全 文 ：第 52 卷 第 1 期
2 0 1 6 年 1 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 52，No. 1
Jan．，2 0 1 6
doi:10．11707 / j．1001-7488．20160107
收稿日期: 2014 － 12 － 29; 修回日期: 2015 － 09 － 01。
基金项目: 国家自然科学基金项目(31370676) ; 教育部“新世纪优秀人才支持计划”(NCET-13-0709)。
* 高彩球为通讯作者。
不同长度 ThVHAc1 基因启动子片段分离及活性分析*
杨桂燕 郭宇聪 张凤娇 赵 震 高彩球
(林木遗传育种国家重点实验室 东北林业大学 哈尔滨 150040)
摘 要: 【目的】VHAc 基因 (V-ATPase c 亚基) 是 V-ATPase 的重要亚基，能响应盐、重金属等胁迫，过表达刚毛
柽柳 ThVHAc1 基因的酵母能提高抗 CdCl2 耐 NaCl 能力。本研究拟通过分离 ThVHAc1 基因不同长度启动子片段并
对其胁迫后活性进行分析，以进一步探讨 ThVHAc1 基因响应 CdCl2 和 NaCl 胁迫的机制。【方法】根据 ThVHAc1 基
因启动子中含有的 Dof 顺式作用元件的分布，将 ThVHAc1 基因上游启动子分为 205 bp( － 1— － 205)，504 bp( － 1—
－ 504)和 781 bp( － 1— － 781)3 个不同长度片段。将这些不同长度启动子片段分别替换 pCAMBIA1301 载体上的
CaMV35S 启动子，以驱动 GUS 基因表达，构建植物表达载体，利用农杆菌介导法转化拟南芥。对 4 周龄的 T4 代转
基因拟南芥分别进行 H2O(非胁迫处理，对照)、100 mmol·L
－ 1 NaCl 和 150 μmol·L － 1 CdCl2 胁迫处理，比较不同转基
因株系的 GUS 染色和 GUS 酶活性。【结果】正常生长条件下，CaMV35S 株系在根、茎、叶中均有 GUS 染色; 3 个启
动子片段转基因株系均能在不同组织观察到 GUS 染色，且在根、茎、叶中有一定差异，但整体上 GUS 酶活性表现为
781 ＞ 504 ＞ 205。NaCl 胁迫下，CaMV35S 株系的 GUS 染色及酶活性与正常生长条件相比无明显变化，但 3 个启动
子片段转基因株系的 GUS 染色及酶活性均显著降低，且 781 株系的 GUS 酶活性分别为 205 和 504 株系的 2. 73 和
2. 07 倍; 同时，3 个启动子片段转基因株系的组织表达特性发生了一些改变，如，504 株系在老叶中表达明显增强，
嫩叶中减弱，根中无明显变化。CdCl2 胁迫下各转基因株系的 GUS 染色和酶活性变化趋势与 NaCl 胁迫相似。
CdCl2 胁迫下，205，504，781 株系的 GUS 酶活性分别为非胁迫时的 52. 4%，57. 9%和 80. 9% ; 胁迫后的组织表达活
性也发生了一些改变，205 株系的 GUS 染色在老叶较深、嫩叶较浅，504 株系则在各部分的表达较均匀，781 株系大
多叶片的 GUS 表达减弱; 但 781 株系的 GUS 酶活性仍然最高，分别为 205 和 504 株系的 2. 67 和 2. 07 倍。【结论】
ThVHAc1 基因启动子片段的驱动活性与长度呈正相关; 各不同片段启动子在根、茎、叶中的 GUS 染色及活性具有
一定差异，体现在不同启动子片段的表达活性具有一定的组织特异性。NaCl 和 CdCl2 胁迫对 ThVHAc1 基因启动子
的驱动能力具有一定影响，胁迫后各启动子片段转基因株系 GUS 酶活性均显著降低，但长片段受胁迫的影响程度
低于短片段。Dof 元件的数量在 3 个启动子片段中依次减少，表明 Dof 元件可能对 NaCl 和 CdCl2 胁迫有一定的调
节作用。同时，NaCl 和 CdCl2 胁迫对 ThVHAc1 基因启动子的组织表达特性具有一定的影响。
关键词: 刚毛柽柳; 拟南芥; ThVHAc1 基因; 启动子; GUS 酶活性; NaCl 胁迫; CdCl2 胁迫
中图分类号:S718. 46 文献标识码:A 文章编号:1001 － 7488(2016)01 － 0055 － 07
Isolation and Activity Analysis of Different Length ThVHAc1 Promoters
Yang Guiyan Guo Yucong Zhang Fengjiao Zhao Zhen Gao Caiqiu
( State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: 【Objective】VHAc is an important subunit of V-ATPase which responds to salt and heavy metal stresses． In
