全 文 ：林业科学研究　1998, 11( 4) : 377～381
Forest Research 　　 　
　　
　　1997—09—02收稿。
顾小平副研究员,吴晓丽(中国林业科学研究院亚热带林业研究所　浙江富阳　311400)。
* 本文为 1995～1997年浙江省自然科学基金资助项目的研究内容。细菌鉴定得到中国科学院微生物所蔡妙英研究员
及陈潇、周黎的帮助,在此表示感谢。
毛竹根际分离的多粘芽孢杆菌
固氮特性的研究*
顾小平　吴晓丽
　　摘要　对从毛竹根际分离到的菌号为GW-1、GW-5、GW-10、GW-16 的4 株菌进行鉴定和固氮
特性研究, 从其菌体形态及生理生化特性确定为多粘芽孢杆菌。它们固氮的最适温度: GW-1 为 30
～35 ℃, GW-5、GW-16 为 30 ℃, GW-10 为 35 ℃, 最适固氮 pH GW-1、GW-10 为 7. 5左右, GW-5
为 7. 0 左右, GW-16 为 6. 0～7. 5 之间。4 株菌都可利用多种碳源固氮,但以葡萄糖、蔗糖、苹果酸 3
种碳源混合时固氮活性最大。4 株菌的最高固氮能力 GW-1、GW-5 培养 96 h 时分别为 156. 90、89.
37 nmol ( C2H4) / ( h·瓶) , GW-10、GW-6培养 72 h 时分别为 56. 63、83. 64 nmol ( C2H4) / ( h·瓶)。
　　关键词　毛竹　多粘芽孢杆菌　联合固氮　固氮活性
　　1994年作者首次发现并证实竹类植物根际存在着联合固氮作用, 并从浙江淡竹( Phy l-
lostachys mey eri Mcclare)根际分离到肺炎克雷伯氏菌( K lebsiella pneumoniae T revisan)后 [ 1] ,
目前又从毛竹( Phy llostachy s p ubescens Mazel ex H. delehaie)根际分离到多株芽孢杆菌,经测
定有较高的固氮活性。本文就菌号为 GW-1、GW-5、GW-10、GW-16 4株菌的鉴定及固氮特性
进行报道。
1　材料与方法
1. 1　材料　研究材料为生长在本所虎山山地红壤上的毛竹根系。
1. 2　细菌分离　将毛竹根顺竹兜连土挖起,带土拿回实验室后抖掉浮土,再用自来水冲净泥
土,挑选健壮活根剪成小于 1 cm 的根段,用无菌水冲洗 6次, 然后用 70%酒精浸泡 5 m in, 再
用无菌水冲洗6次后用无菌滤纸吸掉多余水分,称取 1 g 鲜根段放入装有 2 mL 修改的半固体
D氏培养基的青霉素小瓶中, 30℃培养 2 d后测定固氮活性, 选有活性且较高的样品用接种针
挑取培养液在固体平板上划线,然后挑取单菌落并多次纯化,对纯化的细菌再接入装有 D 氏
半固体培养基的青霉素瓶中,测定固氮活性,对有固氮活性的细菌进行进一步鉴定。
1. 3　细菌鉴定　细菌鉴定根据参考文献[ 2～7]进行。
1. 4　固氮菌固氮特性研究　用乙炔还原法在气相色谱仪上测定。
不同温度对固氮菌固氮的影响是用 2 mL D 氏半固体培养基在青霉素小瓶中接种后, 预
培养 24 h 再注入 0. 7 mL 乙炔培养 24 h 测定的。
不同 pH 的培养基是在不含苹果酸的 D 氏培养基中加入 1/ 15 mo l/ L Na2HPO 4 和 1/ 15
mol/ L KH2PO 4混合的 pH 缓冲液配制的,测定方法同前。
不同碳源的培养基是以 D氏培养基为基础,以参试碳源取代原培养基配方中的碳源 5 g /
L ,三糖培养基是基础培养基中的碳源以蔗糖、葡萄糖、苹果酸 3种碳源代替各 5 g/ L , pH 7. 0,
测量方法同上。
不同培养时间对固氮菌固氮的影响是以和温度测定相同的培养基接种后立刻注入 0. 7
mL 乙炔, 30 ℃培养, 起初每 4 h 测定一次,以后每 12 h测定一次。
