全 文 ：第 !" 卷 第 # 期
$ % & % 年 # 月
林 业 科 学
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马尾松捕光叶绿素 LAX结合蛋白基因 .%&P<5_ 的克隆与原核表达!
王6猛6曹福祥6龙绛雪
"中南林业科技大学林学院6长沙 !&%%%!$
关键词&6 马尾松# 捕光叶绿素 LAX 结合蛋白基因# 序列分析# 原核表达
中图分类号! ’8&<2!"" ;#!72$666文献标识码!-666文章编号!&%%& =8!<<#$%&%$%# =%&8$ =%"
收稿日期& $%%# =&& =$%# 修回日期& $%&% =%& =%#%
基金项目& 湖南省研究生创新基金"U[$%%#X&"7$ # 湖南省教育厅重点项目 "%"-%<%$ # 中南林业科技大学研究生创新基金"$%%8X[%&$ %
!曹福祥为通讯作者%
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N("’)#*5)*)1("A!"(.*5%**6("%(%
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89/’(-.’&6-NH113EFSD U@+-0N1IFDSYDLOV3TSIEFUD10O04DP1LAX".%&$ F3E3ZLTU10E3R NO0JSD3NIOTSTSOLER 0N<41;,
5%,,’14%1% U@+-SDO0HFD G,Yf(GLER G-(*Yf(GJ3SD0RT!ELJ3R LT.%&P<5_"W3E?LEh LUU3TTI0E +05Wc%877<"$5
,D313EFSD 0N.%&P<5_ IT& %"$ X4!ZDIUD U0ESLIETLE 043E O3LRIEFNOLJ33EU0RIEF$8! LJIE0LUIRT!L"8 X4 LER L&"% X4
HESOLET1LS3R O3FI0E LS> ,3ER LER 7 ,3ER O3T43USIV31P!LER L$> X4 f01P"-$ LS7 , 3ER5,D3XI0IEN0OJLSIUTLEL1PTIT
IERIULS3R SDLSSD34)LER J013UH1LOZ3IFDS0NSD34O0S3IE 3EU0R3R XP.%&P<5_ Z3O34O3RIUS3R S0X3>2$! LER $<2#< hH
O3T43USIV31P!LER SD34O0S3IE DLR 0E3UD10O04D1LAX XIERIEFR0JLIE!N0HO4O0S3IE hIELT3(4D0T4D0OP1LSI0E TIS3T!T3V3E +Y
JPOITS0P1LSI0E TIS3T!SZ0U-bfLER UWbfYR343ER3ES4O0S3IE hIELT34D0T4D0OP1LSI0E TIS3T5=%&P<5_ RIT41LP3R DIFD
T3oH3EU3IR3ESISPZISD 41LES.%&F3E3NLJI1PIT01LS3R 4O3VI0HT1PLER ZLTU1HTS3O3R U10T3S0.%&NLJI1PF3E3T0NFPJE0T43OJ
41LEST5,D34O0hLOP0SIU3[4O3TTI0E V3US0O0N.%&P<5_ F3E33EU0RIEF4O0S3IE ZLTU0ETSOHUS3R XPTHXU10EIEFSD3NOLFJ3ES
IES04*,Y$!L" a$LER SD3F3E3ZLT3[4O3TT3R IE -,.9"(4.94% .’/4IERHU3R XP)f,W5,D3J013UH1LOZ3IFDS0NSD3IERHU3R
4O0S3IE ZLTLX0HS$# hH SDLSZLTL44O0[IJLS3LT4O3RIUS3R5