previous studies，we have identified that overexpression of Tamarix hispida ThVHAc1 in yeast can improve its tolerance to
NaCl and CdCl2 ． In present study，we further explore the mechanism of ThVHAc1 in response to NaCl and CdCl2 by
comparing the expression activities of different lengths of ThVHAc1 promoters under stresses．【Method】According to the
distribution of Dof cis-element in the ThVHAc1 promoter，ThVHAc1 promoter was divided into three segments including 205
bp ( － 1 － － 205)，504 bp ( － 1 － － 504) and 781 bp ( － 1 － － 781) ． The CaMV35S promoter in pCAMBIA1301 was
replaced by these three different lengths of ThVHAc1 promoter ( 205，504 and 781 bp )， respectively． And these
recombined constructs were transformed into Arabidopsis thaliana using Agrobacterium-mediated method． The T4 lines of
the transgenic plants at 4 weeks old were treated with 100 mmol·L － 1 NaCl，150 μmol·L － 1 CdCl2 and H2O (non stress
treatment as control) respectively for 30 min to compare the GUS staining and activities of transgenic plants． 【Ｒesult】
林 业 科 学 52 卷
Under normal growing conditions，the root，stem and leaf of CaMV35S seedling showed GUS staining． The GUS staining
was also observed in different tissues of the three transgenic lines expressing promoter segments，and there were some
differences among root，stem and leaf tissues． However，the total GUS activities of these three promoter segment lines were
781 ＞ 504 ＞ 205． Under NaCl stress，the GUS staining and activity of CaMV35S line were not obviously different from that
growing in normal condition ( no stress)，however，the GUS staining and activity of three promoter segments transgenic
lines were significantly decreased，the GUS activity of the 781 line was 2． 73-fold of the 205 line and 2． 07-fold of the 504
line． Meanwhile，the tissue expression of transgenic lines of the three promoter segments were changed，for instance，old
leaves of the 504 line showed increased GUS activity while the young leaves were decreased，and root showed no evident