2　结果与讨论
　　利用以上方法共分离到具固氮活性的菌株 36株,初步镜检其中 20多株为杆状并具芽孢,
而 17株菌可在前述培养基中大量生长,本文就其中 4株菌进行报道。
2. 1　固氮菌的菌体形态、菌落形态及生理生化特性
对这些菌进行细胞形态、大小、芽孢等的镜检观察,并在 do¨ bereiner 培养基上对菌落形态
进行比较,结果显示:虽然 4株菌在菌落形态上有一些差异,但都是具芽孢的杆菌。见表 1。
表 1　4株菌的菌体及菌落形态
菌　号 菌体形态
菌体大小
(
m) 芽　孢　形　态 菌　落　形　态
胞内
PHB
颗粒
GW-1 杆状 0. 7～0. 8×3. 0～3. 5 椭圆,膨大,端生到亚端生 乳白,半透明,圆、凸、边缘齐,直径 5 mm 无
GW-5 杆状 0. 8×3. 0～5. 0 椭圆,膨大,中生或次端生 乳白,半透明,圆、边缘齐,色浓,直径 15 mm 无
GW-10 杆状 0. 7×2. 0～4. 0 椭圆,膨大,次端生 圆、边缘齐,边缘半透明中间为深黄褐色,直径
5 mm
无
GW-16 杆状 0. 7～0. 8×3. 0～3. 5 椭圆,膨大,端生到亚端生 透明,圆、亮、湿、凸、边缘齐,直径 8 mm 无
　　根据中国科学院微生物所专家对 GW-1和 GW-16号菌株的鉴定, GW-1号菌株的菌落形
态为:菌落小,突起,光滑,点状, 乳酪色,大小为 1～2 mm 。GW-16号菌株的菌落形态为:菌落
圆形,光滑, 透明,低凸,薄, 大小为 2～3 mm。和我们的描述有所不同,这主要是因为所使用的
培养基不同所致。
4株菌的主要生理生化特性见表 2。对 4株菌的菌体形态、菌落形态及生理生化特性的观
察测定, 根据参考文献[ 2, 3]可将这4株菌定名为多粘芽孢杆菌( Baci llus p olymyxa Mac
)。但
是根据参考文献[ 4] ( 1994 年)将多粘芽孢杆菌转入多粘类芽孢杆菌( Paenibacillus p olymyxa
Ash )。因此,这4株菌也可定名为多粘类芽孢杆菌。GW-1和GW- 16号菌株经我们鉴定后又
送中国科学院微生物所进行了进一步确认。
表 2　4 株菌的生理生化特性
菌　
号　
革兰氏反应
运动性
接触酶
氧化酶
卵磷脂酶
溶菌酶
厌氧生长
V
P反应
最高生长温度
(℃)
5%
Nacl生长
pH
5. 7生长
产酸产气
葡萄糖
阿拉伯糖
木　糖
甘露醇
淀粉水解
利用柠檬酸盐
从
NO 3产生
NO 2
二羟基丙酮
吲
哚
苯丙氨酸脱氨
石
蕊　
牛　奶　
分解酪朊
GW-1 + + + - - + + + 45 - +



+ - + + - - A +
GW-5 + + + + + 40 - +



+ - + + - - A
GW-10 + + + + + 45 - +



+ - + + - - A
GW-16 + + + - - + + + 45 - +



+ - + + - - A +
　　注:
A 为产酸, 其它项目未做记录。
为产酸产气, + 为阳性, - 为阴性。
378 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11 卷
2. 2　各菌株固氮特性研究
2. 2. 1　不同温度条件下各菌株的固氮活性　　不同温度条件下各菌株的固氮活性见图 1。从
图 1可以看出 GW-1的最适固氮温度为30～35℃, GW-5和 GW-16的最适固氮温度为 30 ℃
左右, GW-10的最适固氮温度为 35 ℃左右; 20 ℃以下, 40 ℃以上 4株菌都不固氮或很低。
2. 2. 2　不同 pH 条件下各菌株的固氮活性　固氮活性和 pH 的关系见图 2。从图 2可以看出
