态学鉴定等方法，确定了欧美杨溃
疡病的病原为 Lonsdalea quercina subsp． populi(Li et
al．，2014)，该细菌属于变形菌门( Proteobacteria)肠
杆 菌 目 ( Enterobacteriales ) 肠 杆 菌 科
(Enterobacteriaceae)。
2012 年 L． quercina 从 Brenneria 属中分离出来，
成为一个新属。尽管如此，L． quercina 与 Brenneria
属中植物病原细菌仍然存在最近的亲缘关系，由它
们所致植物病害症状也很相似 (杨莉等，2014 )。
Brenneria 属 中 林 木 病 原 细 菌 有 B． alni， B．
nigrifluens，B． paradisiaca，B． quercina，B． salicis，
B． rubrifaciens，其中，胡桃树皮深层溃疡病病原 B．
rubrifaciens 能产生一种水溶性的红色色素，这与此
细菌的毒性有关(Mcclean et al．，2009)，但具体机制
尚不清楚。Huvenne 等 (2009)发现 B． salicis 具有
群体感应(quorum-sensing，QS)效应，通过群体密度
调控纤维素酶的表达，使柳树细胞壁降解，从而引发
柳树水纹病。除此之外，很少有 Brenneria 属细菌对
寄主致病机制的研究。
革兰氏阴性植物病原细菌在非寄主和抗性寄主
上引起的过敏反应( hypersensitive response)及寄主
植物上的致病性 ( pathogenicity)是由其 hrp 基因簇
决定的(陈功友等，2002)，效应分子通过 hrp 基因
簇编码的Ⅲ型分泌系统 ( type Ⅲ secretion system，
T3SS)分泌转运进入寄主细胞内，对植株造成伤害
和诱导寄主植物抗病反应(朱秀秀等，2009)。杨莉
等(2014)通过基因组测序明确了 L． quercina N-5-1
编码 T3SS 的基因簇由 27 个基因组成，约 23 kb，存
在于染色体上，其中 hrcC，hrcJ，hrcQ，hrcＲ，hrcS，
hrcT，hrcU，hrcV 和 hrcN 是高度保守的 hrc 基因，编
码产物组成 T3SS 的针状装置。并获得了菌株N-5-1
的结构基因 hrcV 及其外泌蛋白编码基因 hrpW 的突
变体，突变体在杨树上的致病性显著下降，而互补
菌株则与野生菌株致病性基本保持一致，并在敏感
烟草植物上丧失了诱导 HＲ 反应的能力; 但该菌株
的生长速率、生物膜和游动性并没有受到影响 (杨
莉等，2014)。
在植 物 病 原 细 菌 Xanthomonas oryzae pv．
oryzicola 和 Pseudomonas syringaeae pv． syringae 中，
hrcJ 基因突变体丧失了致病性和在烟草上的 HＲ 激
发能力(赵文祥等，2010; He et al．，1998)。但 hrcJ
基因在欧美杨细菌性溃疡病菌 Lonsdalea quercina
subsp． populi 致病性中的作用尚不清楚。为明确 L．
quercina N-5-1 的 hrcJ 基因在致病过程中的作用，本
研究利用同源重组原理(高杜娟等，2011; 汪新等，
2011)，通过基因插入方式(王薇等，2014)，构建了
L． quercina N-5-1 的 hrcJ 基因插入突变体。通过比
较野生型菌株与 hrcJ 基因插入突变体菌株部分生
物学性状和对欧美杨品种 107 杨的致病性，阐释其
功能，可为揭示病原菌Ⅲ型分泌系统各基因的功能，
阐明病原菌的致病机制提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 菌株、质粒、培养条件及引物
试验所用菌株、质粒及性状见表 1。L． quercina
N-5-1 及其衍生菌株用 LB 培养基 30 ℃培养 24 h;
大肠杆菌(Escherichia coli)用 LB 培养基 37 ℃培养
16 h。所用抗生素终浓度为: 庆大霉素 ( GmＲ )
50 μg·mL － 1、卡纳霉素(KmＲ ) 50 μg·mL － 1、氯霉素
(CmＲ)20 μg·mL － 1、利福平(ＲifＲ )20 μg·mL － 1。试
验所用引物在北京天一辉远公司合成(表 2)。
27
第 12 期 李 宾等: 欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ 基因的功能分析
1. 2 供试植物
欧美杨 107 苗木，采自北京林业大学三顷园苗
圃的 1 年生健康扦插苗，经过组织分离培养未见
Lonsdalea quercina subsp． populi 等病原微生物。随
机选取 18 株生长状况相同的 107 杨苗木，在同一部