changes． Under CdCl2 stress，all transgenic lines showed patterns of GUS staining and activities similar to NaCl stress，the
GUS activities of 205，504，and 781 were 52． 4%，57． 9%，80． 9% of those under no stress，respectively． The post-
stress tissue expression were also changed for CdCl2 stress，the GUS staining of 205 line were darker in old leaves and
lighter in young leaves，the GUS staining of 504 line was uniform among different tissues，the GUS staining in most leaves
of the line 781 were lighter． However，the GUS activity of the line 781 was still the highest，2． 67 and 2． 07 folds of the
line 205 and the line 504 respectively．【Conclusion】The driving activity of ThVHAc1 promoter was positively correlated
with its fragment length． The GUS staining and activity of the three promoter segments were different in the roots，stems
and leaves of the transgenic seedlings，indicating a certain extent of tissue specificity of different promoter segments． NaCl
and CdCl2 stresses generated certain influence on the driving activity of ThVHAc1 promoters，the post-stress GUS activities
of the three promoter segments in the transgenic lines were significantly decreased，but the impact was weaker on long
length promoter than on short ones． The number of Dof motif was successively reduced in turn in the three promoter
segments of 781，504，205，indicating Dof motif may play some roles in regulating NaCl and CdCl2 stresses． Meanwhile，
the tissue expression of ThVHAc1 promoter was more or less affected by NaCl and CdCl2 stresses．
Key words: Tamarix hispida; Arabidopsis thaliana; ThVHAc1 gene; promoter; GUS activity; NaCl stress; CdCl2 stress
启动子(promoter)通常是指位于结构基因 5端
上游区域，能与 ＲNA 聚合酶及其转录因子特异结
合、决定基因转录起始的一段特异性 DNA 序列，是
转录控制中心，在转录水平上参与调控下游相应基
因的表达，决定基因的转录与否、转录速度和频率、
转录时间，因此了解目标基因的调控关键在于对其
启动子的认识(Akan et al．，2008; Coca et al．，1996;
Holtorf et al．，1995)。郝彦玲等 ( 2006 )从向日葵
(Helianthus annuus)中分离获得 Hads10G1 基因上游
的启动子片段，GUS 酶活性检测表明其具有种子表
达特异性。聂丽娜等(2008)分离了南瓜(Cucurbita
moschata)PP2 基因启动子序列 NP，缺失分析发现
其转录起始位点上游 437 bp 启动子片段 NPⅡ具有
和长片段启动子 NP 几乎相同的活性，同样能够指
导目的基因在韧皮部特异表达。这表明不同基因发
挥功能的启动子片段长度可能不同，不同长度的启
动子片段可能具有不同的表达活性。因此，对某一
基因启动子的不同长度缺失片段进行研究，有利于