:); <"(=/&6<41;,5%,,’14%1%# 1IFDSDLOV3TSIEFUD10O04DP1LAX XIERIEF4O0S3IE F3E3".%&$# T3oH3EU3LEL1PTIT#
4O0hLOP0SIU3[4O3TTI0E
66光合作用是光合生物将光能转化为化学能!并
同时将无机物转化成有机物贮存在生物体的过程%
现已证明光合生物对光能的吸收’传递和转化都是
在光合膜上具有一定的分子排列和空间构象的色素
蛋白复合体上进行的"郁飞等!$%%&$% 在高等植物
体内!捕光叶绿素 LAX 结合蛋白基因".%&$属于光合
系统基因"GLFDV3EROL!&##<$!其编码的蛋白质与色
素形成捕光色素蛋白复合体".9($!是一类把能量
迅速传至反应中心引起光化学反应的色素蛋白复合
体% 大部分的叶绿素分子都结合在光系统 "
"f’"$和光系统#"f’#$的天然色素蛋白复合物
上% 真核生物的 f’"复合物包括了一系列捕光色
素蛋白即 .9("!现已知道 .9("蛋白由核基因编
码!在细胞质中合成后在引导肽的作用下被运输进
叶绿体并整合到类囊体膜上"郁飞等!$%%&$% .9(
#是一个重要的膜蛋白!是绿色植物叶绿体类囊体
中含量最丰富的一种天线蛋白!行使光能传递’转化
和分配等功能!在植物光合作用中起到关键的作用
"孙钦秒等!$%%%$%
马尾松"<41;,5%,,’14%1%$在我国分布广!数量
最多!在南方各省森林蓄积量中!马尾松占一半以
上% 由于松材线虫的入侵导致大量马尾松感病死
亡!给我国的林业造成重大损失% 在感病后的马尾
松生理变化中!有比较明显的光合作用下降!针叶变
色及叶绿素含量下降的现象"王猛!$%%"$% 关于感
病后松树的生理变化研究的比较多!但是关于其分
子机制的研究还比较少%
本研究根据植物 .%&家族基因保守序列!设计
引物!利用 G,Yf(G和 G-(*技术从马尾松中克隆
到全长 .%&基因!并对该基因构建原核表达载体!在
6第 # 期 王6猛等& 马尾松捕光叶绿素 LAX 结合蛋白基因 .%&P<5_ 的克隆与原核表达
大肠杆菌中诱导表达% 旨在为研究感病后松树生理
变化的分子机制以及病虫害对其影响奠定基础%
>?材料与方法
&2&6材料6&$植物材料6马尾松 $ 年生实生苗购
于湖南省桃江县!移栽苗圃后!取其新鲜叶片用于
试验%
$$菌株与质粒6感受态细胞 @9>/和 ?.$&
"@*7 $ 购自 ,ILEF3E!克隆载体 4W*bY,3LTP和
4*,Y$!L" a$ 分别购自 fO0J3FL公司 和 +0VLF3E
公司%
7$主要试剂6核酸分子质量标准’蛋白分子量
标准’L%M@+-聚合酶’-.’G"’G2""购自 ,LlLGL
公司# (0EU3OSf1LESG+-G3LF3ES购自 )EVISO0F3E#
’b-G,G-(*U@+--J41INIULSI0E hIS购自 (10ES3UD#
@+-凝胶纯化回收试剂盒购自北京鼎国生物科技
公司# 质粒小量提取试剂盒购自 eb*W-# 反转录
试剂盒购自 fO0J3FL% 其他试剂均为国产分析纯%
&2$6方法6&$马尾松总 G+-提取与 U@+-合成
取马尾松实生苗幼嫩新鲜叶片!加入液氮碾磨!转入
&2> J.的离心管!具体步骤按照 (0EU3OSf1LESG+-
G3LF3ES说明书操作!得到的总 G+-样品储存
=8" ‘超低温冰箱中% U@+-第 & 链的合成按照
fO0J3FL公司的反转录试剂盒说明书进行操作!得
到的 @+-第 & 链 =$% ‘保存备用%
$$引物设计与合成6根据松科植物捕光叶绿
素 LAX 结合蛋白基因家族的同源序列设计 f(G引
物!引物序列由上海生工生物工程技术服务公司
合成%
9U4B& >, =-,(WWW,(W,W(W(,,,(=7,# 9U4G&
>, =,((,,(-((,,(-W(,((W(=7,# 7W’f& >, =