位截取 30 cm 长的枝段，随机分成 3 组，每组 6 个枝
段，供接种使用。
表 1 菌株和质粒①
Tab． 1 Bacterial strains and plasmids
名称 Name 特征 Characteristic 来源 Source or reference
菌株 Strains
N-5-1 野生型欧美杨溃疡病菌菌株，利福平抗性 Wild type of L． quercina，ＲifＲ 本实验室 This lab
ΔhrcJ
hrcJ 基因的插入突变体，利福平抗性，卡纳霉素抗性
Insertion mutant of hrcJ gene，ＲifＲ，KmＲ
本研究 This study
HBhrcJ
hrcJ 基因的互补菌株，利福平抗性，卡纳霉素抗性，庆大霉素抗性
Complementarity strains of hrcJ gene，ＲifＲ，KmＲ，GmＲ
本研究 This study
DH5α
大肠杆菌 Escherichia coli，Φ80 lacZΔM15Δ( lacZYA-argF) U169 hsdＲ17 recA1 endA1
thi-I 宝生物公司
TaKaＲa
质粒 Plasmid
pEX18Km
用来自 pUC18 载体 MCS 基因置换的自杀载体，卡纳霉素抗性
oriT + sacB + ，gene replacement vector with MCS from pUC18，KmＲ
Hoang et al．，1998
pEX18Km-hrcJ
携带有 hrcJ 基因的自杀载体 pEX18Km，卡纳霉素抗性
pEX18Km containing a fragment of the hrcJ gene，KmＲ
本研究 This study
pＲK600
三亲本结合中辅助菌株，氯霉素抗性
ColE1 oriV，ＲP4，tra +，ＲP4 oriT，helper plasmid in triparental matings，CmＲ
Kovach et al．，1995
pBBＲ1MCS － 5 广寄主的穿梭载体; 庆大霉素抗性 Broad host range shuttle vector，GmＲ Kessler，1992
pBBＲ-hrcJ
携带有 hrcJ 基因的穿梭载体 pBBＲ1MCS-5，庆大霉素抗性
Complementarity vector of hrcJ gene，GmＲ
本研究 This study
① KmＲ，CmＲ，GmＲ，ＲifＲ分别表示卡纳霉素、氯霉素、庆大霉素、利福平抗性。KmＲ，CmＲ，GmＲ，ＲifＲ represent resistance to kanamycin，
chloramphenicol，gentamicin，rifampicin，respectively．
1. 3 hrcJ 基因插入突变载体的构建
根据 hrcJ 基因序列设计引物(表 2)，以野生菌
株 N-5-1 基因组为模板，通过 PCＲ 扩增得到所需片
段，大小为 457 bp，用浓度为 2% 的琼脂糖进行电
泳，使用北京天根公司切胶回收试剂盒回收 hrcJ 基
因的 PCＲ 产物，用相应的限制性内切酶进行酶切后
16 ℃过夜连接到自杀载体 pEX18Km 上，得到相应
的突变载体，并测序检查所构建载体是否正确。
1. 4 hrcJ 基因插入突变体的获得
制备热击感受态 DH5α 细胞，将已经构建好的
插入突变载体热击转化到 DH5α 感受态细胞得到供
体菌; 野生菌株 N-5-1 为受体菌。将供体菌、受体
菌、Helper 菌株取出适量进行三亲杂交(Yang et al．，
2014)，将供体菌中的突变载体导入野生菌株中，将
杂交株涂于含有 Ｒif 和 Km 的 LB 平板，30 ℃培养
72 h，挑取所得菌落用 N-5-1 菌株特异性引物
Infb238 / Infb579(未发表)和自杀载体中 SacB 基因
引物 SacB1 /SacB2(表 2)做 PCＲ 验证，将得到的插
入突变体命名为 ΔhrcJ。并利用 Southern 杂交方法
进一步验证突变载体插入的正确性。
表 2 引物与限制性酶切位点
Tab． 2 Oligonucleotides and restriction enzymes
寡聚核苷酸
Oligonucleotides
序列 (5 － 3) (下划线部分为限制性内切酶)
Sequence (5 － 3) (The underlined portion refers restriction enzyme sites)
限制性内切酶
Ｒestriction enzyme
JCＲ 1
JCＲ 2
hrcJ hb1
hrcJ hb2
5 － TATGAATTCGCTTGGCAGTTATCGCATCAATG － 3c
5 － ACTAAGCTTCAAGGAGAAAACGATGGACAGTTC － 3