更全面地了解该目的基因的功能以及调控机制; 对
不同胁迫条件下启动子表达活性进行分析，可以预
测目的基因响应胁迫时的表达特性。
V-ATPase c 亚基是 V-ATPase V0区的主要部
分，参与质子通道的形成，负责质子的转运，且对
V-ATPase V1 -V0 的装 配必 不 可少 ( Dietz et al．，
2001)。以往研究表明，植物 V-ATPase c 亚基参与
植物的逆境胁迫应答。如黄瓜 ( Cucumis sativus) 3
个 CsVHA-c 基因不仅具有组织表达差异，且对铜和
镍应答也不完全一致，CsVHA-c1 和 CsVHA-c2 具有相
似的表达模式，在雄蕊和叶中的表达最高，CsVHA-c3
则与二者相反; CsVHA-c1 在铜和镍胁迫下被显著诱
导，CsVHA-c3 则仅被镍胁迫诱导，而 CsVHA-c2 能对
多种重金属胁迫做出应答，但被铜胁迫诱导最明显
(Kabaa et al．，2014)。Northern 分析表明，冰叶日中
花(Mesembryanthemum crystallinum)液泡膜V-ATPase
c 亚基在 NaCl 胁迫下的转录水平持续增加，且这种
表达是由于 NaCl 胁迫下的离子转运而不是渗透伤
害引起的(Tsiantis et al．，1996)。珍珠粟(Pennisetum
glaucum) V-ATPase c 亚基基因 (PgVHA-c1)在珍珠
粟的不同生长发育时期具有不同的表达，且响应于
外界胁迫的刺激 (Tyagi et al．，2006)，将该基因与其
启动子相连转入烟草(Nicotiana tabacum)发现具有
组织表达特异性 (Tyagi et al．，2005)。
前期研究表明，刚毛柽柳 ( Tamarix hispida )
ThVHAc1 响应干旱、NaCl、重金属等胁迫，在其根、
茎、叶中存在不同的表达模式，过表达 ThVHAc1 能
提高重组酵母多重抗性(Gao et al．，2011)。为进一
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第 1 期 杨桂燕等: 不同长度 ThVHAc1 基因启动子片段分离及活性分析
步研究 ThVHAc1 基因启动子的组织表达特性及其
对胁迫的应答情况，本研究对该基因启动子的 3 个
长度缺失片段在 NaCl 和 CdCl2 胁迫前后的表达活
性进行分析，以期探讨不同长段 ThVHAc1 基因启动
子对 NaCl 和 CdCl2 胁迫的应答情况。
1 材料与方法
1. 1 植物材料处理
根据染色体步移方法克隆获得的 ThVHAc1 基
因启动子中含有的 Dof［DOFCOＲEZM，核心元件为
AAAG，与植物的多重抗逆响应相关 ( Dong et al．，
2007; Guo et al．，2009)］顺式作用元件的分布，将
ThVHAc1 基因 上 游 启 动 子 分 为 205 bp ( － 1—
－ 205)，504 bp ( － 1— － 504 ) 和 781 bp ( － 1—
－ 781)3 个不同长度片段。将这些不同长度启动子
片段分别替换 pCAMBIA1301 载体上启动 GUS 基因
表达的 CaMV35S 启动子，将这些启动子片段与 GUS
基因融合构建植物表达载体 pThVHAc1∷GUS，利用
根癌农杆菌( Agrobacterium tumefaciens) EHA105 介
导的 蘸 花 法 转 化 拟 南 芥 ( Arabidopsis thaliana )
(Clough et al．，1998; Zheng et al．，2012)，筛选至 T4
代。同时，将 pCAMBIA1301 载体转化拟南芥作为
阳性对照。将 T4 种子于 4 ℃ 春化 3 天，用 NaClO
表面消毒后播种于 1 /2MS 培养基上培养 7 天，转移
至灭菌土中生长 4 周后，分别用 100 mmol·L － 1
NaCl、150 μmol·L － 1 CdCl2 浇灌处理，30 min 后取整
个植株进行 GUS 染色( Zheng et al．，2013)，利用实
体显微镜进行观察和照相，并测定 GUS 酶活性。构
建 pThVHAc1∷GUS 引物见表 1。
表 1 构建 pThVHAc1∷GUS 表达载体的引物
Tab． 1 The primers for constructed pThVHAc1∷GUS vectors
重组载体 Ｒecombinant vector 5 －引物 5-primer 3 －引物 3-primer
pThVHAc1-781∷GUS 5-ATGCTCTAGATATCCTCCTCAATCCATGAAC-3
pThVHAc1-504∷GUS 5-ATGCTCTAGATATCCATCTCAAATAAAGCG-3
