全 文 ：林业 科学 研 究
 ,






















群众杨

无性系耐盐悬浮细胞系的建立
和体细胞变异体完整植株的诱导 ‘
张绮纹 张望东
摘要 本试验 以群众 杨
 号为试材 , 通过耐盐 胁迫悬 浮培 养建立耐盐 悬浮细胞系 , 经 愈伤组
织成功培育 出耐






。



编的群众杨体细胞变异体的完整植株 。 实验表明 ,

培养基附
加








,
一
、






 和













 的

培养基能较好地 获得松脆 、 易分
散 的愈伤组织 。 液体以

培养基 只附加







,
一
的


为最好 , 附加氨基酸有益 于悬浮
细 胞的正常 生长 。 还对 悬浮培养细胞的有关参数进行 了测定 。 耐盐悬 浮细胞培养实验结 果表 明



 对细胞生 长有抑制作用 , 并随着


 升高而加强 。 对 获得的耐
编

编各水平


 悬 浮细
胞经高 密度植板 , 都能形成愈伤组织 。 耐盐愈伤组织诱导只获得 耐
编

编


 的不 定芽 , 高于

编


 未 能诱导出不定芽 , 说 明高浓度


 对芽组织分化有 明显 的抑制作用 。 不定根 分化对



反应 非常敏感 , 只在 耐

。和



。


 浓度培养基诱导出不定根 。
关链词 群众杨
 、 耐盐细胞悬浮培 养 、 耐盐细胞系 、 耐盐体细胞变异体植株
林木的细胞悬浮培养的研究起步较晚 。 目前 , 利用悬浮细胞培养再生植株只 限于美国榆











 , ,




’
、 欧 洲七 叶 树
八








 !

,



、 花 旗 松






























,
、 缘毛杨

















仁

和小叶杨
尸




,




 

〔‘
树
种有成功的报道 。 而利用建立的细胞悬浮系定向筛选变异体的工作则很 少 。


年美国试验
站
 利用体细胞变异体成功筛选 出杨树抗病新无性 系 。



年加拿大




等〔
〕选出了抗
除草剂








的细胞系 , 诱导出的不定芽能在含除草剂的培养基上生长 , 但都未能生根 。
依据前人的经验 , 对群众 杨












,
















‘







’ 一

无
性系的耐盐细胞悬浮培养技术进行了研究 , 并利用建成的悬浮细胞系对耐盐体细胞变异体又
进行 了筛选 , 成功地培养出耐

。一



。


 体细胞变异体的完整植株 。

试验材料和方法

 试验材料
取
年生群众杨
 号的根萌休眠枝条 , 经水培生成的嫩茎为外植体 。

 试验方法





愈伤 组织 的诱导和继 代培养 将嫩茎经
 酒精 、






 消毒后 , 切成


的
小段 , 接种在脱分化培养基上 ,



后进行继代培养 。 脱分化激素配 比见表
。





耐盐悬浮培养 将松脆愈伤组织按每瓶约

量转入



三角瓶中 , 用镊子夹碎 ,
加入
 一


各种液体培养基
表

, 在室温
 士
‘
、 散射光条件下 , 进行振荡

。 第



一

一

收稿 。
张绮纹研究员 , 张望东
中国林 业科学研究院林业研 究所 北京
。。。

。
, 本文 系国家“八五 ”攻关 “杨树造纸材和纸浆材良种选育”部分内容 。
林 业 科 学 研 究
卷
表
愈伤组织诱导和液体供试培养基
单位





愈伤组织诱导培养基
液体悬浮供试培养基

编号
,
一
 !



