全 文 ：第 50 卷 第 2 期
2 0 1 4 年 2 月
林 业 科 学
SCIENTIA SILVAE SINICAE
Vol. 50，No. 2
Feb．，2 0 1 4
doi:10．11707 / j．1001-7488．2014020
收稿日期: 2013 － 01 － 01; 修回日期: 2013 － 08 － 11。
基金项目: 国家自然科学基金项目(30671700)。
* 池玉杰为通讯作者。
偏肿革裥菌 Lg-mnp2 基因在构巢曲霉中的表达*
胡美美 池玉杰
(东北林业大学林学院 哈尔滨 150040)
关键词: 偏肿革裥菌; 锰过氧化物酶 2 基因; 构巢曲霉; 转化; 表达
中图分类号: S718. 81 文献标识码: A 文章编号: 1001 － 7488(2014)02 － 0139 － 05
Expression of the Gene Lg-mnp2 Encoding for Manganese Peroxidase 2
(MnP2) from White-Rot Fungus Lenzites gibbosa in Aspergillus nidulans
Hu Meimei Chi Yujie
( School of Forestry，Northeast Forestry University Harbin 150040)
Abstract: The aim of this study was to enhance manganese peroxidase (MnP) gene express by Lenzites gibbosa MnP
production for using Aspergillus nidulans． In this study，an auxotrophic strain，TN02A7，of A． nidulans was used as the
host of L． gibbosa． The conidiophores of TN02A7 were used to produce the protoplasts by different cell wall lyases，
including lywallzyme，cellulase and snailase which were mixed together by 1∶ 1∶ 1 for effectively break down the wall and
produce protoplasts． PEG /CaCl2 were used to mediate transformation of L． gibbosa，containing a gene encoding for
manganese peroxidase 2 (Lg-MnP2)，into the TN02A7 protoplast． The newly obtained transformant strain，TN02A7-Lg-
mnp2，and TN02A7 were cultured in the same shaking medium containing lignin and the MnP activity was detected． The
result showed that TN02A7-Lg-mnp2 could produce MnP activity up to 17 U·L － 1 in 96 h，while TN02A7 did not produce
MnP activity at any time，indicating that the gene Lg-mnp2 had been successfully transformed into TN02A7-Lg-mnp2 and
expressed in lignin environment． This study provided a new method to produce MnP．
Key words: Lenzites gibbosa; Lg-mnp2; Aspergillus nidulans; transformation; expression
锰过氧化物酶(MnP; EC1． 11． 1． 13)是真菌分
泌的胞外过氧化物酶，广泛存在于木材白腐菌中，通
常以多种同工酶的形式存在。MnP 在生物修复和
生物制浆领域具有重要作用，其可以降解土壤和废
水中的 DDT、多环芳烃、多氯联苯、含有苯环的偶氮
与叠氮化合物，以及其他木质素结构。探索 MnP 基
因的高效表达，目的是为提高其产量。大肠埃希菌