GW-1固氮的最适 pH 在 7. 5左右, GW-5固氮的最适pH 在 7. 0左右, GW-16固氮的最适 pH
在 6. 0～7. 5之间;以上 3株菌固氮对 pH 的适应范围都较宽, 固氮的酸性界线在 5. 5左右, 碱
性界线在 9. 0左右。而 GW-10虽然在不同pH 下的固氮水平都比较平稳,但却很低,且适应范
围比较小,最适pH 似乎在6. 0～7. 5左右, 8. 0以上就不固氮。从GW-10在其它条件下的固氮
活性看,造成其固氮水平较低的原因可能为该菌株对 pH缓冲液中的某种盐类或配比不适应,
再一原因可能是该菌株生长较慢,培养时间未达到其最高生长期。
图 1　不同温度条件下各菌株的固氮活性 图 2　不同 pH 条件下各菌株的固氮活性
2. 2. 3　不同碳源条件下各菌株的固氮活性　不同碳源和 4株菌固氮的关系见表 3。从表 3可
以看出: 4株菌以蔗糖、葡萄糖、苹果酸的混合物为碳源时的固氮活性最高, 单独以葡萄糖为碳
源时的固氮活性次之, GW-5和 GW-10对淀粉的利用较好,对其它碳源的利用一般,但 4株菌
几乎都不能利用苹果酸固氮,那么混合碳源培养基中的高固氮活性是否和苹果酸无关,而只是
葡萄糖和蔗糖的加和作用, 有待研究。
表 3　不同碳源条件下各菌株的固氮活性
[单位: nmol ( C2H4) / ( h·瓶) ]
菌　号
碳　　　　源
混合碳源
(葡萄糖+ 蔗
糖+ 苹果酸)
蔗　糖 葡萄糖 麦芽糖 乳　糖 淀　粉 苹果酸 甘露醇
GW-1 42. 90 18. 79 33. 44 10. 19 12. 33 5. 34 0. 97 19. 38
GW-5 66. 17 4. 76 25. 82 15. 89 12. 83 43. 02 0 0
GW-10 29. 90 11. 31 24. 79 4. 64 6. 51 29. 93 0 1. 25
GW-16 61. 88 15. 78 32. 70 6. 08 12. 15 16. 13 0 1. 75
2. 2. 4　4株菌不同培养时间的固氮活性　不同培养时间对各菌株固氮活性的影响见图 3。从
3794 期　　　　　　　　顾小平等: 毛竹根际分离的多粘芽孢杆菌固氮特性的研究
图 3　4株菌不同培养时间的固氮活性
图 3可以看出随培养时间的延长各菌株的固氮
活性都经历一个延迟阶段、上升阶段、稳定阶
段、下降阶段,这四个阶段可能就意味着这 4株
菌生长的四个时期即:延迟期、对数期、稳定期
和衰亡期。从图 3我们可以看到在接种后最初
的 20～24 h4 株菌基本上都没有固氮活性,而
后固氮活性开始迅速上升, GW-10、GW-16在
48 h 后, GW-5在 60 h 后, GW-1在 84 h 后固
氮活性开始稳定, GW-16大约在 72 h后,其它
菌在 96 h 后固氮活性开始平稳下降; 4株菌的
最高固氮能力 GW-1、GW-5在培养 96 h 时分
别为: 156. 90、89. 37 nmol ( C2H4 ) / ( h·瓶) ,
GW-10、GW-16在培养 72 h 时分别为: 56. 63、83. 64 nmol ( C2H4 ) / ( h·瓶)。
3　结　语
　　以上研究的 4株菌经鉴定为芽孢杆菌属的多粘芽孢杆菌,由于本文只从温度、pH、培养时
间及 8种碳源四个方面对其固氮活性进行研究,固氮菌对其它营养条件的要求还远未了解,因
此对这 4株菌的固氮能力的了解也只是初步的。据报道 [ 8, 9]国内外都曾发现有多粘芽孢杆菌和
小麦等的联合固氮作用,我们以前只测定毛竹根系具有一定的固氮能力,而从毛竹根系分离到
固氮菌还是第一次,它们和毛竹之间的联合固氮还需进一步研究。
参　考　文　献
　　1　顾小平,吴晓丽.毛竹及浙江淡竹根际联合固氮的研究.林业科学研究, 1994, 7( 6) : 618～622.