pThVHAc1-205∷GUS 5-ATGCTCTAGATCGTCAGATCACCATAC-3
5-ATGCCCATGG
TATAGGAGAAATAA
GGTGGAAG-3
1. 2 GUS 酶活性测定
4-MU标准曲线绘制:用反应终止液将 1 mmol·L － 1
MU 母液稀释为 0 ～ 10 μmol·L － 1系列标准液，测定
荧光强度，绘制荧光强度 － 溶液浓度线性曲线 (激
发光波长 365 nm，发射光波长 455 nm)。
牛血清白蛋白(BSA)标准曲线绘制:配制 10 mg·
mL － 1 BSA，逐级稀释得到 5 个浓度梯度 BSA 标准液，
分别测定吸光度值。绘制蛋白吸光度(OD595 ) －蛋白
浓度标准曲线。
GUS 酶活性测定(Zheng et al．，2013):取约 0. 1
g 液氮研磨材料于 2 mL 离心管中，加入 600 μL 提
取液; 3 000 r·min － 1、4 ℃ 离心 10 min，取上清液用
考马斯亮蓝法测定蛋白含量，取 50 μL 上清液加入
2 mmol·L － 1 4-MUG ( 4-methylumbelliferyl-β-D-
glucuronide，4 － 甲基伞形酮 － β － D － 葡萄糖醛酸
苷)溶液充分混匀，立刻取出 50 μL 加入 950 μL 终
止液停止反应，作为酶促反应 0 点; 然后分别在反
应 5，10，15，20，30，45，60 min 后取出 50 μL 反应
液，转入 950 μL 反应终止液; 测定激发波长 365
nm、发射波长 455 nm 下的各点荧光值。
2 结果与分析
2. 1 不同长度启动子片段的植物表达载体构建
将克隆获得的 ThVHAc1 基因 781 bp 长启动子
进行顺式作用元件分析( http: / /www． dna． affrc． go．
jp /PLACE /)，发现该启动子片段含有多种元件，如
AACACOＲEOSGLUB1，AMYBOX2， DOFCOＲEZM，
DGATABOX， GT1CONSENSUS， GT1GMSCAM4，
IBOXCOＲE 等。鉴于已有报道证实 DOFCOＲEZM
(简写为 Dof)元件与抗逆相关，及其在 ThVHAc1 基
因启动子上的数量和分布，将 ThVHAc1 启动子分为
3 个长度不同的片段。 － 1— － 781 区域(简写为
781 bp 片段)含有 5 个 Dof motif; － 1— － 504 区域
(简写为 504 bp 片段)含有 3 个 Dof motif; 而 － 1—
－ 205区域(简写为 205 bp 片段)，不包含 Dof motif
(图 1a)。将这 3 个片段分别置换 pCAMBIA1301 载
体上的 CaMV35S 启动子，构建植物表达载体 (图
1b，c)。
2. 2 正常生长条件下 ThVHAc1 启动子片段表达
活性比较
GUS 染色结果(图 2)显示:正常生长条件下，野
生型拟南芥(wild type，WT)为阴性对照，几乎染不
上色;空载体转化株系(CaMV35S)在根、茎、叶中均
有 GUS 染色;205 bp 片段转基因植株的染色稍淡于
504 bp 片段，而 781 bp 染色则要深于 2 个短片段。
同时，染色结果(图 2)还表明不同长度片段的表达
特性不完全相同:205 bp 和 504 bp 片段整个植株的
GUS 染色比较均匀，表明植株的各个器官具有相似
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林 业 科 学 52 卷
图 1 不同长度启动子片段及载体构建
Fig． 1 The different promoter segments and recombinant vector structure
a． 启动子片段特征示意; b． 启动子片段插入 pCAMBIA1301 载体的结构示意; c． 载体构建大肠杆菌 PCＲ 检测。
a． Promoter segments differed by Dof motif; b． The pCAMBIA1301 construct inserted with different length ThVHAc1 promoter segments; c． PCＲ
analysis of the Escherichia coli (DH5ɑ) containing recombinant vectors．
的 GUS 表达活性;781 bp 片段转基因植株 GUS 染
色则在各个叶片中的表达差异较大，其中老叶染色
较深，而嫩叶染色则较浅。
为了进一步测定各转基因株系的 GUS 酶活性，
绘制了 BSA 和 4-MU 标准曲线，Ｒ2 分别为 0. 992 4，
0. 989 9(图 3)，达到了测定要求。以此为基础测定
GUS 酶活性，结果显示 WT 几乎检测不到 GUS 酶活
性，而其他 4 个转化株系均有 GUS 酶活性，3 个启动