(Escherichia coli) (Whitwam et al．，1995; 1996)、巴
斯德毕赤酵母(Pichia pastoris) (Gu et al．，2000)、构
巢曲霉 ( Aspergillus nidulans ) ( Ruiz-Dueńas et al．，
1999)等是其异源表达的 3 种载体。由于在原核生
物和酵母中表达时，蛋白翻译后的加工修饰机制不
如丝状真菌完善，血红素成为 MnP 酶活性的主要限
制性因素。丝状真菌表达系统还具有较完善的蛋白
发酵工艺和加工技术。构巢曲霉的转化方法建立之
后(Tilburn et al．，1983)，其转化系统的研究与应用获
到了较好的发展(Koukaki et al．，2003)。目前国外已
有几种白腐菌的 mnp 基因在丝状真菌中表达的一些
研究(Stewart et al．，1996; Li et al．，2001)，但国内尚
缺乏这方面的报道。2001 年发现构巢曲霉适合 mnp
等外源基因的有效表达(Larrondo et al．，2001)。
笔者在首先扩增到白腐真菌偏 肿革 裥菌
(Lenzites gibbosa)锰过氧化物酶 2 基因(Lg-mnp2)的
基础上，继续研究 Lg-mnp2 在构巢曲霉中的表达。
1 材料与方法
1. 1 试验材料 白腐菌偏肿革裥菌菌株 CB1 由采
自于长白山的子实体上自行分离得到。转化菌株:
构巢曲霉尿嘧啶尿苷营养缺陷型菌株 TN02A7，在
YUU 试管斜面上保存于 4 ℃冰箱。整合型质粒表
达载体: pLB01 ( 6 000 bp，Xba I、BamH I 位点，
pyr4)。2010 年 11 月南京师范大学陆玲教授赠送菌
林 业 科 学 50 卷
株 TN02A7 和质粒 pLB01。目的基因载体质粒:自
我构建好的质粒 pMDTM 18-T /Lg-mnp2，携带有偏肿
革裥菌菌株的 Lg-mnp2 基因 1 100 bp 的完整编码序
列(CDS)，该基因两侧分别带有 Xba I 和 BamH I 酶
切位点，保存在 － 80 ℃冰箱。纤维素酶( cellulase)
和蜗 牛 酶 ( snailase ): 华 美 生 物 公 司; 溶 壁 酶
( lywallzyme):广东微生物研究所; 其他药品购自德
美公司。
1. 2 培养基和转化用溶液 丰富培养基 YAG、
YAGK、YUU、YUUK 和 MM 按照胡美美等(2013)的
方法制备。
转化用溶液 1，2，3，4，5 及原生质化溶液按照曹
进玲(2011)的方法进行配制和贮存，其中，原生质
化溶液使用 A，B，C，D 4 种酶解处理方法，A，B，C
方法为分别加入溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶，D 方法
为加入按 1∶ 1∶ 1比例混合的上述 3 种酶。
1. 3 构建重组质粒 用 XbaI、BamH I 分别对
pMDTM 18-T / Lg-mnp2 质粒和 pLB01 质粒进行双酶
切，回收目的产物，进行连接转化。提取重组质粒
pLB01 /Lg-mnp2，然后用 Lg-mnp2 基因表达用双酶
切引物 (上游引物: 5-GCTCTAGATCCCCTTCAAA
GCCATCTCC-3，下划线为酶切位点 XbaI; 下游引
物: 5-CGGGATCCTGGGCATCCGATGCAATG-3，下
划线为酶切位点 BamH I)进行双酶切验证。酶切体
系:重组质粒 4 μL，BamHⅠ 0. 5 μL，XbaⅠ 0. 5 μL，
100 × BSA 0. 2 μL，10 × NEB Buffer4 2 μL，ddH2O 补
足至 20 μL。进行 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 4 构巢曲霉菌株 TN02A7 原生质体的制备、转化
与筛选 根据胡美美等 (2013) 的研究，进行菌株
TN02A7 原生质体酶解制备方法的摸索。4 种原生
质溶液中加入的酶量见表 1。按照该方法进行了 3
次重复制备原生质体，然后采用 CaCl2 / PEG 介导的
方法进行转化。试验前将枪头放置冰箱预冷，分别
吸取原生质体 100 μL、重组质粒 10 ～ 20 μL(DNA
浓度至少 500 ng·μL － 1，即加入 5 μg 以上的 DNA)
与 50 μL 溶液 4，加入到离心管中，轻轻混匀; 以上
操作均在冰上进行。冰浴 20 min 后。再加入 1 mL
溶液 4，混匀，在 26 ℃条件下热激 20 min。
