全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
" $ % # 年 # 月
林 业 科 学
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6/7"%$5%%8$89:5%$$%;8<==5"$%#$#$!
收稿日期" "$%! >$# >$%# 修回日期" "$%! >$= >%@$
基金项目" 国际竹藤中心基本科研业务费专项资金项目%%#?"$%!$$=#%#?"$%?$$@& #国家自然科学基金项目%?%<$$!!8& #国家科技支撑计
划课题%"$%!d,I$
毛竹 !&.#:基因的表达与功能!
董丽莉B赵韩生B王丽丽B孙化雨B娄永峰B高志民
%国际竹藤中心B竹藤科学与技术重点开放实验室B北京 %$$%$"&
摘B要!B(目的) .#5:D#:KJ%.#:&基因在植物根和茎顶端细胞不均等分裂形成基本组织的过程中发挥着重要
调控作用$ 通过分析毛竹中 .#:同源基因 !&.#:的结构特点!研究该基因的组织表达特异性!分析激素 K,? ’,d,
以及干旱’*E’0等非生物胁迫处理对该基因的表达影响!利用在拟南芥中过量表达 !&.#:!初步鉴定其功能!以期
为竹子分子育种提供基因资源$ (方法) 采用生物信息学的方法!在毛竹数据库%dENT//KId&中获得 .#:同源基
因序列和上游调控序列!分别利用 &L76OW和 D0E4U’,M)在线软件分析基因结构特点及其上游调控序列所含作用元
件!采用实时荧光定量 D’M技术分析基因在不同组织中的表达性!以及 K,? ’,d,’干旱和 *E’0等非生物胁迫处理
后的表达变化!构建 !&.#:基因的正义9反义表达载体!转化拟南芥!通过分析转基因植株的表型来判断基因的功
能$ (结果) 从毛竹中获得 .#:同源基因 !&.#:%登录号"hD$@区分别为 "?=!%?< TL!编码区 % @"@ TL$ 编码区对应的基因组序列为 " !@= TL!包含 % 个内含子%#8" TL&$ !&.#:
编码 % 个 #<" 个氨基酸的蛋白!该蛋白具有 KM,& 家族的典型结构域%-M#!.i((I!-M$!DhAM)和 &,G&!属于
,U&’M亚家族$ DO&’M蛋白与其他植物 &’M有很高的同源性!其中与水稻的 SZ&’M" 和拟南芥的 ,U&’M的一致性
分别为 =<1@F!!<1@F$ !&.#:上游调控序列为 % ="$ TL!包含生长素应答元件 ,3JMM;Q/YO’,d,应答元件 C/U7X
$T’干旱诱导 CAd结合位点 Cd&’光应答元件等多种作用元件!这意味着 !&.#:可能受到激素’干旱等的调控$
jD’M结果表明!!&.#:在叶中的表达丰度最高!其次是根和茎!而鞘中最低#!&.#:的表达短时间内受 K,? 的抑
制!随处理时间延长%至 ! R&!基因的表达受到诱导#!&.#:的表达总体受外源 ,d,和 *E’0处理的抑制#干旱处理
条件下 !&.#:基因表达呈先上升后下降的趋势$ M+;D’M证明 !&.#:已在转基因拟南芥植株中得到表达!表型分
析发现!与野生型相比转正义基因植株生长健壮!根系发达!而反义植株矮小!根系生长受到抑制$ (结论) 在毛竹
各组织中 !&.#:呈组成型表达!根中表达受到 K,? ’,d,以及干旱’*E’0的影响$ 该基因正义表达促进转基因植
株生长!反义转基因植株则受到抑制!表明该基因可能参与毛竹的生长发育调控$
关键词"B毛竹# !&.#:# 激素# 非生物胁迫# 基因表达# 功能分析
中图分类号!&8%=1<#BBB文献标识码!,BBB文章编号!%$$% >8<==""$%##$# >$$?! >$=
EOG%$66()"&"-0."’#()")*-)9:!K$"$*%)J-67/"(.&,67()+*/$(
I/4H-707BkRE/iE4ZRO4HBGE4H-707B&34 i3EW3B-/3 A/4HXO4HBKE/kR7N74
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926#%&’#"B(ST:OQU7VO) +RO.#5:D#:KJ% .#:& HO4OL0EWO6 7NL/YUE4UY/0OZ74 EZWNNOUY7QQO067V7Z7/4ZU/HO4OYEUO
TEZ7QU7ZZ3OZ74 UROY//UE46 ZR//U/XL0E4UZ5+ROZUY3QU3YE0XOEU3YOZ/X.#:R/N/0/H/3ZHO4O!&.#:74 !2-%$+,3/2-+&>6%0+
\OYOE4E0W]O6! UROU7ZZ3OZLOQ7X7QOJLYOZZ7/4 /X!&.#:\EZZU367O6! URO74X03O4QO/4 !&.#:OJLYOZZ7/4 74 Y//UZUYOEUO6
\7UR K,? ! ,d,! 6Y/3HRUE46 *E’0\EZ74VOZU7HEUO6 YOZLOQU7VO0W! E46 UROX34QU7/4 \EZLYO07N74EY70W76O4U7X7O6 TW
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YOZ/3YQOZX/YN/0OQ30EYTYOO674H/XTENT//5(COUR/6)+ROZOj3O4QO/X.#: R/N/0/H3OHO4O!&.#:E46 7UZ3LZUYOEN
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D0E4U’,M)/4074OZ/XU\EYOZYOZLOQU7VO0W5+ROU7ZZ3OZLOQ7X7QOJLYOZZ7/4 /X!&.#:74 67XOYO4UU7ZZ3OZ! EZ\O0EZURO
QRE4HOZ/X!&.#:OJLYOZZ7/4 74 Y//UZUYOEUO6 \7UR K,? ! ,d,! 6Y/3HRUE46 *E’0\OYOE4E0W]O6 3Z74HYOE0;U7NOj3E4U7UEU7VO
D’M%jD’M&5+ROOJLYOZZ7/4 VOQU/YZ/XZO4ZOE46 E4U7ZO4ZO!&.#:\OYOQ/4ZUY3QUO6 E46 UYE4ZX/YNO6 74U/5",23%0313!