5 － TATAAGCTTGACCCTCTATCACCGTCTTAAG － 3
5 － ACTTCTAGATCAACGCGATCAGTTGCCATAG － 3
EcoＲⅠ
Hind Ⅲ
Hind Ⅲ
XbaⅠ
MCS 1
MCS 2
5 － GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTG － 3
5 － TGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTG － 3
Sac B1
Sac B2
5 － GGCTTGTATGGGCCAGTTAAAG － 3
5 － GTCTTTGCATTAGCCGGAGATC － 3
CXF
CXＲ
5 － ATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTG － 3
5 － TTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG － 3
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林 业 科 学 51 卷
1. 5 hrcJ 基因互补突变体的获得
以野生菌株 N-5-1 基因组为模板，用引物(表
2)通过 PCＲ 扩增出相应的互补片段。PCＲ 产物进
行 0. 8%琼脂糖电泳后切胶回收大小正确片段，与
穿梭质粒 pBBＲ1MCS-5 一并用相应的限制性内切
酶酶切后，16 ℃过夜连接，热击转化入 DH5α 细胞，
得到相应的互补菌株，通过三亲杂交 (Yang et al．，
2014)，将正确的互补载体转化到 ΔhrcJ 中，PCＲ 验
证转化子，得到互补菌株，命名为 HBhrcJ。
1. 6 生长曲线测定
将野生菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 接种于 LB
液体培养基中过夜培养至稳定期，用新鲜 LB 液体
培养基将各菌株稀释到 OD600 = 0. 3，以体积比
1∶ 1 000分别将各菌株接种于 100 mL 新鲜 LB 液体
培养基中，30 ℃、180 r·min － 1摇培，每个菌株 3 个重
复，每隔一段时间测定各菌株在 600 nm 的吸光值，
绘制生长曲线。
1. 7 游动性的测定
将野生菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 接种于 LB
液体培养基中过夜培养至稳定期，分别吸取 3 μL 滴
于含有 0. 3%琼脂的半固体 LB 培养基上，无菌风吹
干，30 ℃培养 24 h，测量各菌株游动晕圈直径，试验
重复 3 次(高杜娟等，2011)。
图 1 PCＲ 验证插入突变菌株
Fig． 1 PCＲ analysis of the mutant
a. 用引物 InfB 238 / InfB 579 PCＲ 验证突变体 PCＲ analysis by primers of InfB 238 / InfB 579; M． 100 bp marker; 1，2，3． ΔhrcJ;
4． N-5-1; 5． pEX18Km-hrcJ; 6． H2 O． b. 用引物 Sac B 1 / Sac B 2PCＲ 验证突变体 PCＲ analysis by primers of Sac B 1 / Sac B 2;
1，2，3． ΔhrcJ; 4． pEX18Km-hrcJ; 5． N-5-1; 6． H2 O; M． 100 bp marker．
1. 8 生物膜的测定
将 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 接种于 LB 液体培养
基中过夜培养至稳定生长期，以体积比 1 ∶ 100 接种
到含有 2 mL 新鲜 LB 液体培养基的洁净普通玻璃
试管(10 mL)中，30 ℃静置培养 48 h，用移液器轻轻
吸尽试管中的菌液，无菌水清洗 2 遍试管，加 2 mL
0. 1%的结晶紫染色 30 min，用移液器轻轻吸尽结晶
紫溶液，然后用无菌水轻轻清洗 3 遍试管，于 37 ℃
烘干试管，可观察到试管壁上有一圈紫色痕迹即是
固液交界处形成的坚固的生物膜。加入 2. 5 mL
95% 的乙醇充分溶解与生物膜结合的结晶紫，取
1 mL测量 OD570(Yang et al．，2014)。
1. 9 烟草过敏反应测试
将突变体、互补菌株、野生菌株用 LB 培养至对
数生长期，将各菌株用无菌水稀释到 OD600 = 1. 0，用
1 mL 无 菌 注 射 器 取 50 μL 注 射 到 本 氏 烟 草
(Nicotiana benthamiana)叶片中，24 h 后检查各个处
理的 HＲ 反应情况，无菌水为阴性对照，试验重复
3 次(赵文祥等，2010)。
1. 10 致病性反应测试