将 YAGK 固体培养基在 45 ℃条件下加热，取
25 mL 加入转化后的原生质体悬液中，马上混匀，倒
入无菌的培养皿中，保持 30 ℃过夜。次日开始在
37 ℃条件下培养 5 天。挑取菌落，划线接于 YAGK
上培养 5 天，进行筛选并计数。然后，继续在 YAGK
培养基上划线筛选生长性状稳定的转化子。将菌株
TN02A7 分别接种在 YUUK 和 YAGK 培养基上用于
生长对照培养。
表 1 4 种原生质化溶液中加入的酶量
Tab． 1 The added amount of enzyme in 4 protoplasm solution
酶解处理
Enzymatic
treatment
溶壁酶
Lywallzyme /
( g·L － 1 )
纤维素酶
Cellulase /
( g·L － 1 )
蜗牛酶
Snailase /
( g·L － 1 )
A
B
C
D
0. 2
0. 0
0. 0
0. 2
0. 0
0. 2
0. 0
0. 2
0. 0
0. 0
0. 2
0. 2
1. 5 转化子菌株的 PCR 验证 收集转化子菌株菌
丝，提取基因组 DNA，然后用扩增基因 Lg-mnp2 完
整编码序列的表达用双酶切引物(见 1. 3)进行目的
基因的 PCR 验证。通过电泳回收目的片段，将目的
片段进行连接转化，测序 (上海英俊生物技术有限
公司)。
1. 6 转化子菌株 Lg-mnp2 基因的诱导表达与酶活
性测定 将原营养缺陷体菌株 TN02A7 与转化子菌
株 TN02A7-Lg-mnp2 分别在 YUU 和 YAGK 固体培
养基上培养 4 天，然后用无菌水分别收集孢子并计
数，调制成 3 × 108个·mL － 1相同浓度的孢子悬液，各
取 300 μL 分别接种于含有 50 mL MM 液体培养基
的三角瓶中，该 MM 液体培养基添加了 1% 的甘油
及 2 g 山杨 ( Populus davidiana) 木屑用以诱导 Lg-
mnp2 基因的表达，于 35 ℃、200 r·min － 1下培养。另
外，对于菌株 TN02A7，在 MM 液体培养基中还添加
了 130 mg·L － 1的尿嘧啶和 120 mg·L － 1的尿苷。分
别在培养后 0，24，48，72，96，120 h 取 1 mL 培养液，
设置 3 个重复，在6 000 r·min － 1下离心 2 min 后，吸
取上清液，测定 MnP 活性。酶活性检测方法按照闫
洪波(2009)的方法进行。
2 结果与分析
2. 1 重组质粒的鉴定 重组质粒的长度应为7 100
bp。进行 XbaⅠ、BamHⅠ双酶切验证，获得 2 个条
带，分别为1 000 bp 和6 000 bp 的片段(图 1)，说明
基因 Lg-mnp2 已经连接到了 pLB01 质粒载体上，重
组质粒 pLB01 /Lg-mnp2 成功得到。
2. 2 原生质体的获得 在 37 ℃、250 r·min － 1条件
下培养构巢曲霉的分生孢子，镜检观察到孢子萌发
达到 50% 以上，需要 7 ～ 10 h。在 30 ℃、150 r·
min － 1条件下酶解脱壁，大多数孢子形成原生质体
时，大约需要 3 h。
3 次重复制备原生质体并取平均值，结果表明:
D 组原生质化率最高，3 h 时原生质化率能达到
80%以上。而单一酶的 A，B，C 3 组仅在 50% ～
65%之间(表 2)。采用 D 组的酶液组合获得原生质
体的情况见图 2。
041
第 2 期 胡美美等: 偏肿革裥菌 Lg-mnp2 基因在构巢曲霉中的表达
图 1 重组质粒 pLB01 /Lg-mnp2 双酶切产物
Fig． 1 Digested product of recombinant plasmid pLB01 /Lg-mnp2
1． Marker 15 000;2．样品 Sample．
表 2 不同酶解处理 3 h 后的原生质体产生率
Tab． 2 The rate of protoplast production
by different enzymatic treatments
酶解处理
Enzymatic treatment
生产率
Rate of protoplast production (% )
A 62. 02 ± 2. 08
B 54. 11 ± 1. 59
C 65. 58 ± 2. 15
D 81. 76 ± 3. 05
图 3 转化子 TN02A7-Lg-mnp2 和菌株 TN02A7 的生长状况
Fig． 3 The growth of transformant TN02A7-Lg-mnp2 and TN02A7 strain