。





备 注编号
,
一
 !一




,
梦
擎







一 一 一









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基本培养基






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一 耀簇养基





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爵案甭露鬓集
 ! ∀ 一 一 1 . 00 3 0 培养基成份
M 6 1.00 一 0. 1 0 一 3 0
代转速为 130 r/m in , 以后 转速调至 120 r/m in 。 每次继代前将悬浮液静置 10 m in , 等细胞沉淀
后倾去上层旧液 , 以 1 : 1 比例换入新液 。 随着继代培养 , 愈伤组织逐渐散碎 , 用 10 目和 20
目过滤 。 滤液再在 30 r/m in 离心约 5 m in , 将收集的单细 胞和小细胞团 以 1 : 5 比例加入新
液 , 继续悬浮培养 。 供试液体培养基见表 1 。
建立耐盐悬浮细胞系 , 采用直接 多步选择法 [z] , 以 。. 5 % 。N a CI 为梯度起点 , 逐级对悬浮细
胞进行选择培养 , 每个水平继代培养 3次 。
1
.
2
.
3 不定 芽的诱 导和植株再生 将耐 N aCI 悬浮细胞分别放在含相应 N aCI 浓度的固体培
养基上 (Z M 十 N aCI )进行高密度植板闭 , 形成愈伤组织后再进行不定芽分化诱导和 不定根的
诱导 。
诱导 不定芽分化培养基的大量元素减半即采用 1/2 M S , 激素配比为 :M fl (1/2 M S + 无激
素) 、 M f Z ( l / Z M S + 0 . 4 m g / L B A ) 和 M f3 (l/ZM S + 0. 45 m g /L 6一 B A P + 0 . 0 4 m g / L N A A ) 。
生根培 养基 (R M )为 :R M I (1/ZM S + 0. 2 m g /L IB A ) 、 R M Z ( l / Z M S + 0 . 0 2 m g / L I B A ) 和
R M 3 (1 /ZM S + 0.0 2 m g /L N A A ) 。
2 试验结果与分析
2.1 松散型愈伤组织获得和脱分化培养基的筛选
随着生长素 2 , 4 一 D 浓度的升高 , 外植体在茎两切面的愈伤组织出现 的时间提前 , 一般需
要 7一g d 。 M 6 出现最早 , 表面很快出现白色絮状物 , 随后褐化死亡 ;M l 诱导的愈伤出现较慢 ,
且近白色 、 质密坚硬 。 M Z 、 M 3 、 M S 上诱导愈伤组织为淡黄色 、 表面有乳 白色颗粒物 , 生长快 ,
质地较紧密 , 但愈伤组织在表面中央常常出现疏松的白色絮状物 , 这些絮状物不断增多而且还
有褐化现象 。 在显微镜下观察这些絮状组织为长型细胞 , 并且高度液泡化 , 为不能再分化的成
熟细胞 。 这种情况在 M S 上最为严重 , M Z 居中 , M 3 上最轻;M 4 上诱导的愈伤为淡黄色或黄绿
色 , 表面有很多小凸起 , 增殖快且较松脆 。 继代培养 M 4 上诱导的愈伤组织能继续正常增殖 , 松
脆型愈伤组织随继代增多 。 因此 M 4 被确立为培育愈伤组织最好培养基 。
2
.
2 耐盐悬浮细胞系的建立
2. 2. 1 液 体悬浮培养基的 筛选 不同悬浮培养基经 10 0 目过滤后收集的细胞 , 在显微镜下观
测 (见表 2)。 由表 2 可以看出 , 附加 N A A 的 L M I 培养基的管状细胞数量增加 ;附加 Ki ne tin
的 L M Z 培养基的液泡化成熟细胞数量增加 ;只有附加 2 , 4 一 D 和 40 0 m g /L 谷氨酸 、 1 50 m g / L
天冬氨酸 、 50 m g / L 精氨酸的 L M 3 培养基能形成良好的细胞系 。 试验还说明附加美国榆悬浮
期 张绮纹等:群众杨 39 无性 系耐盐悬浮细胞系的建立和体细胞变异体完整植株的诱导 397
培养基的 L M 4 并不适合群众杨进行悬浮细
胞培养 。
2
.
2
.
2 生 长参数 的 m.l 定 将经 200 目过滤
和离心所获得的悬浮细胞 系 (由单细胞和含
4~ 2 5 个细胞的小细胞 团组成) , 按 1 : 5 换
新鲜培养液 , 再在转速为 11o r/m in 条件下 ,
培养两代的悬浮细胞生长趋于 平稳后 , 测定
悬液中细胞的增殖情况 。 具体方法从略 。
表 2 显微观测(120 x )培养基中细胞
(单位 :% )
培养基号 管状细胞 液泡化细胞 死细胞 细胞碎片
多中少I M I
I M Z
L M 3
I M 4
::
.
;