将 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 接种到含有相应抗
生素的 LB 液体培养基中，30 ℃、180 r·min － 1摇床
培养 24 h 后，将菌液浓度稀释到 OD600 = 1. 0，分别
取 100 μL 各菌液接种到 1 年生欧美杨 107 枝条上，
每个菌株接 6 个枝段，每枝段接 1 个点，试验重复
3 次，LB 液体培养基接种为阴性对照。在 28 ℃、相
对湿度为 90%条件下培养 8 天后观察、记录发病情
况。按发病的严重程度，将病情分为 4 级:Ⅰ级代表
值为 0，接种伤口无发病症状，木质部无病斑出现;
Ⅱ级记为 1，接种点树皮变软、凹陷，无明显脓液流
出，病斑长度 0. 1 ～ 0. 9 cm; Ⅲ级代表值为 2，被接
种的树皮伤口流出乳白色菌脓，病斑长度 1. 0 ～
3. 0 cm; Ⅳ级记为 3，从接种的伤口流出的菌脓变成
褐色，病斑长度 3. 1 ～ 5. 0 cm。根据病情指数 =
100 ×∑(各级病枝数 × 各级代表值) /(调查总枝
数 ×最高级代表值)计算病情指数，用 SPSS 软件进
行差异显著性分析(Yang et al．，2014)。
2 结果与分析
2. 1 hrcJ 基因插入突变体的验证
2. 1. 1 PCＲ 验证 随机选取 3 个转化子。首先，用
L． quercina N-5-1 特异性引物 InfB238 / InfB579 PCＲ
扩增(图 1a)，可扩增到 342 bp 片段，确定是欧美杨
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第 12 期 李 宾等: 欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ 基因的功能分析
溃疡病菌; 然后用引物 Sac B 1 /Sac B 2 进行 PCＲ
扩增，由于突变株中有自杀载体 pEX18Km-hrcJ 的
插入，因此可以扩增出 854 bp 条带，而野生型菌株
中没 有，故 扩 增 不 出 任 何 条 带 (图 1b )，确 定
pEX18Km-hrcJ 插入到野生菌株中。
为进一步验证 pEX18Km-hrcJ 是否定点整合入
hrcJ 基因，设计了 2 对引物组合进行 PCＲ 扩增:一
对引物组合的上游引物为 hrcJ hb1，下游引物为
CXＲ; 另一对引物组合的上游引物为 CXF，下游引
物为 hrcJ hb2(图 2)。转化子分别用 2 对引物组合
扩增出来的 PCＲ 段大小都与预期一致(图 3)，表明
pEX18Km-hrcJ 正确地整合入目的基因，即 hrcJ 基
因由于发生同源交换而实现了插入突变。
2. 1. 2 Southern 杂交验证 提取野生型和突变体
DNA，用 Hind Ⅲ酶切，以 hrcJ 基因插入片段为探针
进行 Southern 杂交分析。由于 hrcJ 基因内部不存在
Hind Ⅲ酶切位点，而突变体的基因组中插入的自杀
载体 pEX18Km 上存在 Hind Ⅲ 酶切位点，所以
L． quercina N-5-1 DNA 的 Hind Ⅲ酶切片段只有1 条
杂交信号带，片段大小为 2 715 bp，而突变体应该有
2 条杂交信号带，片段大小为 1 713 和 5 845 bp。
杂交结果显示: 条带大小与预期一致(图 4)，
进 一 步 表 明 pEX18Km-hrcJ 已 成 功 插 入 到
L． quercina N-5-1 的 hrcJ 基因位点。
图 2 hrcJ 基因插入突变体示意
Fig． 2 Schematic map of the constructions of hrcJ inserted mutants
图 3 不同引物组合 PCＲ 验证自杀载体插入位点
Fig． 3 PCＲ analysis of the inserted site of the suicide vector
a． 用引物 hrcJ hb1 /CXＲ PCＲ 验证突变体 PCＲ analysis by primers of hrcJ hb1 /CXＲ;
1，2，3． ΔhrcJ; 4． N-5-1; 5． pEX18Km-hrcJ; 6． H2 O; M． 1 kb marker．
b． 用引物 hrcJ hb2 /CXF PCＲ 验证突变体 PCＲ analysis by primers of hrcJ hb2 /CXF．
1，2，3． ΔhrcJ; 4． N-5-1; 5． pEX18Km-hrcJ; 6． H2 O; M． 1 kb marker．
图 4 Southern blot 验证突变体
Fig． 4 Southern blot analysis of the mutant
M． 1 kb marker;1． N-5-1;2． ΔhrcJ．