林 业 科 学 !" 卷B
E46 UROLRO4/UWLO/XUYE4ZHO47QL0E4UZ\EZ74VOZU7HEUO6 U/76O4U7XWUROX34QU7/4 /X!&.#:"(MOZ30U), .#:R/N/0/H/3Z
HO4O! !&.#: %KO4dE4[ */5hD$@34UYE4Z0EUO6 YOH7/4 %c+M& /X"?= TL! E?pc+M/X%?< TL E46 E4 /LO4 YOE674HXYENO%SMh& /X% @"@ TL5+ROHO4/N7Q
ZOj3O4QOQ/YYOZL/4674HU/SMh/X!&.#:\EZ" !@= TL Q/4UE7474H/4O74UY/4 /X#8" TL5!&.#:O4Q/6O6 ELY/UO74 \7UR
#<" EN74/EQ76Z! \R7QR RE6 UWL7QE06/NE74Z%-M#! .i((I! -M$! DhAM)E46 &,G& /XKM,& XEN70WE46 TO0/4HO6 U/
,U&’MZ3TXEN70W5DO&’MRE6 R7HR R/N/0/HW\7UR &’MZXY/N/UROYN/4/Q/UZ! EN/4H\R7QR URO76O4U7U7OZ\7UR SZ&’M" 74
Y7QOE46 ,U&’M74 5",23%0313 \OYO=<1@F E46 !<1@F! YOZLOQU7VO0W5+ROYOH30EU/YWZOj3O4QO3LZUYOEN/X!&.#:\EZ
% ="$ TL! 74Q03674HNE4W[746Z/XYOZL/4Z7VOO0ONO4UZZ3QR EZ/0+;EQU74HYOH30EU/YWO0ONO4U%,3JMM;Q/YO& 74V/0VO6 74
E3J74 YOZL/4Z7VO4OZZ! ETZQ7Z7QEQ76 YOZL/4Z7VOO0ONO4U%C/U7X$ T&! CAdT74674HZ7UO%Cd&& 74V/0VO6 74 6Y/3HRU;
7463Q7T707UWE46 07HRUYOZL/4Z7VOO0ONO4UZ! 7467QEU74HUREU!&.#:N7HRUTOYOH30EUO6 TWR/YN/4OZ! 6Y/3HRU! OUQ5+RO
jD’ME4E0WZ7Z7467QEUO6 UREU!&.#:OJLYOZZO6 Q/4ZU7U3U7VO0WEUER7HR 0OVO074 0OEX! X/0/\O6 TWY//UE46 ZUON! E46 URO
0OEZU\EZ74 ZROEUR5+ROOJLYOZZ7/4 /X!&.#:74 Y//U\EZ74R7T7UO6 TWK,? 74 ZR/YUU7NO%\7UR74 % R&! T3U7U\EZ7463QO6
\7UR LY/0/4HO6 UYOEUNO4U%3L U/! R&5SVOYE0! !&.#:\EZZ3LLYOZZO6 TWOJ/HO4/3Z,d,E46 *E’0! \R70O7U\EZ7463QO6
747U7E0WE46 Z3TZOj3O4U0WZ3LLYOZZO6 TW6Y/3HRU5+ROOJLYOZZ7/4 /X!&.#:74 UYE4ZHO47QL0E4UZ/X5",23%0313 \EZ
Q/4X7YNO6 TWM+;D’M5+ROLRO4/UWLOZ6ON/4ZUYEUO6 UREUZO4ZOUYE4ZHO47QL0E4UZRE6 EV7H/Y/3ZHY/\UR E46 \O0;
6OVO0/LO6 Y//UZWZUONQ/NLEYO6 U/URO\706 UWLO! \R70OE4U7ZO4ZOUYE4ZHO47QL0E4UZ\OYOZNE0E46 UROHY/\UR /XY//U\EZ
YOZUYE74O65(’/4Q03Z7/4) +ROYOZ30UZ7467QEUO6 UREUUROOJLYOZZ7/4 /X!&.#:\EZQ/4ZU7U3U7VO74 67XOYO4UU7ZZ3OZ! E46
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UYE4ZHO47QL0E4UZ! \R70OUREU/XE4U7ZO4ZO74R7T7UO6 L0E4UHY/\UR! Z3HHOZU74HUREU!&.#:N7HRULEYU7Q7LEUO74 YOH30EU74H
LY/QOZZ/X!"&>6%0+HY/\UR E46 6OVO0/LNO4U5
:$, ;)%-6"B!2-%$+,3/2-+&>6%0+# !&.#:# R/YN/4O# ET7/U7QZUYOZZ# HO4OOJLYOZZ7/4# X34QU7/4E0E4E0WZ7Z
BB细胞分裂不均等产生 % 对命运不同的子细胞!
