全 文 ：第 !" 卷 第 #$ 期
% $ # $ 年 #$ 月
林 业 科 学
&’()*+(, &(-.,) &(*(’,)
./01!"!*/1#$
2345!% $ # $
毛竹 J"H2@F_ 基因的克隆及转化拟南芥初步研究!
高志民#6郑6波#6彭镇华#!%
"#1国际竹藤网络中心6国家林业局竹藤科学与技术重点开放实验室6北京 #$$#$%&
%1中国林业科学研究院林业研究所6北京 #$$$7##
摘6要!6采用 I+Y:’I和 I,’)技术!从毛竹中分离到 # 个含完整的编码区和 Ao端非翻译区的 3D*,!长 ??" TR!
编码 %!$ 个氨基酸!命名为 J"H2@F_ "WMNF9N^ 登记号% )b8%??@! #$ 序列分析表明!该基因具有典型的植物
X,D&YT/Q基因结构!与拟南芥的 )类功能基因 2>E" 编码蛋白的一致性为 A?1%_$ 将 J"H2@F_ 基因置于 ’9X.
8A& 启动子控制下!构建 J"H2@F_ 基因植物表达载体$ 应用农杆菌介导将目的基因转入拟南芥!I+Y:’I证实
J"H2@F_ 基因得到异位表达$ 转基因拟南芥呈现开花提早(莲座叶卷曲(发育迟缓等表型!表明 J"H2@F_ 可能参
与毛竹由营养生长转向生殖生长的发育调控$
关键词%6毛竹& X,D&YT/Q基因& 异位表达
中图分类号! &?#@1!"’ B7!81%666文献标识码!,666文章编号!#$$# =?!@@"%$#$##$ =$$8? =$A
收稿日期% %$#$ =$! =%$& 修回日期% %$#$ =$? =%@$
基金项目% )十一五*林业科技支撑计划专题"%$$"F,D#7F$%$%# !林业公益性行业科研专项"%$$?$!$$## !国家林业局重点林业科学技术
研究项目"%$$? =$## $
!彭镇华为通讯作者$
2$#*&’-#/#4/&01234 X(/(45#6/56#$*7"%56*&’)#-*&/3
2’$B5&/$4#56&’-#/-/1("8-’$,*-*75"#-"9"
W9/lLH;HN#6lLMN"#1D"0E$8-%$*-%0-.3$98--$)? !$*$) F&+")&"$)? U"&’)-6-50-.F*$*"/-%"#*%02?9+)+#*%$*+-)6()*"%)$*+-)$61")*"%.-%3$98--$)? !$*$)
3"+4+)5 #$$#$%& %1!"#"$%&’ ()#*+*,*"-./-%"#*%0!1’+)"#"2&$?"90-./-%"#*%063"+4+)5 #$$$7##
;,$’5&<’%6,3D*,3/N49HNHN<9N /RMN SM9UHN<>S9;M9NU AoJN4S9NP094MU SMS/;J’06-#*$&’0#"?,6+#
TVSM[MSPM4S9NP3SHR4H/N R/0V;MS9PM3L9HN SM934H/N "I+Y:’I# JPHNH394H/N />
3D*,MNUP"I,’)#!9NU N9;MU 9PJ"H2@F_ "WMNF9N^ 933MPPH/N */5)b8%??@!#5J"H2@F_ Z9P??" TR 9NU MN3/UMU
9RS/4MHN />%!$ 995+LMA?1%_ PH;H09SH4VZH4L ,W-"! HNUH394HN<4L94H4TM0/NJN34H/N J"H2@F_ USH[MN TV’9X.8A& RS/;/4MSZ9P3/NP4SJ34MU 9NU 4S9NP>MSSMU HN4/2%$8+?-:#+#*’$6+$)$5)34/RH3MQRSMPPH/N />J"H2@F_
Z9P3/N>HS;MU TVI+Y:’I5+LM4S9NPMSMN4RLMN/4VRMPJ3L 9PM9S0V>0/ZMSHNP4JN4! ZLH3L HNUH394MU 4L94J"H2@F_ ;H0/ZMSUM[M0/R;MN4/>JM"?,6+#5
=(0 >#53$%6J’06-#*$&’0#"?,6+#& X,D&YT/Q66竹子开花生物学和生殖生物学一直是竹类植物
研究中的难点$ 随着对竹类植物资源利用工业化程
度的不断提高!对竹子专用新品种的需求日趋凸显!