2. 2 hrcJ 基因互补突变体的验证
挑取转化子，用引物 InfB238 / InfB579、引物
SacB1 /SacB2 和 pBBＲ1MCS-5 多克隆位点上下游引
物 MCS 1 /MCS 2(表 2)进行 PCＲ 验证。分别可扩
增到 342，854 和 2 182 bp 片段，大小与预期一致(图
5)，即 hrcJ 基因互补菌株构建正确。
2. 3 生长曲线的绘制
以横坐标为时间，纵坐标为活菌数的对数
(OD600值)，可绘制出一条生长曲线。结果显示: 野
生型菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 生长曲线无明显差
异，在液体 LB 培养基中均可正常生长(图 6)，说明
hrcJ 基因突变并未影响 L． quercina N-5-1 的生长。
2. 4 hrcJ 基因突变与生物膜的形成无关
生物膜是微生物在遇到外界不良环境时，附着
在固体表面包裹在胞外多糖内形成的一种复杂多层
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图 5 PCＲ 验证互补菌株
Fig． 5 PCＲ analysis of the complementation
M1. 1 kb marker;1． H2 O; 2． 引物 InfB 238 / InfB 579 PCＲ 验证
PCＲ analysis by primers of InfB 238 / InfB 579; 3． 引物 Sac B1 / Sac
B2 PCＲ 验证 PCＲ analysis by primers of Sac B1 / Sac B2; 4. 引物
MCS 1 /MCS 2 PCＲ 验证 PCＲ analysis by primers of MCS 1 /MCS 2;
M2． DL2000 marker．
图 6 突变体生长能力测定
Fig． 6 Growth test of the mutants
的类似于膜的结构(Larsen et al．，2002)。通过结晶
紫染色，可以在试管壁上观察到紫色环状的生物膜
形成。本研究发现 ΔhrcJ、HBhrcJ、野生菌株 N-5-1
均可形成生物膜(图 7a)，并且 3 种菌株的 OD570值
相近(图 7b)，说明 L． quercina N-5-1 的 hrcJ 基因在
其生物膜形成过程中并不重要。
2. 5 hrcJ 基因突变影响游动性
细菌的运动可以分为涌动性和游动性，分别与
细菌的纤毛和鞭毛有关，极生鞭毛有助于对细菌生
物膜的形成和定殖能力(Bahar et al．，2009)。在含
0. 3%琼脂的 LB 半固体培养基上检测细菌的游动
性，2 天后发现 ΔhrcJ 的游动晕圈为野生型 N-5-1 的
80%，HBhrcJ 的游动晕圈大小与野生型接近 (图
8)，没有显著差别，结果表明，hrcJ 基因可能间接地
与鞭毛运动有关，从而导致细菌运动能力下降。
2. 6 hrcJ 基因突变对过敏性反应的影响
在同一片本氏烟草叶片上接种 hrcJ 突变体
ΔhrcJ、HBhrcJ、野生菌株 N-5-1 和无菌水阴性对照，
对其引发 HＲ 反应能力进行检测。结果如图 9，
ΔhrcJ 基本丧失了在本氏烟草上引起 HＲ 反应的能
图 7 hrcJ 基因突变体对生物膜形成的影响
Fig． 7 Effect of the hrcJ mutants on biofilm formation
a． 各菌株在试管壁上形成的生物膜 Biofilm of strains on
the burets; b． 各菌株在试管壁上形成生物膜的 OD570值
OD570 of biofilm of strains on the burets．
图 8 hrcJ 基因突变体的游动能力测定
Fig． 8 Motility assay of hrcJ mutants
a． 各菌株在半固体培养基中的菌落 The haloes of strains on
semi-solid medium; b． 菌株的游动晕圈直径 Diameter of
swimming halo．
图 9 hrcJ 突变体过敏反应检测
Fig． 9 The hypersensitivity response of strains
力，而互补菌株和野生菌株则均能在此叶片上引起
HＲ 反应。这表明 hrcJ 基因直接影响 N-5-1 在本氏
烟草上激发 HＲ 反应的能力。
67
第 12 期 李 宾等: 欧美杨细菌性溃疡病菌 hrcJ 基因的功能分析
2. 7 hrcJ 基因突变对致病性的影响
野生型菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 接种 1 年生
欧美杨 107 枝条，8 天后观察发病情况(图 10 A)，可
以看到接种野生菌株和互补菌株的枝条伤口流出大