子片段的 GUS 酶活性依次为 781 ＞ 504 ＞ 205 (图
4)，表明随着 ThVHAc1 启动子长度增加，其表达活
性增强。
2. 3 NaCl 胁迫下 ThVHAc1 启动子片段表达活性
比较
与正 常 生 长 条 件 相 比，NaCl 胁 迫 下 除
CaMV35S 株系的 GUS 染色及酶活性无明显改变
外，各启动子片段转基因株系的 GUS 染色和酶活
性均显著降低。205，504 bp 转基因株系的净 GUS
酶活性分别仅为对应非胁迫时的 40. 9%，46. 3%，
而 781 bp 转基因株系具有相对较高的启动子表达
活性(为非胁迫时的 64. 6% )，分别为 205，504 bp
转基因株系的 2. 73 和 2. 07 倍 (图 2，4 )。这表明
相同 NaCl 胁迫对长片段表达活性影响要弱于短片
段。Dof 元件的数量在 3 个启动子片度中依次减
少，表明 Dof 元件可能对 NaCl 胁迫有一定的调节
作用。
同时，各启动子片段转基因株系的组织表达特
性也发生了一些改变。NaCl 胁迫后，205 bp 转基
因株系 GUS 染色在叶中变化较明显，在根中变化不
明显; 504 bp 转基因株系则在老叶中的染色和表达
明显增强，而在嫩叶中减弱，根中变化不明显;
781 bp转基因株系的 GUS 染色也受到抑制，为非胁
迫时的 67. 6% (图 2，4，5)。
2. 4 CdCl2 胁迫下 ThVHAc1 基因启动子片段表达
活性比较
CdCl2 胁迫下各长度片段转基因株系的 GUS 染
色和酶活性变化趋势与 NaCl 胁迫相似。同样，与非
胁迫相比，CdCl2 胁迫后各长度片段表达活性显著
降低，但其活性稍高于 NaCl 胁迫。205，504，781 bp
转基因株系的净 GUS 酶活性分别为非胁迫时的
52. 4%，57. 9%，80. 9%。相对于同一片段来说，
CdCl2 胁迫后的组织表达活性也发生了一定的改
变: 205 bp 转基因株系的 GUS 染色在老叶较深，嫩
叶较浅; 504 bp 片段则在各部分的表达较均匀;
781 bp 转基因株系则更多叶片的 GUS 表达减弱。3
个片段比较发现，781 bp 转基因株系 GUS 酶活性仍
然最高，分别为 205，504 bp 的 2. 67，2. 07 倍(图 2，
4，5)。
3 结论与讨论
3. 1 结论
本研究通过对 ThVHAc1 启动子 781，504，205 bp
片段在 NaCl 和 CdCl2 胁迫下的表达活性进行分析，
探讨 ThVHAc1 启动子片段应答逆境胁迫的表达模
式。结果显示，ThVHAc1 基因 3 个不同长度启动子
片段在 NaCl、CdCl2 胁迫后整株总表达活性减弱，但
长片段活性变化小于短片段; 同时胁迫后各启动子
片段的组织表达活性发生改变。这表明 ThVHAc1
可能参与 NaCl、CdCl2 胁迫的调控，启动子的表达活
性与其长度有一定的关系。
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第 1 期 杨桂燕等: 不同长度 ThVHAc1 基因启动子片段分离及活性分析
图 2 不同长度 ThVHAc1 启动子片段转基因拟南芥 GUS 染色
Fig． 2 The GUS staining of transgenic Arabidopsis thaliana with different ThVHAc1 promoters under NaCl and CdCl2 stresses
WT:野生型拟南芥; CaMV35S:CaMV35S∷GUS 转基因拟南芥; 205:ThVHAc1 启动子 － 1— － 205 区段驱动 GUS 基因转化拟南芥; 504:
ThVHAc1 启动子 － 1— － 504 区段驱动 GUS 基因转化拟南芥; 781: ThVHAc1 启动子 － 1— － 781 区段驱动 GUS 基因转化拟南芥。
WT:Wild type; CaMV35S:CaMV35S∷GUS transgenic lines; 205:The transgenic A． thaliana with the － 1— － 205 ThVHAc1 promoter; 504:The
transgenic A． thaliana with the － 1— － 504 ThVHAc1 promoter; 781: The transgenic A． thaliana with the － 1— － 781 ThVHAc1 promoter．
3. 2 讨论
研究启动子的表达特异性能反映其目的基因的
调控表达方式，探讨逆境胁迫下的表达活性能体现
基因对逆境的响应能力，不同片段或区域的启动子
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林 业 科 学 52 卷