育种者在试图通过各种手段来培育竹子新品系以适
应不同工业化利用的需求!竹子开花生物学和生殖
生物学研究又成为人们关注的焦点$ 不同竹种的开
花时间(周期各异!有的竹种每年开花一次!有的需
要几十年甚至上百年才开花!没有稳定的规律性!而
且花粉的活力维持时间较短!结实率较低 "袁金玲
等!%$$A#!因此竹类植物杂交育种工作的开展举步
维艰$
分子生物学技术的飞速发展为从分子水平来研
究竹类植物的花发育提供了良好的借鉴!尤其是模
式植物拟南芥"2%$8+?-:#+#*’$6+$)$#(烟草"Y+&-*+$)$
*$8$&,9#( 金 鱼 草 " 2)*+%%’+),9 9$4,##( 矮 牵 牛
"J"*,)+$ ’08%+?$#等开花调控基因及其功能的研究!
为开展竹子研究带来了新的思路$ 研究表明!花发
育过程中各类花器官是受器官控制基因调控的!按
照其功能分为不同的类型!并先后有学者提出了花
发育,F’模型(,F’D模型和,F’D)模型"’/MN "*
林 业 科 学 !" 卷6
$65!#77#& ,N使得花发育调控网络日趋完善$ 在花发育调控中有
很大一类属于 X,D&YT/Q基因家族!该家族基因拥
有 X,D&YT/Q保守结构域!是一类重要的调节基因!
参与器官发育(开花时间的控制!对胚胎发育":MSSV
"*$65!#777#(组织的分化"iMH",0[9SMKYFJV09"*$65!%$$$#(种子和果实的发育"WJ
"*$65!#77@& -H0eM目前! 已 经 从 丛 生 竹 麻 竹 " @")?%-&$6$9,#
6$*+.6-%,##(绿竹 "@")?%-&$6$9-:#+#-6?’$9+#中分离
了 % 个与竹子花发育密切相关的 X,D&YT/Q基因!
并对其功能进行了分析"田波等!%$$A& 高志民等!
%$$?#!然而对于散生竹 X,D&YT/Q基因的相关研究
尚未见报道$ 本文以散生竹+++毛竹"J’06-#*$&’0#
"?,6+##为材料!采用 I+Y:’I和 I,’)技术分离到 #
个 X,D&YT/Q基因!并通过转化模式植物拟南芥对
其功能进行了初步研究!以期为通过基因工程进行
竹子定向育种提供理论依据$
#6材料与方法
?@?A植物材料和菌株
购买毛竹种子!在本实验室播种于直径为#$ 3;
的塑料盆中!以蛭石为培养介质!用 #h8 FA 培养液
培养! ! 个 月 的 实 生 苗 用 于 试 验$ 大 肠 杆 菌
"<#&’"%+&’+$ &-6+# 菌 株 D\A4 和 根 癌 农 杆 菌
"25%-8$&*"%+,9*,9".$&+")##菌株 )\,#$A 由本实验
室保存$
?@DA总 1];提取与 以毛竹幼嫩叶片为材料!采用 (N[H4S/+SHK/0试剂提取总 I*,"W9/"*$65!%$$"#!3D*,合
成使用 :S/;M<9公司的反转录试剂盒!Ao3D*,合
成采用 ’0/N4M3L 公司的 &X,I++X I,’)试剂盒$
?@EA基因克隆与测序分析
根据已知竹类植物的 X,D&YT/Q基因"田波等!
%$$A& 高志民等!%$$?#设计 :’I引物!J"H2@FYa%
AoY,W++W,,’+W,,W,WW,++W,WY8o& J"H2@FYI%
AoY’+,,,W,,’’’,,’’,,W’,+WY8o!由上海生工
生物工程技术服务有限公司合成$ 以毛竹 3D*,为
模板!进行梯度 :’I$ 反应体系%$ 5-% % 5-#$ p
-, :’I FJ>MS" X<% C :0JP#! 81% 5- U*+:P
"%1A ;;/0’-=# M93L #! % 5- J"H2@FYa " A
;;/0’-=##!% 5-J"H2@FYI "A ;;/0’-=# #!# 5-
模板!71" 5-超纯水和 $1% 5--,D*,聚合酶$ 反
应条件为% 7! d预变性 A ;HN& 7! d # ;HN!AA ‘
"A d # ;HN!?% d #1A ;HN!8A 个循环& ?% d延伸
#$ ;HN$ :’I产物经电泳分析后!用上海申能博彩
生物科技有限公司的 D*,试剂盒回收目的片段$
按 :S/;M<9公司的快速连接试剂盒操作流程!将
D*,片段连到 RW)XY+M9PV载体上!点击转化
D\A4!提取阳性克隆质粒并酶切图谱分析后!送北
京三博远志科技有限公司测序$
根据 获 得 基 因 序 列 设 计 AoI,’) 引 物%
J"H2@FYI93M#% AoYW’’,,WW+’++’+’’,,W’,,
,+W’’+’Y8o& J"H2@FWI93M%% AoY,’+’W+W’’