量乳白色黏稠状脓液，伤口周围树皮软腐、凹陷，而
接种 ΔhrcJ 的杨树枝条有少量脓液流出，周围树皮
组织没有明显的腐烂。ΔhrcJ 的致病性比野生菌株
N-5-1 和 HBhrcJ 明显下降，HBhrcJ 致病性能部分恢
复到野生型水平，病情指数分别为 31. 1，84. 4 和
66. 7(图 10 B)。突变体的致病性与野生菌株和互
补菌株相比，达到极显著差异。
图 10 菌株致病性测定
Fig． 10 Pathogenicity assay on poplar branches with strains
a． 杨树枝条接种野生菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 后的症状，接种 LB 液体培养基为阴性对照。The symptoms on the poplar
branches inoculated with wild type strain of L． quercina N-5-1，hrcJ inserted mutant ΔhrcJ，complemented mutant HBhrcJ，and the
control LB medium． b． 杨树枝条接种野生菌株 N-5-1、ΔhrcJ 和 HBhrcJ 后的病情指数，接种 LB 液体培养基为阴性对照。
The disease index of poplar branches inoculated with N-5-1，ΔhrcJ，HBhrcJ and control (LB medium) ．
试验重复 3 次，误差线代表标准差，＊＊＊( P ＜ 0. 001 )表示采用 SPSS 软件的差异显著性分析结果。Experiments were
performed in triplicate，and error bars indicate standard deviations． ＊＊＊(P ＜ 0. 001) indicate statistically significant differences
between wild type N-5-1 and its derivatives．
3 讨论
本研究利用自杀载体 pEX18Km 成功地获得了
L． quercina N-5-1 的 hrcJ 基因插入突变体。对致病
性、生物膜和游动性生物学测定，明确了 hrcJ 基因
的功能，建立了一套适用于 L． quercina N-5-1的基因
定点插入突变体系，为欧美杨细菌性溃疡病病菌的
致病基因研究提供了一种方法。
hrcJ 基因在 L． quercina N-5-1 对 107 杨的致病
过程中起着重要作用。类似的情况也出现在水稻条
斑病菌(Xanthomonas oryzae pv． oryzicola)的作用中，
该菌 hrcJ 突变体丧失了在烟草上的 HＲ 激发能力和
对水稻(Oryza sativa)的致病性(赵文祥等，2010)。
L． quercina N-5-1 hrcJ 基因突变并未影响病原菌的
生长和生物膜的形成，但运动能力比野生菌株有所
减弱，表明该基因与病菌某些生长形状的关系较小。
hrcJ 基因在植物病原细菌中高度保守 (Alfano
et al．，2004)，水稻条斑病菌中 hrcJ 基因是 hrp 基因
簇 hrp 转录单元的第 3 个基因，与其他植物病原细
菌的 hrcJ 基因具有高度同源性( Zou et al．，2006)。
水稻条斑病菌的 HrcJ 蛋白与 HrcC 和 HrcV 蛋白互
作，参与 T3SS 的形成，从而决定病菌在非寄主上的
HＲ 和在寄主上的致病性(赵文祥等，2010)。丁香
假单胞菌 ( Pseudomonas syringaease pv． syringae) 的
相关研究结果显示，HrcJ 蛋白位于细菌的内外膜之
间(Büttner et al．，2002; Deng et al．，1998)，是一种
脂蛋白，可能与线粒体外膜和内膜形成有关(He et
al．，1998)。笔者研究表明欧美杨细菌性溃疡病菌
hrcJ 基因与其对 107 杨的致病性有关，这为了解该
病菌的致病机制，寻找和开发新型药物靶标及制定
防控策略提供了依据。但 L． quercina N-5-1中 hrcJ
基因的调控、hrcJ 蛋白在致病性中的作用，以及如何
参与 T3SS 装置的形成等还有待进一步研究。
4 结论
hrcJ 基因决定 L． quercina N-5-1 在寄主 107 杨
上的致病性和非寄主烟草上激发 HＲ; 能调控病原
菌的游动，并未影响病原菌生长和生物膜形成。
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(责任编辑 朱乾坤)
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