图 3 BSA 标准曲线和 4-MU 标准曲线
Fig． 3 Calibration curves of BSA and 4-MU
图 4 不同启动子片段转基因拟南芥株系的 GUS 酶活性
Fig． 4 The relative GUS activity of different length ThVHAc1 promoters
图上不同字母表示差异显著 ( P ＜ 0. 05 )。下同。Different letter
means the significant difference (P ＜ 0. 05) ． The same below．
表达活性分析可以得知启动子发挥作用的能力
(Nikolic＇ et al．，2010)。以往研究也表明，VHAc 基因
启动子的表达具有组织特异性，且与胁迫应答相关。
图 5 不同启动子片段转基因拟南芥株系不同组织的 GUS 酶活性
Fig． 5 The GUS activities in different tissues of different length ThVHAc1 promoter segments transgenic Arabidopsis thaliana
如，Padmanaban 等(2004)对 2 个拟南芥 VHA-c 启动
子的研究表明，拟南芥 VHA-c1 的表达响应于光照和
黑暗刺激时具有组织表达特性，在展开子叶、黄化苗
的子叶下胚轴、根的伸长区能表达，ＲNAi 干扰后
VHA-c1 的表达和生长受到限制; VHA-c3 则与之相
反，启动子驱动的 GUS 酶活性检测结果表明在幼苗
的大多数组织和器官中均不能表达，但在根冠却被
强烈诱导，ＲNAi 干扰后其根长减小、NaCl 耐性减
弱。珍珠粟 V-ATPase c 亚基基因的启动子也具有
明显的组织表达特异性，其主要在茎皮毛和花器官
等表达，同时参与胁迫调控响应 ( Tyagi et al．，
2005)。本研究中的 205，504，781 bp 3 个启动子片
段在拟南芥中的表达也存在组织特异性，且这种特
异性也表现出与 NaCl、CdCl2 胁迫相关。正常生长
条件下，3 个启动子片段转基因株系在根、老叶、嫩
叶的 GUS 染色深浅及 GUS 酶活性大小具明显差
异，如 205 bp 片段在根、老叶、嫩叶的 GUS 酶活性分
别为 14. 7，63. 5，39. 6 pmol·mg － 1 min － 1，差异显著。
在 NaCl、CdCl2 胁迫后，3 个转化株系的 GUS 酶总活
性降低，在组织之间也体现了显著的差异，且 2 种胁
迫之间也存在差异，尤其是各组织中活性变化不一
致，205 bp 片段启动子在 CdCl2 胁迫下老叶中的
GUS 表达活性增强，504 bp 则在 NaCl 胁迫后其老叶
GUS 酶活性增强(图 2，4，5)。
一些研究表明，启动子中的元件直接关系目的
基因的表达和功能，如，Cytc-2 的表达必须要含有 1
个 G-box 和 ACGT 元件的区域或者片段才能实现，
ACGT 的突变使得其表达完全丧失，而 G-box 突变
会降低拟南芥地上部分的表达和毁灭根及环境因子
刺激时的表达，上游启动子定位于Ⅱ类元件是大量
表达的关键，特别是繁殖器官 ( Welchen et al．，
2009)。本研究结果显示，3 个不同长度片段启动子
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第 1 期 杨桂燕等: 不同长度 ThVHAc1 基因启动子片段分离及活性分析
在正常生长条件、NaCl、CdCl2 胁迫下的表达活性具
有差异，胁迫后的表达受影响程度不同。3 个启动
子片段的长度划分依据为 Dof 元件的数量和分布，
781 bp 片段包含的 Dof 元件数量最多(5 个)，其活
性也最高; 其次是 504 bp 片段，包含了 3 个 Dof 元
件; 但 205 片段不含 Dof 元件，其依然具有启动子
表达活性。表明 Dof 元件可能影响 ThVHAc1 基因启
动子片段的表达活性，但其表达活性还与其他元件
有关。因此后续试验中，将通过突变 Dof 元件以分
析 Dof 元件对 ThVHAc1 基因启动子表达活性的影
响，并对其他元件对 ThVHAc1 基因启动子表达活性
的影响进行分析。总之，本研究分析比较了正常生
长和 NaCl、CdCl2 胁迫条件下 ThVHAc1 基因启动子
表达活性差异，为进一步研究 ThVHAc1 基因抗逆机
制奠定了基础。
参 考 文 献
郝彦玲，朱本忠，栾春光，等 ． 2006． 向日葵种子特异性启动子 Ha
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(责任编辑 徐 红)
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