,W’,’+’’’,,,’+’,+,WY8o$ AoYI,’)反应条件
# 为% 7! d 8$ P!?% d 8 ;HN!A 个循环& 7! d 8$ P!
?$ d 8$ P!?% d 8 ;HN!A 个循环& 7! d 8$ P!"@ d
8$ P!?% d 8 ;HN!%A 个循环$ AoYI,’)反应条件 %
为% 7! d 8$ P!"@ d 8$ P!?% d 8 ;HN!87 个循环$
?@FA基因植物表达载体的构建
根据获得序列的编码区分别设计包含酶切位点
的引 物! J"H2@FYa#% AoY4349<9,+WWWW,W,WWW,
W,W++W,,’Y8o& J"H2@FWI#% AoY<<9433’+,,,W,,
’’’,,’’,,W’,+WY8o$ 应用宝日医生物技术 "北
京#有限公司的高保真 RVS/TMP4D*,聚合酶进行扩
增!反应体系 %$ 5-% % 5-#$ pRVS/TMP4FJ>MS"X<% C
:0JP#!#1" 5-U*+:"%1A ;;/0’-=##!% 5-J"H2@FY
a#"A ;;/0’-=##!% 5-J"H2@FYI# "A ;;/0’-=##!
# 5-模板!##18 5-超纯水和 $1# 5-RVS/TMP4D*,
聚合酶$ 反应条件为% 7! d预变性 A ;HN& 7! d
# ;HN!AA ‘"A d # ;HN!?% d #1A ;HN!8A 个循环&
?% d延伸 #$ ;HN$ :’I产物回收并加 ,后连接到
到 RW)XY+M9PV载体上测序$ 加,反应体系#$ 5-%
# 5-#$ p:’IFJ>MS"X<% C :0JP#!# 5-D*,聚合
酶!# 5-U,+:和 ? 5-回收 D*,片段$ 反应条件
为% ?% d 8$ ;HN$
测序后将正确的序列构建到植物表达载体
R’,XF(,#8$$ 的多克隆位点$
?@GA拟南芥转化与检测
用电击法将含有目的基因的植物表达载体质粒
转入农杆菌")\,#$A#!参照徐芳等"%$$A#的方法
转化拟南芥$ 直接观察转基因植株的表型!并提取
转基因植株的基因组 D*,!进行 :’I检测$ 提取转
基因阳性植株和野生型拟南芥的 I*,!反转录成
3D*,!用拟南芥的 21U‘"b%?@###作内标"21U‘Y>%
AoY,+WW’’W,+WW+W,WW,+,++’Y8o& 21U‘YS% AoY
W,,W’,+++’’+W+W,,’,,+’WY8o#!来检查目的
基因在转基因植株中的表达情况$ 反应条件为%
7! d预变性 A ;HN& 7! d # ;HN!A" d # ;HN!?% d
# ;HN %$ P!%@ 个循环& ?% d延伸 #$ ;HN$
@8
6第 #$ 期 高志民等% 毛竹 J"H2@F_ 基因的克隆及转化拟南芥初步研究
%6结果与分析
D@?A基因克隆与结构分析
J"H2@FYa和 J"H2@FYI的 :’I产物电泳结果
显示!在 $1? ^T 有 # 条明显的亮带!且随着退火温
度的提高目的条带有增加的趋势!而非特异扩增产
物减弱"图 ##$ 以 A718 d为退火温度进行大量扩
增!将目的片段回收并测序$ 测序结果表明!插入片
段为 ?$7 TR!通过比较分析表明!该片段为 X,D&Y
T/Q基因的部分序列$ 用 J"H2@FYI93M# 与试剂盒
中的通用引物b:X配对!在 AoYI,’)反应条件 # 下
扩增!产物电泳没有明显的目的条带& 将产物稀释
A$ 倍做模板!用 J"H2@FYI93M% 与通用引物 *b:配
对!在 AoYI,’)反应条件 % 下扩增!产物电泳显示
在 $1! ^T 处有一明显条带$ 目的条带经测序后与
先前获得的片段进行拼接!获得长 ??" TR 的 3D*,
序列!包含了 Aob+I"A8 TR#和 # 个完整的开放阅读
框"?%8 TR#!命名为 J"H2@F_ "WMNF9N^ 登记号%
)b8%??@!#$
图 #6梯度 :’I产物电泳结果
aH<5#6D*,>S9<;MN4P9;R0H>HMU TV#1AA17 d产物& %1A"1? d产物& 81A?1@ d产物& !1A718 d
产物& X% # ^T 分 子 质 量 标 记$ 0% AA17 d >S9<;MN4P&
%% A"1? d >S9<;MN4P& 8% A?1@ d >S9<;MN4P& !% A718 d
>S9<;MN4P& X% # ^T ;/0M3J09S;9S^MS5
D@DA序列比较与功能预测分析
序列分析表明!J"H2@F_ 具有典型的植物
X,D&YT/Q基因结构!与已知竹类植物的 X,D&YT/Q
基因相比!在核酸水平 J"H2@F_ 与绿竹 3-H2@F_
"高志民等! %$$? #(麻竹的 @6H2@F_a "田波等!