a．转化子在 YAGK 培养基上正常生长; b．非转化子在 YAGK 培养基上生长受抑制;
c． TN02A7 在 YUUK 培养基上正常生长; d． TN02A7 在 YAGK 培养基上生长受抑制;
a． A transformant normally grew in YAGK medium; b． Several non-transformants grew suppressed in YAGK medium;
c． TN02A7strain normally grew in YUUK medium; d． TN02A7strain non-transformants grew suppressed in YAGK medium．
图 2 溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶混合酶解制得的原生质体
Fig． 2 Protoplasts produced by mixed enzymes of lywallzyme，
cellulase，and snailase
2. 3 转化子的筛选 将转化后的原生质体悬液混
入到 YAGK 平板培养基上，置于 30 ℃条件下过夜，
在 37 ℃条件下培养，5 天后将生长出来的所有菌落
在 YAGK 培养基上划线，再培养 5 天后，发现有些菌
落能在 YAGK 培养基上生长良好，能长出绿色的菌
体(包括菌丝和孢子)，与 TN02A7 菌株正常生长时
的形态一致，说明成功获得转化子 TN02A7-Lg-mnp2
(图 3a); 而有些菌落生长在 YAGK 培养基上表现
141
林 业 科 学 50 卷
为萎缩状的红褐色小菌落，说明这些为非转化子，它
们的生长形态与菌株 TN02A7 在 YAGK 培养基上生
长的形态一致(图 3b)。试验重复 3 次。通过统计发
现，在 5 μg 质粒 DNA 、108mL － 1孢子浓度条件下能获
得 10 ～ 12 个转化子，生长特性在进行 3 代培养后仍
很稳定。菌株 TN02A7 在 YUUK 和 YAGK 上生长的
形态分别如图 3c，d 所示。
2. 4 转化子菌株的 PCR 验证 进行转化子基因组
DNA 的 PCR 反应，结果获得一个约 1 200 bp 的
DNA 片段(图 4)。测序为1 161 bp的核苷酸序列，
经过比对，与偏肿革裥菌的 Lg-mnp2 基因完整编码
序列结果完全一致，说明已经成功获得转化子菌株。
图 4 转化子 MnP 完整编码序列的双酶切引物 PCR 验证
Fig． 4 The PCR identificaion of double digestion
primers of transformants
1. Marker 2 000; 2. 样品 Sample．
2. 5 转化子菌株 Lg-mnp2 基因的诱导表达与酶活
性测定 MM 液体培养基中加入 2 g 山杨木屑和
1%的甘油，转化子菌株 TN02A7-Lg-mnp2 在该培养
基中培养，培养条件为 200 r·min － 1、35 ℃、120 h。
培养期间提取的酶液检测到 MnP 的活性，虽然活性
较低，也表明基因 Lg-mnp2 已经成功地被转化到
TN02A7-Lg-mnp2 中，并在木质素环境下得到表达。
MnP 活性在 0 ～ 72 h 上升缓慢，72 ～ 96 h 迅速上
升，96 ～ 120 h 迅速下降; 以 96 h 酶活性最高，为 17
U·L － 1。菌株 TN02A7 在添加了 1% 的甘油、2 g 山
杨木屑及 130 mg·L － 1的尿嘧啶和 120 mg·L － 1的尿
苷的 MM 液体培养基中培养，培养条件为 35 ℃、
120 h、200 r·min － 1，期间提取酶液始终未检测到
MnP 的活性，说明菌株 TN02A7 没有 MnP 基因表
达。酶活性检测结果见图 5。
3 讨论
建立真菌遗传转化系统主要从受体菌株、遗传
转化法和选择性标记等方面考虑。转化的方法主要
图 5 菌株 TN02A7-Lg-mnp2 与 TN02A7 的 MnP
活性检测
Fig． 5 The MnP activity determination of the strain
TN02A7-Lg-mnp2 and TN02A7
有基因枪转化法、电击转化法、农杆菌介导转化法、
PEG /CaCl2转化法等(黄卫等，2000; 李娟等，2006)。
基因枪法不用原生质体，操作简单、快速，但需要昂
贵的设备，转化率低，在实践应用中受到一定的限制
(王金良等，2010); Herzog 等(1996)采用基因枪法