是细胞功能和命运多样化的一种很重要的机制
%i/YV7U]&,3%"! %@@"&!一些研究已经证实了植物发
育过程的细胞不均等分裂!高等植物中合子的第 %
次分裂是属于细胞横向的不均等分裂!分裂后产生
% 个小的顶端细胞和 % 个大的基底细胞$ 细胞分
裂’细胞伸长和细胞特化之间高度的协调调控产生
最终的有机体形态%KE0EHROY&,3%"! %@@8# &QROYOZ&,
3%"! %@@@&$ 植物的生长发育贯穿于整个生命过程!
而位于茎段和根尖分生组织的干细胞调控这些过
程$ 研究发现!一些分子途径在茎段分生组织和根
端分生组织中是相同的!例如根端和茎端的表皮细
胞 发 育 是 受 一 种 途 径 调 控! 这 种 途 径 中
+M,*&D,M)*++)&+,K-,dM,和 K-,dM," 基因
发挥相似的作用 %KE0\EW&,3%"! %@@<# i34H&,3%"!
%@@=# CEZ3QQ7&,3%"! %@@@# MOY7O&,3%"! %@@<&$
.#5:D#:KJ%.#:&和 .NK:9Q:KK9%.N:&是 "
个与根和茎端组织发育相关的重要基因%GWZ/Q[E;
I70OY&,3%"! "$$$# iO0EY73UE&,3%"! "$$$&!其中 .#:
基因首先在拟南芥%5*3B0>$C+0+,23%0313&中被发现!
该基因在皮层和表皮原始细胞表达!+/*突变体由于
不均等分裂的破坏而丢失 % 层细胞层!表明 .#:基
因在拟南芥根的发育中起着重要的调控作用 %I7
-E3YO4]7/&,3%"! %@@#&$ .#:基因的突变不仅使得
根部出现辐射类型缺失!而且下胚轴和茎段花梗也
出现相同的缺失症状!表明 .#:基因调控拟南芥胚
根和胚芽的辐射发育%GWZ/Q[E;I70OY&,3%"! "$$$&$
有研究发现 .#:还参与拟南芥根部的干细胞巢的
定位%&ETEU747&,3%"! "$$?&$ 除此之外!.#:在拟南
芥中还参与糖响应和 ,d,调节途径 %’37&,3%"!
"$%"&$ 在玉米 %O&3 ?3-+&中!O?.#:参与玉米根
部的定位信息!这种定位信息主要作用是决定根部
结构类型的产生%-7N&,3%"! "$$$&#与拟南芥中的
.#:基因相比!O?.#:基因可以恢复 .#:突变缺失
的功能!O?.#:和 .#:在功能上是保守的 %-7N&,
3%"! "$$!&#另外还发现 O?.#:基因参与 ’< 植物花
环结构的形成%&0O\74Z[7&,3%"! "$%"&$ 水稻%K*-L3
+3,083&K+.#:不仅参与皮层和内皮层原始细胞的不
均等分裂!还参与气孔和舌叶的形成% E^N7WE&,3%"!
"$$?&$ 白羽扇豆% F6C016+3%B6+& F3.#:R 基因影响
其排根的生长 % &TET/3 &,3%"! "$%$&$ 最新研究发
现!拟南芥 .#:和辐射松 %!016+*3>03,3&!*.#:与
成熟细胞形成不定根有关 %IO0EM/VOYO&,3%"!
"$%!# ,TEYQE&,3%"! "$%<&!.#:通过调控生长素影
响其他基因的表达方式调控干细胞的分裂与分化!