%$$A#编码区的一致性分别为 771?_!"?18_!其中
仅第 " 位(第 %% 位的碱基与 3-H2@F_ 不同!在
J"H2@F_ 中为 W和 ’!在 3-H2@F_ 中为 ,和 +& 而
在蛋白水平则分别为 #$$_!"717_!其等电点和分
子量与 F/X,D&# 的完全一致$ 同时!J"H2@F_ 编
码的蛋白质与其他物种的 X,D&YT/Q蛋白有着较高
的一 致 性! 其 中 与 水 仙 " Y$%&+##,#*$7"*$ [9S5
&’+)")#+##的 *4X,D&8(石刁柏"2#:$%$5,#-.+&+)$6+##
的 R,2X8 ",,B@8@8A#(藏红花 "1%-&,##$*+G,##的
,W-"9",FE8A%@##(百子莲"25$:$)*’,#:%$"&-=#的
&):#"F,’""7"!#(风信子 "V0$&+)*’,#-%+")*$6+##的
&):#",,+@@$@@#等的一致性都在 @$_以上!其中
与水仙的 *4X,D&8"高志民等!%$$7#一致性最高!
达 @@1$_!与模式植物拟南芥的 )类功能基因
,W-" 的一致性达 A?1%_$ 因此!推测 J"H2@F_ 基
因应属于 )类功能基因$
D@EA植物表达载体的构建与检测
以 J"H2@FYa# 和 J"H2@FYI# 为引物进行扩
增!将目的条带连接到 RW)XY+M9PV载体上测序$
结果显示!扩增片段为 ?8A TR!包含了 J"H2@F_ 基
因的完整编码区"?%8 TR#和酶切位点"#% TR#$ 因
为 J"H2@F_ 基因内部包含 F$&"酶切位点!所以先
分别用 F$&"h<&-I"和 V+)U$hK8$"双酶切将
RF(#%# 的 *2& 终 止 区 域 和 8A& 引 入 到 载 体
R’,XF(,#8$$ 的 多 克 隆 位 点& 然 后 用 K8$ "h
3$9\"双酶切将 J"H2@F_ 基因片段插入到 K8$"
和 3$9\"酶切位点之间!即获得了由 8A& 启动子
调控 J"H2@F_ 基因编码区的植物表达载体!构建过
程如图 % 所示$
根据载体多克隆位点和 J"H2@F_ 基因所包含
的酶切位点!分别选用 V+)U$h<&-I"(K8$" h
3$9\"双酶切!V+)U$(F$&"单酶切载体质粒!酶
切指纹与预期的完全相符 "图 8 #!表明所构建的
J"H2@F_ 基因植物表达载体是正确的$
D@FA拟南芥转化与表型分析
将构建的 J"H2@F_ 基因植物表达载体转入
)\,#$A!应用蘸花法转化拟南芥"’/0=$#!收取转
化后拟南芥种子!经卡那霉素抗性筛选!得到抗性植
株!培养并收获种子再播种$ 对转 J"H2@F_ 基因拟
南芥 +# 代 8$ 个株系的表型观察发现!与正常的拟
南芥野生型相比!转基因株系在苗期就有 " 株莲座
叶卷曲的表型!且随着生长发育!开花明显提前!比
野生型平均提早 ? 天"图 !,#& 有 #A 株只开花!不
结实!且长势较弱"图 !F#& 有 8 株营养生长延长!