和原生质体法进行构巢曲霉的转化，发现基因枪法
转化率低于传统的 PEG 介导的原生质体转化方法，
但其转化子的稳定性却较高。电击法操作简便，但
转化率不高。根癌农杆菌( Agrobacterium)既可以介
导原生质体的转化，也可以介导生长和发育中的菌
丝体、孢子的转化，但根癌农杆菌对同一菌株各种受
体材料的侵染力不尽相同，转化效率存在较大差别;
有的菌株只有萌发的孢子才能实现转化 (Abuodeh
et al．，2000)，有的菌株如根霉则需要制备原生质体
才能实现转化(Michielse et al．，2004)，而有的菌株
如核盘菌目前还未能利用根癌农杆菌实现转化(钱
科等，2012)。原生质体制备虽然较繁琐，但是其中
的 PEG /CaCl2法仍是最为常用的制备方法，具有操
作简便、纯合性转化子易获得、原生质体作为受体细
胞具有群体数量大等优点(王金良等，2010)，是通
过在培养物中加入 PEG 等多聚物协助基因转移，以
促使原生质体融合的方法(陈凤，2012)。
通常采用酶解法消化细胞壁以制备原生质体，制
备原生质体的材料一般是幼嫩的菌丝、正在萌发中的
新鲜分生孢子和担孢子。本试验即采用了刚出现芽
管时的构巢曲霉分生孢子来制备原生质体，这时的孢
子细胞壁薄，细胞壁容易被酶解。原生质体制备过程
中当观察到孢子细胞内有空泡时，表明已获得原生质
体。由于原生质体容易破裂，在后续试验中均要温和
操作，离心转速不能超过3 000 r·min － 1。
Koukaki 等(2003)用构巢曲霉萌发中的分生孢
子和不同生长阶段的幼嫩菌丝体细胞来制备原生质
体，采用 100 mg·mL － 1的 Glucanex 酶解 60 ～ 90 min，
241
第 2 期 胡美美等: 偏肿革裥菌 Lg-mnp2 基因在构巢曲霉中的表达
获得了 50%的最高原生质化率，并发现当分生孢子
刚出现芽管时(自接种培养 4 h 30 min 后)制备原生
质体其转化效率最高，当孢子形成幼嫩菌丝体后
(自接种培养 5 h 15 min 后)转化率开始下降。酵母
的细胞壁成分比较简单，A． nidulans 的细胞壁成分
比较复杂，单一的细胞壁裂解酶脱壁作用也较单一，
为了达到理想的效果，需要使用多种酶共同发挥协
同作用。本试验摸索了构巢曲霉分生孢子原生质体
制备的酶解方法，即使用溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶
3 种酶并以 1∶ 1∶ 1的比例混合，在 30 ℃、150 r·min － 1
下进行酶解脱壁处理 3 h 时，获得了高达 81. 76%的
原生质化率。
丝状真菌原生质体的转化一般是在一定浓度
CaCl2、PEG 等溶液中，加入制备好的原生质体细胞
和目的质粒 DNA，进行转化。转化过程需要在一定
的高渗透压下进行，CaCl2是维持渗透压的稳定剂;
而高浓度的 PEG 能促进细胞间彼此聚合，从而有利
于 DNA 的转化。因此，CaCl2、PEG 都是原生质体转
化不可缺少的成分。Herzog 等 (1996)在制备原生
质体时加入了 50 mmol·L － 1 CaCl2、60% PEG 4000，
结果在 106·mL － 1孢子浓度、10 μg 质粒 DNA 条件下
得到 16 ～ 24 个转化子，本试验原生质转化效果良
好，在 108·mL － 1孢子浓度、5 μg质粒 DNA 条件下，
在原生质转化溶液中加入了100 mmol·L － 1 CaCl2、
25%的 PEG6000，得到 10 ～ 12 个转化子，对转化子
连续传 3 代培养，它们的生长特性均十分稳定。这
与 Herzog 等(1996)的研究结果相一致。
本试验运用异源表达的策略，通过构建重组质
粒 pLB01 /Lg-mnp2，对菌株 TN02A7 的分生孢子进
行了溶壁酶、纤维素酶和蜗牛酶 3 种酶解原生质体
化的摸索，将白腐菌偏肿革裥菌的 Lg-mnp2 基因以
PEG /CaCl2介导的原生质体转化方法转入到了构巢
曲霉中，获得了携带有偏肿革裥菌 Lg-mnp2 基因的
构巢曲霉转化子菌株 TN02A7-Lg-mnp2，实现了白腐
菌 mnp 基因在丝状真菌构巢曲霉中的诱导表达，其
在 96 h 时检测到酶活性达到最高为 17 U·L － 1，为生
产 MnP 和提高 MnP 产量提供了新的途径。
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(责任编辑 王艳娜 朱乾坤)
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