-W---,WW-W,---W,,(WWWW-WW(=7,# >W’f& >, =
(,W-(-(,,,,,,WW,WW,(W((,,((=7,%
7$叶绿素捕光蛋白基因克隆与测序6以合成
的 U@+-为模板!进行核心序列 f(G扩增% 引物
9U4B和 9U4G反应条件为& #! ‘预变性 7 JIE#
#! ‘ 7% T!>% ‘ & JIE!8$ ‘ $ JIE!7% 个循环#
8$ ‘延伸 &% JIE!扩增完毕后 ! ‘终止反应% f(G
产物经 &j琼脂糖凝胶电泳后回收’纯化% 将纯化
的 f(G产物与 4W*bY,3LTP载体连接!重组子转化
@9>/大肠杆菌后 78 ‘培养# 挑取单个白色菌落于
78 ‘过夜培养后抽提质粒!f(G鉴定!送上海生工
公司测序% 为了获得基因的全长!根据测序结果设
计引物 7W’f和 >W’f分别与 ’b-G,G-(*试剂盒
通用引物"cfb$配对进行 G-(*扩增% 反应条件
为 #! ‘预变性 7 JIE# #! ‘ 7% T!>< ‘ & JIE!8$ ‘
$ JIE!7% 个循环# 8$ ‘延伸 &% JIE% 扩增产物回收
连接及转化同上!送样测序%
!$序列的拼接与生物信息学分析6根据获得
的核心序列’7,G-(*末端和 >, G-(*末端进行拼
接以获得基因的全长!@+-序列相似性分析在
+(?)站点上的 ?.-’,进行% 推导的氨基酸序列分
析用 W3E3R0U软件!多重序列比对和进化树分析用
/3US0O+,)&%2% 软件和 @+-’SLO软件% 推测蛋白的
相关生物学信息在 DS4& AAZZZ53[4LTP5UDAS001TA中
进行!使用 ’IFEL1f72% ’3OV3O在线工具预测蛋白质
信号肽%
>$表达载体的构建及目的蛋白的诱导表达6
根据所获得的基因全长!采用直接添加酶切位点方
法!设计 & 对引物扩增叶绿素捕光蛋白基因的编码
区!fJB& >, =(-(-,-,WW(--W(,W(WWW-,=7,#
fJG& >, =WWW--,,(,(-,,,W((WWWW-(W=7,!
方框内分别为 -.’G"’G2""酶切位点!划线处为起
始密码子和终止密码子% 以第 & 链 U@+-为模板!
用引物 fJB和 fJG扩增叶绿素捕光蛋白基因的开
放读码框!扩增程序同核心序列扩增程序% 选用
-.’G"’G2""双酶切将目的片段插入同样使用双
酶切的 4*,Y$!L" a$的多克隆位点!形成重组表达
载体% 将重组表达质粒采用热激法转入到感受态细
胞 ?.$&"@*7$!涂布在含有卡那霉素抗性的 .?固
体平板上过夜培养!选取单克隆!经菌液 f(G检测
和双酶切检测后培养过夜% 将菌液稀释 >% 倍于含
有卡那霉素的 .?培养基中震荡培养!待菌液生长
到 -"%% 为 %2> _%2< 时!加入 )f,W进行诱导培养!
收集菌体进行蛋白质电泳分析%
F?结果与分析
$2&6基因的克隆与分析6以马尾松总 G+-反转录
合成的 U@+-为模板!扩增出来产物通过 &j的琼
脂糖凝胶中电泳!得到 & 条约 ">% X4 片段"图 &$%
经过凝胶纯化回收后!按照 fO0J3FL的 4W*bY,3LTP
载体操作流程!连接到载体中!转化 @9>/后在含有
氨苄青霉素培养基上培养!经过蓝白筛选后挑取阳
性克隆后送到上海生工进行测序% 测序结果表明!
插入片段为 "!< X4% 应用 ?1LTS在线软件!将序列与
已经登录的基因进行同源性比较分析!发现所获得
片段与 .%&基因家族有较高的同源性% 使用 7,和
>,末端特异性引物!做 G-(*扩增!引物 7W’f和
cfb扩增产物在 8%% X4 左右有 & 个亮带 "图 $ 中
78&
林 业 科 学 !" 卷6
&$# 引物 >W’f和 cfb扩增产物在 7%% X4 处有 &
个亮带"图 $ 中 $$% 将 f(G产物回收连接后转化!