直至 ! 个月尚未抽薹"图 !’#$ 转 J"H2@F_ 基因拟
南芥的表型说明 J"H2@F_ 可能参与毛竹发育过程
中由营养生长向生殖生长转化的调控$
提取转 J"H2@F_ 基因拟南芥 +% 代的基因组
D*,!用引物 J"H2@FYa# 和 J"H2@FYI# 进行 :’I
检测$ 结果表明% 阴性对照野生型拟南芥和水均无
特异性条带!而转 J"H2@F_ 基因的植株约在 $5? ^T
78
林 业 科 学 !" 卷6
图 %6J"H2@F_ 基因表达载体的构建
aH<5%6’/NP4SJ34H/N />J"H2@F_ MQRSMPPH/N [M34/S
图 86J"H2@F_ 植物表达载体酶切检测
aH<586+LMR09N4MQRSMPPH/N [M34/S/>J"H2@F_
UHMSMN4SMP4SH34H/N MNKV;MP
#% V+)U $& %% V+)U $h<&-I"& 8% K8$ "h3$9\"& !%
F$&"& X% # ^T 09UUMS5
图 !6转 J"H2@F_ 基因拟南芥植株的表型
aH<5!6:LMN/4VRM/>J"H2@F_ 4S9NP2M*’$6+$)$
,1卷叶& F1早花& ’1发育迟缓$
,1’JS0MU S/PM4M& F1)9S0V>0/ZMSHN<& ’1&4JN45
都有一明显的特征条带"图 A#!证明 J"H2@F_ 基因
已经转入拟南芥$
图 A6转 J"H2@F_ 基因拟南芥植株 :’I检测
aH<5A6:’I9N90VPHP/>4S9NP>/S;MU R09N4P/>
2M*’$6+$)$ >/SJ"H2@F_ #1野生型拟南芥& % =?1转 J"H2@F_ 基因植株& @1水对照& X1
# ^T分子量标记$ #1iH0U 4VRM& % =?1+S9NP>/S;MU R09N4P& @1\%2
3/N4S/0& X1# ^T ;/0M3J09S;9S^MS5
分别以野生型拟南芥和表型明显的转基因阳性
植株"卷叶(早花(延迟开花#的 3D*,为模板!用拟
南芥的21U? 基因作内标!调整3D*,的用量使之丰
度一致后!用引物 J"H2@FYa# 和 J"H2@FYI# 进行
J"H2@F_ 基因表达情况检测$ 结果表明% J"H2@F_
基因在转基因植株"%!8!!#中得到了表达!而野生
型拟南芥没有检测到"图 "#$
86讨论
毛竹是我国重要的经济竹种!也是最受竹农欢
迎的竹种之一!然而造林主要以无性繁殖为主!其品
$!
6第 #$ 期 高志民等% 毛竹 J"H2@F_ 基因的克隆及转化拟南芥初步研究
图 "6转 J"H2@F_ 基因拟南芥植株 I+Y:’I检测
aH<5"6I+Y:’I9N90VPHP/>4S9NP>/S;MU R09N4P/>
2M*’$6+$)$ >/SJ"H2@F_ #1野生型拟南芥& % =!1转 J"H2@F_ 基因植株$
#1iH0U 4VRM& % =!1+S9NP>/S;MU R09N4P5
种来源仅限于对自然变异的选种!杂交育种一直没
有实质性进展$ 应用现代分子生物学技术来研究竹
子开花生物学特性!对于突破常规育种的局限性!加
速育种进程具有重要意义$ 本研究从毛竹 "散生
竹#中分离了 J"H2@F_ 基因!其编码的蛋白质与其
他属种的 X,D&YT/Q有着较高的一致性! 证明
X,D&YT/Q在进化上是高度保守的!尤其是与来自
绿竹"丛生竹#的 F/X,D&# 完全一致!意味着毛竹
与绿竹在系统进化中可能处于极为相近的位置$ 在
对 J"H2@F_ 基因及其编码蛋白序列分析的基础上!
推测该基因为 )类功能基因$
研究表明!)类功能基因在植物由营养生长转
向生殖生长的过程中起着重要作用"(;;HN^ "*$65!