从而协调根的生长%C/3TEW7674 &,3%"! "$%?&$
#?
B第 # 期 董丽莉等" 毛竹 !&.#:基因的表达与功能
毛竹%!2-%$+,3/2-+&>6%0+&是最具特色的竹种之
一!在生长季节 " 个月内完成高生长和粗生长!其速
生的特点与其根系的生长发育密切关联$ 毛竹基因
组草图%DO4H&,3%"! "$%?&的发布为从分子水平揭示
毛竹分生组织的发育与调控机制奠定了基础$ 本研
究以毛竹为材料!获得毛竹 .#:同源基因 !&.#:!
在充分分析基因结构特点的基础上!研究其组织表
达特异性以及不同激素和非生物胁迫下的表达特
性!通过在模式植物拟南芥中表达!鉴定其功能!以
期为深入研究 !&.#:在毛竹根系生长发育中的调
控作用提供参考$
%B材料和方法
<=<>试验材料及处理方法
毛竹半年生实生苗!实验室温室盆栽培养 %腐
殖土与蛭石的体积比为 ?s%&!温度 "! q!光照强度
%!$ !N/0.N>"Z>%!光照周期为光9暗 g%# R9= R$
激素处理方法%CE&,3%"! "$%$&"用 "$$ !N/0.
N>"Z>% K,? 溶液喷洒毛竹叶片!分别在处理后 $!
$1"!!$1!!%!?!! R 取毛竹根系#用 "$$ !N/0.N>" Z>%
,d,溶液喷洒毛竹叶片!分别在处理后 $!%!?!#!
%"!"< R 取毛竹根系$ *E’0和干旱处理方法%杨丽!
"$%%&"用 "$$ NN/0.N>"Z>% *E’0溶液浇灌毛竹!分
别在处理后 $!"!!!@!%进行控水干旱处理!分别在处理后 $!"!!!@!%天取毛竹根系$ 取样后!所有样品用液氮速冻处理!
置于 >=$ q超低温冰箱保存备用$
<=?>基因组 7D9提取及 ’7D9合成
采用改良 ’+,d法提取毛竹叶片的基因组
I*,%高志民等!"$$#&!用紫外分光光度计测量 ,"#$
和 ,"=$的值!检测提取的 I*,的质量$ 将 I*,放
置 >"$ q保存备用$
采用 +Y7]/0法%KE/&,3%"! "$$#&分别提取毛竹
的根’茎’叶和鞘的 M*,!以及不同处理根的 M*,!
按照 DY/NOHE公司的反转录试剂盒操作说明合成
QI*,!存 >"$ q备用$
<=@>基因的分离%测序和分析
用 水 稻 转 录 因 子 SZ&’M" 蛋 白 序 列
%SZ%"H$"=8$ & 在毛竹基因组数据库 dENT//KId
%RUL"99\\\5TENT//H6T5/YH&中查找同源基因序列
及其上游调控序列!采用 &L76OW% RUL"99\\\54QT75
40N547R5H/V9ZL76OW9&分析基因结构特点!利用在线
平台 D0E4U’,M)% RUL"99T7/74X/YNEU7QZ5LZT53HO4U5
TO9\OTU//0Z9L0E4UQEYO9RUN09&分析上游调控序列所
含作用元件!用 C)K,#1$ 软件构建基于目的基因
编码蛋白的系统进化树$
根据目的基因序列的 SMh设计引物 % &’M;h"
!p;,+KKK’+’’+’’+’’’+’’+’;?p# &’M;M" !p;+’
,,’,K’’+K,,K+’+K,,+’KK;?p&!由生工生物工
程%上海&股份有限公司合成$ D’M反应体系 %"$
!-&"! nDY7NOY&+,M+C d3XOY<1$ !-!6*+DC7JU3YO
%1# !-!引物 &’M;h%1$ !-!引物 &’M;M%1$ !-!
QI*,"1$ !-!DY7NOY&+,M+C i& I*, L/0WNOYEZO
$1" !-!IC&S%1$ !-!超纯水 @1" !-$ D’M程序"
@= q预变性 %$ N74#@= q变性?$ Z!## q退火 ?$ Z!