23.0 12.0
27.7 14.5
11.0 5.0
24.0 17.0 很多
划工d5.
二 15 卜遏 入 。。 . 。, db .乡 }又 ‘ 一 ~ ~ 『“ ~ ~ /全‘叮 \ / 厂产侧 ! 卜二/鬓5卜一场胞生长曲线界 l
4。 9
4
.
7
0 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4
细 胞生长 周期 (d)
图 1 悬浮细胞生长及 pH 变化 曲线
由图 1 可以 看出 , 杨树悬浮细胞系也
同其它植物建立的悬浮细胞系一样 , 在一
个生长周期中存在着延迟 、 对数生长 、 直线
生长 、 减慢 、 静止 5 个特征时期 。 细胞密度
起始时约 4.8 X l少 个/m L , 培养一个周期
(14 d )后增殖为 1.7 x 10s 个 /m L , 平均每
个细胞分裂 3一4 次 。 从继代开始 , 单数天
抽取部分 悬浮液测 pH 值 , 每次取两个样
品 , 取平均值(图 1) 。
对照细胞生长动态曲线和 pH 变化曲
线 (图 l) 可以看出 , 在一个生长周期中 , 当
悬浮液 pH 值迅速下降时 (即更液后 的第 1~ 3 d) , 细胞处于缓慢增殖的延迟期 。 当 pH 值开始
升高到 5. 2 时 (约在第 6 天 ) , 细胞的增殖速度也显著加快 , 随 pH 升高进入直线生长期 ;当 pH
值开始升高到 5 .3 时 (约在第 1 d ) , 开始迅速下降 , 细胞增殖减慢 , 并进入生长的相对静止期 。
2
.
2
.
3 耐 N aCI 悬浮细 胞 系的获得 为了解不同浓度 N aCI 对细胞生长的影响 , 在继代时 , 分
别将 1 m L 细胞体积的细胞量转入含 0.5% 。、 1 . 0 % 。、 1 . 5 % 。 N a CI 浓度水平的 40 m L 液体培养
基中 , 一个生长周期后 , 离心 s m in (2 00 r/m in) , 测定下层沉淀细胞的体积 。
从图 2 中可以看出 , 细胞分裂随 N aCI 浓度升高而减慢 。 与对照相 比 , 0 . 5 % 。 N a CI 使细胞
.JZ,1
(闷日)杯挂是界
体积减少了约 26 % ;1.0 % 。 N a CI 浓度使细胞体
积减少 了 63 % , 只有少 部分 细胞发生了分 裂 。
在 1. 5% 。 N a CI 悬浮液 中的细 胞体积与 1.0% 。
N a C I 几乎 没 有 增 加 。 在继 代 发 现 含 0. 5% 。
N a CI 悬液 中的细胞 生长 逐渐 与对 照接近 , 含
1.0 %0 和 1. 5% 。 N a CI 悬液逐渐变褐 , 而且充满
细胞碎片。
目前已获得 3.0% 。~ 6 . 0 % 。各 N aCI 水平的
悬浮细胞系见 图版 1一 1 , 2 。
2
.
3 耐盐细胞变异体植株再生
2.3.1 衬盆愈伤组 织再形 成 为了从耐 N aCI
悬浮细胞 系获得愈 伤组织块 , 将耐 不 同水 平
O ‘ra 曰一一一‘一- - - ~ ‘- - ‘
O U · 5 1
.
0 1
.
5
图 2
N aC I浓度 (编 )
不同 N aC I浓度对悬浮细胞生长影响
林 业 科 学 研 究 8 卷
N aCI 直线 生长期的悬 浮细胞进行 植板 。 植板 用的 固体培 养基 (Z M )为:M S + 。. 45 m g /L
2 , 4 一 D + 。. l m g / L Ki n et in e + 25 9 / L 蔗糖 , 附加谷氨酸 , 天冬氨酸和精氨酸 , p H 调至 5.8( 植
板过程略)。
植板 2一3 周后 , 在琼脂表面可观察到均匀分布的小于 1 m m 颗粒 。 继续培养 4 周后 , 琼脂
表面长满约 1一3 m m 厚的愈伤组织 , 颜色也渐变为淡黄色至黄绿色 , 约 40 d 后耐盐 3编和 6% 。
的悬浮细胞系都形成一层绿色的愈伤组织 (图版 I一 3 ) 。
2
.
3
.
2 耐盐 细胞 系不定 芽的诱 导分 化 将耐盐 3% 。~ 4 %0 愈伤组织接种到 M fl 上 , 愈伤组织
很快停止 生长 , 而且黄色加深 , 表面干燥 , 约 4 周后生出许多不定根 , 但未见不定芽的产生 ;接
种到 M fZ 和 M f3 上的愈伤组织颜色逐渐由原来的淡黄色变为黄绿 , 最后变为绿色 , 3 ~ 4 周后
表面出现红褐色芽点 , 尤其 M f3 不但能诱导 出芽点 , 同时也能促进愈伤组织增殖 , 减少愈伤组
织的软化和 死亡 。 再将 M f3 与 M f3 + N aCI 培养基同时做分化培养 比较见表 3 。
表 3 耐 N aCI 悬浮细胞系的分 化
含 N aC I量 (编)
接种
块 数
百分率
(% )
接种
块数
百分率(% ) 接
种
块数
百分率(% )
M f3