挑取阳性克隆进行测序%
图 &6G,Yf(G产物电泳图
BIF5&6@+-NOLFJ3ESLJ41INI3R XPG,Yf(G
b& &%% X4 分子质量标记 &%% X4 1LRR3OJLOh3O#
&& G,Yf(G产物 ,D34O0RHUS0NG,Yf(G5
图 $67,G-(*和 >,G-(*f(G产物电泳图
BIF5$6@+-NOLFJ3ESLJ41INI3R XP7,G-(*LER >,G-(*
&& 7,G-(*产物 fO0RHUS0N7,G-(*# $& >,G-(*
产物 fO0RHUS0N>,G-(*# b& &%% X4 分子质量标记
&%% X4 1LRR3OJLOh3O5
通过已经 获得的核心序列 与 7 , G-(*和
>,G-(*序列的拼接得到基因全长 U@+-序列!全长
为 & %"$ X4!含有 & 个完整编码区"<$> X4$!该基因
编码 $8! 个氨基酸’7,非翻译区"&"% X4$!包含 $>
个 401P"-$’>,非翻译区""8 X4$% W3E?LEl登录号
为 Wc%877<"% 对该基因的推导的氨基酸序列进行
fO0S4LOLJ程序预测分析!该基因编码 $8! 个氨基
酸!分子质量为 $<2#< hH!理论等电点为 >2$!!亲水
指数为 %2%>$% 使用 be,)B’(-+对 Wc%877<" 序
列的编码区分析!结果显示序列的编码区第 87 _
$!& 位包含典型的捕光叶绿素 LAX 结合蛋白功能域
"UD10O04DP1LAX XIERIEFR0JLIE$!第 &< _$%!!% _
!$!!> _!8!$!7 _$!> 位为蛋白激酶 (的磷酸化位
点% > _&%!&7 _&&8< _&<7!&<8 _&#$ 位为 +=豆蔻酰化位点!!$ _
!>!!8 _>% 位为 U-bf和 UWbf依赖性的蛋白激酶
磷酸化位点% 该基因命名为 .%&P<5_".%&F3E3NO0J
$2$6与其他物种的 .%&基因比对分析6通过 ?1LTS
软件分析!在 +(?)核酸数据库中!基因序列比较的
得分为 $<8 _& 8"$!其中与 ’87"%7 "黑松 <41;,
)9;1&"(04$序列相似性最高!得分为 & 8"$!一致性为
#"<41;,.’1)’()%$的得分分别为 & 8!" 和 & ">#!一致
性分别为 #j% 在蛋白质数据库中!分值为
!>& _>>%!与 .%&P<5_ 同源性最高的也是欧洲赤松!
得分 >>%% 使用 W3E3R0U软件!对 # 种松科植物的氨
基酸同源性进行比对分析"图 7$% 图中黑色区域为
高度保守的相同氨基酸序列!灰色区域为部分相同
氨基酸序列!白色区域为差异的氨基酸序列% 从分
析结果可以看出!.%&P<5_ 基因编码的蛋白与其他
松科植物的 .%&基因有很高的相似性!与南亚松
"<41;,5"(U;,4$一致性达到 ##2$j!与北美云杉
"<4."% ,4).9"1,4,$一致性最低!为 #%2>j!充分说明
.%&家族基因在进化过程中的保守性% 对上述 # 种
同源性较高的物种的进化树分析表明!种间遗传距
离更近!属间遗传距离较远!与分类学一致"图 !$%
$2764*,YULXYfJ& 基因重组表达载体的检测与原
核表达6根据设计的引物 fJB和 fJG进行 f(G!
扩增产物凝胶电泳显示在 <%% X4 左右有 & 条清晰
条带"图 >$!与预测基因的开放读码框大小相符%
对阳性克隆菌提取质粒进行双酶切检验!电泳检测
在 <%% X4 和 > %%% X4 处各有 & 条带!符合目的基因
和载体片段大小"图 "$!进一步表明 .%&P<5_ 基因
已经成功插入 4*,Y$!L的多克隆位点%
将所克隆的重组表达载体转入到 ?.$& "@*7$
菌株!在 78 ‘条件下培养至 -"%% 为 %2< 时!加入
)f,W至终浓度为 & JJ01).=&进行诱导表达蛋白!取
&!$!7!! D 时间段的菌液进行 &>j ’@’Yf-W*电
泳!在空载体质粒菌液里没有表达目的蛋白条带!而
其他诱导菌在 $# hH 左右有明显的特异条带产生
"图 8$% 对不同浓度的 )f,W对目的蛋白诱导 ! D
表达分析!结果显示当 )f,W浓度逐渐增加时!目的
蛋白"约 $#2% hH$的表达量逐渐增大!当浓度增加
到 %2& JJ01).=&!目的蛋白表达量最大"图 <$% 由
此也解释在 & JJ01).=&浓度下 )f,W在不同诱导时
间表达蛋白无明显差异的原因%
C?讨论
与国际核酸和蛋白质数据库联网进行 ?1LTS比
对分析!.%&P<5_ 相似性最高是松属 "<41;,$植物!