8" q延伸 " N74!?! 个循环#8" q延伸 %$ N74$ D’M
产物用 d7/C(K)公司回收试剂盒!回收后加 ,连接
到 LK)C;+OEZW载体上!转化大肠杆菌 %D+/2&*0/203
/$%0&+YE4Z!%!筛选出阳性克隆!送生工生物工程股
份有限公司测序$
<=A>基因的表达分析
根据基因序列的非保守区设计定量引物 j&’M;
h%!p;’’,+KK’KK’++’++K,+K;?p&和 j&’M;M%!p;
’+’’+’’+’’+’’K,’’+;?p&$ 选取毛竹 <9@基因
作为内参%hE4 &,3%"! "$%?&!引物为 *+d;h%!p;+’++
K+++K,’,’’K,,K,KK,K;?p&和 *+d;M%!p;,,+,
K’+K+’’’+KK,KK,K+++;?p&!分别以毛竹的根’
茎’叶和鞘 < 种组织的 QI*,为模板!进行组织特异
性表达分析$ 以不同处理毛竹根系的 QI*,为模
板!进行不同处理对基因表达的影响检测$ M+;D’M
反应体系 %"$ !-&"%$ nD’MT3XOY"1$ !-! 6*+D
C7JU3YO"1$ !-!引物 j&’M;h%1$ !-!引物 j&’M;M
%1$ !-!QI*,%1$ !-!Y+Ej $1" !-!超纯水 %"1=
!-$ D’M程序"@! q预变性 %$ N74#@! q变性?$ Z!
#" q退火 ?$ Z!8" q延伸 ?$ Z!"= 个循环#8" q延
伸 %$ N74$ 采 用 M/QRO-7HRU’WQ0OY$ <=$ &AdM
KYOO4#CEZUOY试剂盒在耶拿公司 l+/\OY仪器上进
行 jD’M反应$ jD’M反应体系 % %$ !-&"!1$ !-
C7J!$1= !-QI*,! j&’M;h和 j&’M;M各 $1" !-
%%$ !N/0.->%&!超纯水 ?1= !-$ jD’M程序"@! q
%$ N74#@! q ?$ Z!#" q ?$ Z!!$ 个循环$ 利用
" >%%#U法 %-7VE[ &,3%"! "$$% & 分析数据!用 )JQO0
作图$
<=B>植物表达载体构建
根据植物表达载体 L’,Cd(,%?$% 的多克隆位点
及目的基因序列的酶切位点!分别设计添加酶切位点
的引物!合成正义扩增引物 &’M;&;h%!p;’’EUQHEU,+K
KK’+’’+’’+’’’+’’+’;?p&和 &’M;&;M%!p;’KHHEUQQ+
’,,’,K’’+K,,K+’+K,,+’KK;?p&!末端分别添加
#%3# 和 @3?i## 反义扩增引物 &’M;,;h% !p;
8?
林 业 科 学 !" 卷B
K’UQUEHE,+KKK’+’’+’’+’’’+’’+’;?p&和 &’M;,;
M%!p;’KHHEUQQ+’,,’,K’’+K,,K+’+K,,+’KK;
?p&!末端分别添加 @3?i#和 SB3#$ 采用 DWY/TOZU
高保真酶进行D’M扩增!产物后加,连接到 LK)C;+
OEZW载体上!转化大肠杆菌!选择阳性单克隆测序$
将测序正确的片段分别连接到 L’,Cd(,%?$% 的多
克隆位点!形成目的基因的正义’反义植物表达
载体$
<=C>拟南芥转化%转基因植株检测与表型观察
采用电击法将含有目的基因的植物表达载体质
粒转入农杆菌 %5’*$B3/,&*06?,6?&(3/0&1+&K.?%$%!
采用浸花法转化野生型拟南芥 %’0/;$& %’0/3HR &,
3%"! %@@=&$ 筛选抗性%iHW!$ NH.->%&植株!观察分
析表型并拍照$ 选择 ? 株正义植株和 " 株反义植
株!分别提取 M*,!将提取的 M*,反转录成 QI*,$
分 别 用 引 物 &’M;&;h和 &’M;&;M’ &’M;,;h和
&’M;,;M检测目的基因在转基因植株中的表达情
况!同时以野生型拟南芥作对照$
"B结果与分析
?=<>基因克隆与序列分析
图 "B基于 &’M序列构建的系统进化树
h7H5"BDRW0/HO4OU7QUYOOTEZO6 /4 UROZOj3O4QO/X&’M
每个分支上的数字表示 % $$$ 次重复搜索的靴带值$ *3NTOYZ/4 NE:/YTYE4QROZ7467QEUOT//UZUYEL OZU7NEUOZX/Y% $$$ YOL07QEUOE4E0WZ7Z5
从毛竹基因组数据库中!查找到与水稻 K+.#:T
同源基因序列 hD$@因全长 " ?$% TL!包含 !pc+M为 "?= TL!?pc+M为
%?< TL 和 SMh为 % @"@ TL$ 将该基因命名为
!&.#:$ !&.#:上游调控序列为 % ="$ TL!除含有
+,+,’’,,+;T/J启动子基本元件外!还包含生长素
应答 元 件 ,3JMM;Q/YO’ 生 长 素 调 控 元 件 +K,;
O0ONO4U’,d,响应元件 C/U7X$ T’低温应答顺式作
用元件 -+M’干旱诱导 CAd结合位点 Cd&’节律控
制顺式作用元件 Q7YQE67E4 以及光应答元件和顺势
作用元件!这意味着 !&.#:可能受到激素’低温’干
旱等的调控$
用引物 &’M;h和 &’M;M!分别以毛竹的 QI*,
和基因组 I*,为模板!进行 D’M扩增!电泳检测发
现对应的目的条带分别为 " $$$ TL 和 " #$$ TL 左
右!与预测的片段大小相符$ 测序结果显示!QI*,
对应的目的片段为 % @"# TL!除比原有 SMh序列中
少了 ? 个碱基%第 %?$-%?" 位"+’’&外!获得序列
与 hD$@" !@= TL$ 用软件在线分析 !&.#:基因的结构!发
现该基因含有 % 个长度 #8? TL 内含子!位于%<=<-
"%!# TL%图 %&!内含子完全符合 K+;,K剪接原则
%C//YO&,3%"! %@@?&$
图 %B!&.#:基因结构示意
h7H5%B&UY3QU3YE067EHYEN/X!&.#:
克隆得到的 !&.#:编码 #<% 个氨基酸的蛋白!