M f3 + N aC I {: :;
’
2
{ : : ;
’
7
; : : : :
耐盐细 胞系在分化培养基 M f3 和 M f3 + N aCI 上 的分化率相差不大 , 说明在细胞系水平
上进行选择的效率是比较高的 。 同时也可以看出 , 随着 N aCI 浓度的升高 , 耐盐细胞系的分化
能力下降 。 其结果只有耐盐 3% 。 、 3 . 5 % 。和 4.0% 。愈伤组织在 M f3 + N aCI (3 %0 ~ 4% 。 ) 培养基上
分化出不定芽 , 不定芽分化率为 36 % 、 32 % 、 21 . 7 % ( 图版 I一 4 ) 。
2
.
3
.
3 耐盐 体细 胞变异休 完整植株的诱导 当耐盐 3.0% 。~ 4 . 0 % 。分化出不定芽长到 1. 0~
1.5 Cm 高时切掉 , 将不定芽基部转入含相应 N aCI 浓度的不同生根培养基进行培养 。 培养 3 周
其结果见表 4 。
表 4 诱导耐盐不定芽生根
含 N aC I量 (% 。)
3
.
0
生根
株数
百分 率
(% )
00八曰no11,工no?曰,.五,自,’,孟一0八曰O,11OC†,口,’月比几Jg一月,0On曰1走11.几R M I
R M Z
R M 3
试验结果表明 R M I、 R M Z 、 R M 3 生根培养基上分化的耐盐 3% 。一 3.5% 。不定根结果相似 。
以 R M 3 效果最好 , R M I 次之 , R M Z 最差 。 耐盐 3% 。在 3 种培养基上的诱导生根率为 40 % 、
3 0 % 和 20 % , 但随盐梯度增加到 3. 5% 。时分化生根率降低 50 % 。 而耐 N aC1 4% 。不定芽未诱导
生根 。 实验发现生根培养基附加 N A A 量大于 0.02 m g /L 时 , 不定根分化受到抑制 ;R M Z即
0.02 m g/L IB A 的生根培养基要比 R M 30 .02 m g /L N A A 出现生根时间晚一周 (图版 I一 5 ) 。 目
前 , 已栽植成活 5 株耐盐变异体植株 (图版 I一 6 ) 。
期 张绮纹等:群众杨 39 无性系耐盐悬浮细胞系的建立和 体细胞变异体完整植 株的诱导 39 9
结语 与讨论
试验将群众杨 39 进行体细胞悬浮培养 , 产生耐盐 3% 。~ 6 % 。细胞系和同级水平的愈伤组
;进一步诱导出耐盐 3% 。~ 4 % 。的不定芽;再进行诱导获得耐 N aCI 3.0% 。~ 3 . 5 % 。的完整植织株
实验还发现 :不 同的激素配比 , 诱导 出的愈伤组织的颜色 、 质地 、 生长速度不 同。 培养基
M 4 能较好地诱导 出松脆型愈伤组织 , 并随继代次数增加 , 愈伤组织产量也增多 。 液体培养基
激 素以只附加 0.5 m g/L 的 2 , 4 一 D 为最好 , 另外附加适量氨基酸有助于细胞的正常分裂和增
殖 。 悬浮细胞在一个周期内平均每个细胞分裂 3一4 次 。 其生长曲线与悬液 pH 值变化呈明显
相关 , 当 pH 偏低时 , 正是细胞分裂处于相对静止的时期;pH 升高后 , 细胞增殖速度也随之加
快 , 并进入直线增长期 。 这种相关性现象与其它悬浮系细胞生长中所得的结论是一致的 。
耐盐愈伤组织经过继代形成不定芽 , 高浓度 N aCI 对芽组织分化有明显抑制作用 , 本试验
只获得耐 N aCI 3.0% 。~ 4 . 0 % 。的不定芽 。 分化不定根时 N aCI 反应也非常敏感 。 常规土壤中含
N aCI 超过 3.0% 。时杨树不能正常生长 , 而本试验经细胞工程诱导 N aCI 3.0% 。和 3.5% 。不定根
能形成完整植株 。
树木耐盐机理是一个 比较复杂的问题 , 但一般认为在高水平选择压力下 , 经过较长时间的
选择培养 , 就能在遗传上发生变异细胞 , 这种变异可能是稳定的 。 本试验经 n 个月培养形成耐
盐细胞系并诱导出耐盐 3.。% 。一3.5% 。的完整植株近 40 株 , 其中有 20 株 已移到含盐的土壤中
去 。研究认为这种植株是体细胞无性 系变异体植株 , 推测其中是否有 自发显性的突变细胞形成
植株 , 需作进一步的遗传分析才能确定 。
参 考 文 献
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林 业 科 学 研 究 8卷
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林 业 科 学 研 究 8卷
E s ta b lis h m e n t o f S a lin e 一 t o l e r a n t C e l l L i n e s o f P op u l u s
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