其次为云杉属 "<4."% $% 在松属’云杉属’沙梨
!8&
6第 # 期 王6猛等& 马尾松捕光叶绿素 LAX 结合蛋白基因 .%&P<5_ 的克隆与原核表达
图 76.%&P<5_ 基因编码的氨基酸与其他 .%&基因的编码氨基酸多序列比较
BIF576bH1SI413T3oH3EU3L1IFEJ3EST0NLJIE0LUIRT3EU0R3R XP.%&P<5_ ZISD LJIE0LUIRT3EU0R3R XPSD3RIN3O3ES.%&F3E3T
(-->8!%<& 欧洲云杉 <4."% %&4",# -?l$$>&%& 北美云杉 <4."% ,4).9"1,4,# (-(7<<7%& 小干松 <41;,.’1)’()%# --c<#$>&&
西黄松 <41;,D’12"(’,%# --c<#$>$& 辐射松 <41;,(%24%)%# -(C""<%>& 马尾松 <41;,5%,,’14%1%# --c<#$>!& 南亚松 <41;,5"(U;,4#
(--7$"><& 欧洲赤松 <41;,,#/3",)(4,# --(8<"#%& 黑松 <41;,)9;1&"(045
图 !6不同物种 .%&基因编码蛋白系统进化树分析
BIF5!6fDP10F3E3SIUSO33LEL1PTIT0N4O0S3IET
3EU0R3R XP.%&F3E3
图 >6.%&P<5_ eGB的扩增图
BIF5‘a.%&P<5_ eGB@+-NOLFJ3ESLJ41INI3R XPf(G
b& &%% X4 分子质量标记 &%% X4 1LRR3OJLOh3O#
&& ,D34O0RHUS0N.%&P<5_ eGB5
>8&
林 业 科 学 !" 卷6
图 "6重组表达载体的酶切检测
BIF5"6,D3O3U0JXIELES3[4O3TTI0E V3US0O
UD3Uh3R XPO3TSOIUSI0E 3EQPJ3T
&& G2""A-.’G"# b&& & hX 分子质量标记 & hX 1LRR3OJLOh3O#
b$& @.&%%% 分子质量标记 @.&%%% @+-JLOh3O5
图 86诱导时间对 4*,YULXYfJ& 表达的影响
BIF586,D33[4O3TTI0E 0N4*,YULXYfJ& IE RIN3O3ESSIJ3
b& 蛋白分子质量标准 fO0S3IE J013UH1LOTSLERLOR JLOh3O# && 空
载体 4*,Y$!L" a$ # $ =>& 分别为加入 & JJ01).=&)f,W诱导
下 &!$!7!! D 的表达产物 )ERHU3R 4*,YULXYfJ& LS&!$!7 LER
! D O3T43USIV31P5
图 <6)f,W浓度对 4*,YULXYfJ& 表达的影响
BIF5< ,D33[4O3TTI0E 0N4*,YULXYfJ&
IE RIN3O3ESU0EU3ESOLSI0E 0N)f,W
b& 蛋白分子质量标准 fO0S3IE J013UH1LOTSLERLOR JLOh3O# && 未
加 )f,W的 4*,YULXYfJ& +0EYIERHU3R 4*,YULXYfJ&# $ =>& 分
别为 %2%&!%2%>!%2&!%2> JJ01).=& )f,W终浓度诱导的 4*,Y
ULXYfJ& )ERHU3R ZISD %2%&!%2%>!%2&!%2> JJ01).=& 0N)f,W5
"<#(;,D#(4*’/4% VLO5.;/)%$’野蕉"F;,% &%/&4,4%1%$’
$"51% 04&&%’高粱 " 6’(09;5 &4.’/’($’地中海柏木
" =;D(",,;, ,"5D"(34("1,$’ 稀 脉 浮 萍 " $"51%
D%;.4.’,)%)% $’ 蓖 麻 " 84.41;, .’55;14,$’ 毛 竹
" <9#/’,)%.9#, "2;/4,$’ 风 信 子 " @#%.41)9;,
’(4"1)%/4,$’ 大 麦 " @’(2";5 3;/0%("$’ G4.’)4%1%
,#/3",)(4,等十几个不同的物种!?1LTS比较结果中的
’U0O3分值为 $<8 _& 8"$!其中属内 .%&P<5_ 与黑松
’87"%7 序列相似性最高!’U0O3分值为 & 8"$!一致
性"IR3ESISP$为 #与北美云杉相似性最高!相似性达到 #>j!说明属
内同源性高于属间同源性% 对 .%&P<5_ 编码的氨基
酸序列进行比对!得出了和核酸序列比对相一致的
结论% 在 +(?)蛋 白 质 数 据 库 中 共 搜 索 到 与
.%&P<5_编码氨基酸有一定相似性的 &%% 条序列中!