该蛋白除了包含 KM,& 家族的 ! 个保守基序%-M#!
.i((I!-M$!DhAM)和 &,G&外!还含有 ,U&’M亚
家族的特有基序#!$!进一步说明它属于 KM,& 转
录因子家族的 ,U&’M亚家族$ 同源性分析结果表
明!DO&’M与拟南芥的 ,U&’M的相似度为 !<1@F!
与水 稻 的 SZ&’M% 和 SZ&’M" 相 似 度 分 别 为
="1%F!=<1@F!与玉米的相似度为 =$1!F$ 构建
基于 &’M同源序列的系统进化树!结果显示 DO&’M
与单子叶植物水稻’高粱% .$*’26?B0/$%$*&’玉米等
的 &’M聚在一起!而双子叶植物拟南芥’黄瓜
%#6/6?0++3,086+&’野大豆%M%-/01&+$A3&和蒺藜苜蓿
%G&>0/3’$,*61/3,6%3&的 &’M聚类在一起!这与植物
的进化关系相一致%图 "&$
=?
B第 # 期 董丽莉等" 毛竹 !&.#:基因的表达与功能
?=?>基因表达的组织特异性分析
jD’M检测结果显示!!&.#:基因在毛竹的根’
茎’叶和叶鞘中均有表达!其中在叶中表达的丰度最
高!其次分别是在根和茎中!而在鞘中的表达丰度最
低%图 ?&$ 说明 !&.#:基因属于组成型表达!可能
对毛竹根’茎’叶和鞘的发育都有影响$
图 ?B!&.#:在毛竹不同组织的表达
h7H5?B)JLYOZZ7/4 /X!&.#:74 URO67XOYO4UU7ZZ3OZ/X!"&>6%0+
图
K,? 和 ,d,是调控植物根系生长发育的 " 类
重要激素!其中 K,? 调控主根发育 %h3 &,3%"!
"$$?&!,d,抑制侧根生长%IO&NOU&,3%"! "$$?&$
K,? 处理后!!&.#:基因表达量在 % R 内逐渐降低!
至 % R 时表达量降低了 =$F!随着处理时间的增加!
该基因的表达量开始上升!至 ! R 表达量为 $ R 的
"1! 倍%图 <&!表明 !&.#:的表达短时间受 K,? 的
抑制!随着处理时间的增加!该基因的表达受到诱
导$ 在 ,d,处理 # R 内 !&.#:基因表达量逐渐下
降!# R 时仅为 $ R 的 %$F!随后该基因表达逐渐恢
复!至 "< R 时该基因的表达量与 $ R 处理相接近!但
仍低于 $ R 处理%图 !&!表明 !&.#:的表达总体是
受到 ,d,抑制的!自身具有一定的调节能力$ K,?
和 ,d,是 " 种完全不同类型的激素!处理毛竹后最
终导致其根系中 !&.#:的表达分别受到诱导和抑
制$ 由此可以推测!外源 K,? 和 ,d,可能通过调
控 !&.#:的表达来影响毛竹根系生长发育$
图 !B,d,处理下 !&.#:基因的表达分析
h7H5!B)JLYOZZ7/4 E4E0WZ7Z/X!&.#:UYOEUO6 TW,d,
?=A>D&1/和干旱处理对基因表达的影响
干旱和盐渍化是影响植物生长的非生物胁迫因
子!根系最先感受到胁迫信号作出反应!并通过信号
传导对有关基因的表达进行调整!最终影响根系生
长$ 在 *E’0处理 $ a@ 天内!!&.#:的表达量不断
下降!至 @ 天表达量相对于 $ 天降低了 @=F!随后
随处理时间的增加!该基因表达量有所恢复!至 "%
天时其表达量约是 $ 天的 "
处理 " 天时表达量急剧增加!约是 $ 天的 <#1# 倍!