#777#$ 本研究构建 J"H2@F_ 基因过量表达载体并
转化 模 式 植 物 拟 南 芥! +# 代 表 型 表 明!
bcF,J"H2@F_转基因拟南芥与 bcF,@6H2@F_a!
bcF,;H2@F_!bcF,Y*H2@Fb 及 bcF,@2E_ 的转
基因后代有很多相似之处 "田波等!%$$A& \PJ "*
$65! %$$8& 高志民等!%$$7& W9NMPL "*$65! %$$A#!如
开花提早(莲座叶卷曲等$ 同时!分子检测证实了目
的基因在转基因植株内得到表达$ 因此!可以初步
推测 J"H2@F_ 基因可能参与毛竹的花发育!而在毛
竹花发育过程中 J"H2@F_ 基因是如何发挥作用的!
尚需通过竹子转基因来进一步证实$
参 考 文 献
高志民!刘颖丽!李雪平!等5%$$?5一个绿竹 X,D&YT/Q基因的克隆
与序列分析5分子植物育种!A""# % @"" =@?$5
高志民!彭镇华!陈段芬5%$$75中国水仙 Y*H2@Fb 基因全长的克隆
与表达分析5北京林业大学学报!8#"8# % 7" =#$#5
田6波!陈永燕!严远鑫!等5%$$A5一个竹类植物X,D& 盒基因的克
隆及其在拟南芥中的表达5科学通报!A$"%# % #!A =#A#5
徐6芳!熊爱生!彭日荷!等5%$$A5植物遗传转化的新方法% a0/S90
DHR5中国蔬菜!"8# % %7 =8#5
袁金玲!傅懋毅!庄金坤!等5%$$A5几个丛生竹开花授粉特性及麻
竹苗期初步选择5竹子研究汇刊!%!"8# % 7 =#85
,0[9SMKYFJV09)I!-H0eMM[/0J4H/N TMV/NU >0/ZMSP% MQRSMPPH/N HN R/0MN!MNU/PRMS;!3M0P!S//4P9NU 4SH3L/;MP5+LM:09N4G/JSN90!%!"!# % !A? =!""5
,N
X,D&YT/Q’M0!?"#$# % #A"7 =#A@%5
’/MN ) &!XMVMS/ZH4K)X5#77#5+LMZ9S/>4LMZL/S0P% HN4MS934H/NP3/N4S/0HN<>0/ZMSUM[M0/R;MN45*94JSM! 8A8 " "887 # %
8# =8?5
W9/lLH;HN!-HmJMRHNM34H[M;M4L/U >/S
4/490I*, HP/094H/N >S/; T9;T//5’LHNMPMa/SMP4SV&3HMN3M9NU
+M3LN/0/W9NMPL E,!EHV/;H,!XJNM/O!"*$65%$$A5’/NPMS[94H/N />4LM)Y
>JN34H/N >/S>0/S90/S<9N HUMN4H4VHN SH3MSM[M90MU TV4LM9N90VPHP/>
4HPPJM3J04JSMYHNUJ3MU 0/PPY/>Y>JN34H/N ;J49N4P/>4LM;#H2@F_
WJ B!aMSS9NUHK’!O9N/>P^VXa!"*$65#77@5+LMaIb(+ab--X,D&Y
T/QMSMN4H94H/N UJSHN< 2%$8+?-:#+#>SJH4
UM[M0/R;MN45DM[M0/R;MN4!#%A"@# % #A$7 =#A#?5
\PJ \a!\J9N<’\!’L/J -+!"*$65%$$85)34/RH3MQRSMPPH/N />9N
/S3LHU " ;)&+?+,9 W/ZMSI9;PMV# 2>EdY0H^M >0/ZMSHN0/ZMSHN<4H;M:09N4’M0:LVPH/0/(;;HN^ IW\!\9NN9RM0DG!aMSS9SH/& a! "*$65#7775, RM4JNH9
X,D&YT/QS/; [MSMRS/UJ34H[MUM[M0/R;MN45DM[M0/R;MN4!#%""%%# % A##? =A#%"5
-H0eMX,D&YT/Q SJH4 UMLHP3MN3M5 a0/ZMSHN<
*MZP0M4MS!%A% 7 =#75
:MSSV& )!-ML4HXD!aMSN9NUMKMD)!"*$65#7775+LMX,D&YU/;9HN
RS/4MHN ,W,X2b&Y0H^M#A 933J;J094MPHN M;TSV/NH34HPPJMPZH4L
UH[MSPM/SHiMH>0/ZMSUM[M0/R;MN4% >S/; >0/S90
HNUJ34H/N 4//[J0M;/SRL/WMNM4H3P!%7%
#7 =875
!责任编辑6徐6红"
#!