　　2　 Sneath P H, Main N S, Sharp M E, et al . Bergey′s manual of s ystem at ic b acteriology. Vol 2. W ill iams & Wilk ins,
1986.
　　3　Gorden R E, Brunsw ick N, Lii P, et al(蔡妙英,刘立太,战立克译) . The genu s Baci llus(芽孢杆菌属) .北京:农业出
版社, 1983.
　　4　Collins M D, L aw son P A, W illems A , et al. Th e phylogeny of the genus clost rid ium: Proposal of five new gener a
and eleven n ew species combinat ion. Internat ional J ournal of Sys tematic Bacteriology, 1994, 44( 4) : 812～826.
　　5　中国科学院微生物所细菌分类组. 一般细菌常用鉴定方法. 北京:科学出版社, 1983.
　　6　朱建国.临床常见细菌鉴定手册.北京:北京医科大学,中国协和医科大学联合出版社, 1993.
　　7　中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法.北京:科学出版社, 1985.
　　8　葛诚.微生物肥料概述.土壤肥料, 1993, 6: 43～45.
　　9　Haah tela K. Root-ass ociated N 2 fix at ion ( acetylene reduct ion) b y enterobacteriaceae and azospiril lum s t rain s in cold-
cl imate spodosols . Appl. Eviron. M icrobiol . , 1981, 41( 1) : 203～206.
380 林 业 科 学 研 究　　　　　　　　　　　　　　　11 卷
Study on Several Nitrogen Fixation Strains
from Phyllostachys pubescens Roots
Gu X iaop ing　Wu X iaoli
　　Abstract　Four st rains GW-1, GW-5, GW-10 and GW-16 isolated f rom Phyl lostachys
pubescens roo ts are ident ified and studied. According to the resear ch on morpholog y, phy sio-
logical and biochemical character, these st rains all belong to Bacillus p olymyxa. T heir opti-
mum temper ature for nit rog en fix ing is 30～35 ℃ for GW-1, 30 ℃ for GW-5 and GW-16, 35
℃ fo r GW-10. Optimum pH for nit rog en f ixing is 7. 5 fo r GW-1 and GW-10, 7. 0 fo r GW-5,
6. 0～7. 5 for GW-16. M any carbon sources can be used by these four st rains, but the highest
nit ro genase activity can be obtained when the carbon sources is the m ix tur e o f g lucose, su-
cro se and malic acid. Under dif ferent culture t ime condition the highest nit ro genase act ivity
is 156. 90, 89. 37 nmol ( C2H4 )·h- 1·bot t le- 1 for GW-1 and GW-5 in 96 h, 56. 63, 83. 64
nmol ( C2H4 )·h- 1·bot tle- 1 for GW-10 and GW-16 in 72 h.
　　Key words　Phy llostachy s p ubescens　Bacil lus p olymyxa　associat ive nit rogen fix ation
　nit rogenase activity
　　Gu Xiaoping, As sociate Profess or, Wu Xiaoli ( Th e Research Inst itute of Sub tropical Forest ry, CAF　Fuyan g, Zh ejiang
311400) .
3814 期　　　　　　　　顾小平等: 毛竹根际分离的多粘芽孢杆菌固氮特性的研究