随后表达量急剧下降!至 "% 天时其表达量约是 $ 天
的 "$F%图 8&$ 由此表明!*E’0处理抑制 !&.#:的
表达!而干旱处理在短期内 %! 天&诱导 !&.#:表
达!但随干旱时间延长%@ 天之后&!其表达量受到抑
制!这可能与 *E’0和干旱胁迫的信号传导机制密切
关联!导致基因表达的差异$
?=B>-)9:!基因在拟南芥中的表达分析
利用 !&.#:基因正’反义表达载体转化野生型
拟南芥!收获种子并进行抗性%iHW&筛选!获得正义
抗性植株 8 个!反义抗性植株 ! 个$ 经过连续的抗
性筛选获得纯合的 +? 株系!做后续的试验$ 挑选 ?
株正义植株和 " 株反义植株进行分子检测!结果显
示目的基因 !&.#:均在转基因植株中得到表达!而
野生型拟南芥中未检测到%图 =&$
@?
林 业 科 学 !" 卷B
图 #B*E’0处理下 !&.#:基因的表达分析
h7H5#B)JLYOZZ7/4 E4E0WZ7Z/X!&.#:UYOEUO6 TW*E’0
图 8B干旱处理下 !&.#:基因的表达分析
h7H58B)JLYOZZ7/4 E4E0WZ7Z/X!&.#:UYOEUO6 TW6Y/3HRU
图 =B转 !&.#:基因植株 M+;D’M检测
h7H5=B+YE4ZHO47QL0E4UZ/X!&.#:QROQ[O6 TWM+;D’M
% >?"正义#? >!"反义##"野生型$ % >?" &O4ZO# ? >!"
,4U7ZO4ZO# #" G706 UWLO5
表型观察发现!正义转基因植株与野生型表型
类似!且生长健壮#而反义转基因植株则矮小!生长
缓慢!叶片很小%图 @,&$ 将转基因植株在垂直平
板上培养并观察根系生长情况!与野生型相比!%$
天后正义转基因植株的根系正常!且主根较长 %图
@d&!而反义转基因植株的根系!生长较慢!主根不
明显且相对较短$ %< 天后测量根系长度发现!正义
转基因植株根系比野生型的偏长!反义转基因植株
根系比野生型偏短!均达到显著水平%!f$1$!&#同
时!正义转基因植株根系的侧根数目多于野生型植
株!而反义转基因植株的根系侧根明显少于野生型
植株%图 @’&!均达到显著水平%!f$1$!&$
图 @B转基因植株表型
h7H5@BM//ULRO4/UWLO/XUYE4ZHO47QL0E4UZ
,"盆栽 "! 天#d"垂直板 %$ 天#’"垂直板 %! 天$ ," D/UO6 "!
6EWZ# d" %$ 6EWZ/4 VOYU7QE0L0EUO# ’" %! 6EWZ/4 VOYU7QE0L0EUO5
?B讨论
植物的生长发育依赖于根系不断地从土壤吸收
水分和必要的矿质养分%dEZZE47&,3%"! "$$<&!竹子
的快速生长意味着高固碳效率!这就需要大量的水
分和多种必需的矿物质营养素的供给!因此研究竹
子根系的生长发育调控对揭示其快速生长具有重要
价值$
KM,& 家族是植物特有的一类转录因子%d/0O!
"$$<&!其中的 ,U&’M亚家族成员主要参与根的发
育调控%I7-E3YO4]7/&,3%"! %@@## GWZ/Q[E;I70OY&,
3%"! "$$$&$ 本研究克隆的毛竹 !&.#:基因编码的
转录因子属于 ,U&’M亚家族!DO&’M和水稻 SZ&’M
及玉米 kN&’M的差异主要在于 *端以及 ,U&’M亚
家族特有基序#!$!所含 -M#!.i((I!-M$!
DhAM)和 &,G 结构域非常保守!结构上的保守意
味着功能上的相似$ !&.#:基因在根’茎’叶和鞘中
的表达存在明显的差异!在根中的表达丰度仅次于
$<
B第 # 期 董丽莉等" 毛竹 !&.#:基因的表达与功能
叶片!这可能意味着该基因在毛竹中除了参与根的
发育调控外!也参与叶的发育调控!转基因拟南芥植
株表型进一步证明了这一点$ 与野生型拟南芥相
比!正义 !&.#:转基因植株的主根较长!侧根数目
较多!而反义转基因植株矮小!生长较慢!叶片偏小!