’U0O3分值最低为 !>&!最高为 >>%!其中相似性最高
是黑松!为 $"87 _$!&位包含典型的捕光叶绿素 LAX 结合蛋白功
能域!其功能可能是与色素分子结合# 蛋白激酶 (
的磷酸化位点均存在毛竹’水稻"R(#Q% ,%)43%$’豌豆
"<4,;5,%)43;5$’胡杨"<’D;/;,";D9(%)4.% $.%&编码
的蛋白上!但是位置和数量不同% U-bf和 UWbf
依赖性的蛋白激酶磷酸化位点!在已报道的禾本科
"WOLJIE3L3$植物中没有发现!+=豆蔻酰化位点的
数目和位置与毛竹差异较大% 这些位点可能与该基
因转录后的调节有关"-13E ")%/5!&##8$%
有研究表明在裸子植物!特别是松柏类植物
.%&基因的表达不受光的调控 "bHhLI")%/5!&##&#
&##$$!并认为这是由于松柏类植物 .%&基因的上游
缺乏光响应顺式因子 "1IFDSYO3T40ETIV3UITY313J3ES$
所致"bHhLI")%/5!&##$$% 对于马尾松.%&基因的调
控还有待进一步的研究% 感染松树枯萎病的马尾松
体内水分减少!造成叶绿素含量降低!影响了马尾松
正常的生理功能!是造成马尾松大量死亡的原因之
一% 研究表明在水分胁迫下叶绿素的丧失!叶绿素
LAX 比值的增加及光合单位的减小都是 .9(蛋白
含量减少所致!故认为 .9(蛋白是水分胁迫易攻击
的一个靶子 "-1X3OS3")%/5!X# /L4LLVH0OI")%/5!
&#<$$% .%&在许多生物和非生物环境胁迫下表达
都会受到影响!从而影响植物的光合作用 "(DHO")
%/5!$%%7# W0JX3O")%/5!$%%"# lHNOPh ")%/5!$%%<$%
.%&P<5_ 基因在大肠杆菌 ?.$& "@*7$中的诱
导发现!在 & JJ01).=&的 )f,W诱导条件下!& D 的
蛋白表达量和 ! D 的蛋白表达量几乎一样!说明推
荐的浓度比较大!在进行 )f,W不同浓度的诱导试
"8&
6第 # 期 王6猛等& 马尾松捕光叶绿素 LAX 结合蛋白基因 .%&P<5_ 的克隆与原核表达
验中发现!当浓度达到 %5& JJ01).=&时已经可以诱
导大量的目的蛋白表达% 本研究获得的马尾松捕光
叶绿素 LAX 基因是否与抗性生理机制相关!尚需进
一步深入研究!对马尾松感病后其生理功能变化的
分子机制研究将是一个复杂而漫长的过程!下一步
的研究工作是 (LX 蛋白的纯化及生理功能的研究%
参 考 文 献
孙钦秒!冷6静! 李良璧!等5$%%%5高等植物光系统#捕光色素蛋
白复合体结构与功能研究的新进展5植物学通报!&8 "!$ & $<#
=7%&5
王6猛5$%%"5湿地松对松材线虫抗病性的主要理化指标影响的研
究5中南林业科技大学硕士学位论文5
郁6飞!唐崇钦!辛越勇!等5$%%&5光系统"" f’"$的结构与功能
研究进展5植物学通报!&<"7$ & $"" =$8>5
-1X3OS3G’!,D0OEX3Okf!BITUHT*.5͵MLS3OTSO3TT3N3UST0E SD3
U0ES3ESLER 0OFLEIQLSI0E 0NUD10O04DP1IE J3T4DP1LER XHER13
TD3LSD UD10O041LTST0NJLIQ35f1LESfDPTI01!>#& 7>& =7>75
-13E kB!+I1TT0E -5&##85G3R0[TIFEL1IEFLER SD3TSOHUSHOL1XLTIT0N
O3FH1LSI0E 0N4D0S0TPESD3TITXP4O0S3IE 4D0T4D0OP1LSI0E5fDPTI01
f1LES!&%%"!$ & <"7 =<"<5
(DHOIE C!-RLJ*!l0QJLY?0FELO.!")%/5$%%75(DLOLUS3OIQLSI0E 0NSZ0
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W0JX3O,k!*SI3EE3f!eHOOC-!")%/5$%%"5,D33[4O3TTI0E 4LS3OET0N
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!责任编辑6徐6红"
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