主根较短!侧根数目较少!这与水稻 K+.#:和玉米
O?.#:基因的功能相类似% E^N7WE&,3%"! "$$?# -7N
&,3%"! "$$!&$ 然而!在毛竹中 !&.#:具体是如何影
响根系发育的!是否参与其他组织的发育调控!有待
进一步研究$
植物根系发育调控涉及大量的激素信号转导途
径!生长素’细胞分裂素’乙烯’油菜素内酯和赤霉素
等均参与根器官发生和形成等方面的调控%dO4[/Vu
&,3%"! "$$@&$ 同时!非生物胁迫也会通过引起细胞
破坏和扰乱细胞的渗透平衡来影响植物根系的生长
和发育%CERE:E4 &,3%"! "$$!&$ 本研究中对 !&.#:
上游调控序列的分析表明!其中包含生长素’,d,’
干旱等多种应答作用元件!jD’M结果进一步证明
!&.#:在根中的表达受到外源 K,?’,d,的调控!
以及非生物胁迫 *E’0和干旱处理的影响$ 其原因
可能是在处理后!激活了某些转录因子!使其与
!&.#:基因的上游启动子区域的作用元件结合!从
而调控该基因的表达$ 但目前尚未见关于 K,?’
,d,以及 *E’0’干旱等胁迫处理条件下对 .#:基
因表达影响的报道!其具体的调控与响应机制有待
深入研究$
!&.#:基因编码的蛋白作为转录因子可能具有
多方面的功能!基因结构特点决定了功能!但是功能
的实现除了会受到来自外界因素的影响外!其表达
还受到内源激素’其他转录因子’N7M*,’糖浓度等
多种因素的调控$ 研究表明!拟南芥中 ,U&’M和
,U&iM参与调控根的生长发育和激活内皮层中
N7M%#!9%## 的转录% R^E4 &,3%"! "$%%&!而且 &’-?;
I)--,互作调节的 K,信号途径与 &iM9&’M途径
联合共同调控根的分裂区基本组织分裂的时间和程
度%iO/&,3%"! "$%%&!另外研究表明!2,’^ I,G通
过结合 .#:启动子序列来直接调控 &’M%SHEZE\EYE
&,3%"! "$%%&!而 &’M对糖应答具有独立调节作用
%’37&,3%"! "$%"&!所以推测毛竹的 !&.#:也可能
存在复杂的网络调控途径$ 因此!要全面揭示
!&.#:基因在毛竹根系生长发育中的功能尚需从调
控与被调控的多个角度进行全面研究$
理条件下的表达变化说明其参与了毛竹对激素和非
生物胁迫的响应!对毛竹适应环境具有一定的作用$
该基因的异源表达影响了转基因植株根系的生长发
育!表明该基因可能通过参与植物根系的发育调控!
进而在胁迫中发挥一定的功能$
参 考 文 献
高志民! 范少辉! 高B健! 等5"$$#5基于 ’+,d法提取毛竹基因组
I*,的探讨5林业科学研究! %@%#& " 8"! >8"=5
%KE/kC! hE4 & i! KE/2! &,3%""$$#5)JUYEQUHO4/N7QI*,XY/N
!2-%$+,3/2-+&>6%0+TW’+,d;TEZO6 NOUR/65h/YOZUMOZOEYQR! %@
%#& "8"! >8"=5/74 ’R74OZO0 &
杨B丽5"$%%5毛竹抗逆相关基因 !&O)!和 !&GP@基因的克隆及
!&O)!基因功能验证5杭州"浙江农林大学硕士学位论文5
%AE4H-5"$%%5’0/474H/X!&O)!E46 !&GP@HO4OZE46 X34QU7/4
E4E0WZ7Z/X!&O)!HO4O74 !2-%$+,3/2-+&>6%0+"iE4H]R/3" C&
UROZ7Z/XkRO:7E4H ,HY7Q30U3YO E46 h/YOZUYW c47VOYZ7UW5 / 74
’R74OZO0 &
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林 业 科 学 !" 卷B
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74V/0VO6 74 L/Z7U7/474HUROZUONQO047QRO74 URO5*3B0>$C+0+Y//U
NOY7ZUON5KO4OZIOV! %8%?& " ?!< >?!=5
&TET/3 -! d3QQ7EYO07d! C70OY&! &,3%""$%$5C/0OQ30EYE4E0WZ7Z/X
.#5:D#:KJHO4OZOJLYOZZO6 74 \R7UO03L74 Q03ZUOYY//UZ52)JL
d/U! #%%!& " %?!% >%?#?5
&QROYOZd! dO4XOWD*5%@@@5,ZWNNOUY7QQO067V7Z7/4 74 L0E4UZ5,443
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&0O\74Z[7+-! ,46OYZ/4 ,,! kRE4H’! &,3%""$%"5&QEYOQY/\L0EWZE
Y/0O74 OZUET07ZR74H E^Y4]E4EU/NW74 NE7]O0OEVOZ5D0E4U’O0
DRWZ7/0! !?%%"& " "$?$ >"$?85
GWZ/Q[E;I70OY2G! iO0EY73UEA! h3[E[7i! &,3%""$$$5C/0OQ30EY
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"责任编辑B徐B红#
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