全 文 ：第 源愿 卷 第 苑 期
圆 园 员 圆 年 苑 月
林 业 科 学
杂悦陨耘晕栽陨粤 杂陨蕴灾粤耘 杂陨晕陨悦粤耘 灾燥造郾 源愿袁晕燥郾 苑允怎造援 袁圆 园 员 圆
收稿日期院圆园员员 原 园苑 原 圆猿曰 修回日期院圆园员员 原 员圆 原 圆员遥
基金项目院国家自然科学基金项目渊猿园愿员缘苑远曰猿员员苑员远圆园冤曰 教育部高等学校博士点专项基金项目渊圆园员员园员愿圆员员园园园源冤曰 重庆市自然科学基金
重点项目渊圆园园怨月粤员园园源冤遥
鄢 罗克明为通讯作者遥
过量表达 蕴粤砸猿和 月遭糟澡蚤贼员以提高毛白杨
对叶枯病的抗性鄢
黄摇 艳摇 刘摇 虹摇 袁摇 丽摇 贾之春摇 罗克明
渊西南大学生命科学学院摇 三峡库区生态环境教育部重点实验室摇 西南大学资源植物研究所摇 重庆 源园园苑员缘冤
摘摇 要院摇 利用转基因技术将多种抗病基因共同转入毛白杨中以提高其抗性袁从而获得毛白杨抗病新品种是目前
解决杨树真菌病害的主要研究方向之一遥 本研究通过根癌农杆菌介导的二次遗传转化袁将来源于球孢白僵菌几丁
质酶基因 月遭糟澡蚤贼员 转入过量表达无色花色素还原酶基因 蕴粤砸猿 转基因毛白杨中袁实时定量 孕悦砸显示 月遭糟澡蚤贼员 与 蕴粤砸猿
均能有效表达袁离体抗病试验显示 月遭糟澡蚤贼员 垣 蕴粤砸猿 共表达转基因毛白杨细胞粗提液对杨树叶枯病菌具有明显抑制
作用袁进一步将叶枯病菌接种在转基因和非转基因毛白杨叶片上培养 猿园 天袁转基因植株的感病面积均低于非转基
因植株且 月遭糟澡蚤贼员 垣 蕴粤砸猿 共表达转基因株系抗病效果更明显遥 上述抗病试验结果表明院蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 在杨树中共
表达可提高其对叶枯病的抗性遥
关键词院摇 蕴粤砸猿曰 月遭糟澡蚤贼员曰 二次遗传转化曰 毛白杨曰 杨树叶枯病
中图分类号院杂苑远猿郾 员摇 摇 摇 文献标识码院粤摇 摇 摇 文章编号院员园园员 原 苑源愿愿渊圆园员圆冤园苑 原 园园怨圆 原 园远
韵增藻则藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蕴粤砸猿 葬灶凿 月遭糟澡蚤贼员 郧藻灶藻泽 蚤灶 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟
孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬 砸葬蚤泽蚤灶早 贼澡藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 粤造贼藻则灶葬则蚤葬 葬造贼藻则灶葬贼葬
匀怎葬灶早 再葬灶 摇 蕴蚤怎 匀燥灶早摇 再怎葬灶 蕴蚤摇 允蚤葬 在澡蚤糟澡怎灶摇 蕴怎燥 运藻皂蚤灶早
渊 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣 砸藻泽燥怎则糟藻泽 月燥贼葬灶赠 燥枣 杂燥怎贼澡憎藻泽贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠摇 运藻赠 蕴葬遭燥则葬贼燥则赠 燥枣 耘糟燥鄄耘灶增蚤则燥灶皂藻灶贼泽 燥枣 栽澡则藻藻 郧燥则早藻泽 砸藻泽藻则增燥蚤则
砸藻早蚤燥灶 燥枣 酝蚤灶蚤泽贼则赠 燥枣 耘凿怎糟葬贼蚤燥灶摇 杂糟澡燥燥造 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 杂燥怎贼澡憎藻泽贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠摇 悦澡燥灶早择蚤灶早 源园园苑员缘冤
粤遭泽贼则葬糟贼院摇 孕造葬灶贼 早藻灶藻贼蚤糟 藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 燥枣枣藻则泽 葬灶 葬造贼藻则灶葬贼蚤增藻 燥责责燥则贼怎灶蚤贼赠 贼燥 藻灶澡葬灶糟藻 责造葬灶贼 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 枣怎灶早葬造 责葬贼澡燥早藻灶泽援 陨灶
贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠袁 葬 糟澡蚤贼蚤灶葬泽藻 早藻灶藻 渊月遭糟澡蚤贼员冤 枣则燥皂 月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬 憎葬泽 蚤灶贼则燥凿怎糟藻凿 蚤灶贼燥 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥枣 悦澡蚤灶藻泽藻 憎澡蚤贼藻
责燥责造葬则 渊孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬冤 憎澡蚤糟澡 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻造赠 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻泽 蕴粤砸猿 增蚤葬 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂鄄皂藻凿蚤葬贼藻凿 则藻贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶援 栽澡藻
藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 月遭糟澡蚤贼员 葬灶凿 蕴粤砸猿 憎葬泽 凿藻贼藻糟贼藻凿 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 遭赠 则藻葬造 贼蚤皂藻鄄孕悦砸援 陨灶 增蚤增燥 葬泽泽葬赠泽 凿藻皂燥灶泽贼则葬贼藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻
贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责燥责造葬则 责造葬灶贼泽 凿蚤泽责造葬赠藻凿 葬 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼 则藻凿怎糟贼蚤燥灶 蚤灶 贼澡藻蚤则 凿蚤泽藻葬泽藻 泽赠皂责贼燥皂泽 葬枣贼藻则 蚤灶枣藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 粤造贼藻则灶葬则蚤葬 葬造贼藻则灶葬贼葬
糟燥皂责葬则藻凿 贼燥 糟燥灶贼则燥造 责造葬灶贼泽援 栽澡藻泽藻 则藻泽怎造贼泽 泽怎早早藻泽贼 贼澡葬贼 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 蕴粤砸猿 葬灶凿 月遭糟澡蚤贼员 早藻灶藻泽 糟葬灶 遭藻 藻曾责造燥蚤贼藻凿
贼燥 蚤皂责则燥增藻 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 枣怎灶早葬造 责葬贼澡燥早藻灶泽 蚤灶 贼澡藻 责燥责造葬则援
运藻赠 憎燥则凿泽院摇 蕴粤砸猿曰 月遭糟澡蚤贼员曰 则藻贼则葬灶泽枣燥则皂葬贼蚤燥灶曰 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬曰 粤造贼藻则灶葬则蚤葬 葬造贼藻则灶葬贼葬
摇 摇 毛白杨为我国重要的民用和工业用材袁随着其
种植面积的增加袁各种病害也日趋严重遥 叶枯菌
渊粤造贼藻则灶葬则蚤葬 葬造贼藻则灶葬贼葬冤是杨树主要真菌病原体之一袁
可导致其提前落叶袁丧失绿化作用袁仅依靠化学防治
等常规病害治理方法已经不能从根本上解决该问
题遥 而植物防卫过程往往存在多个基因协同作用的
情况袁随着植物基因工程技术的不断发展袁以转基因
方式将不同来源的抗病基因同时导入杨树袁提高其
对叶枯病抗性具有重要意义遥
几丁质酶在植物防御真菌病害时意义重大袁其
主要作用是降解真菌细胞壁主要成分几丁质袁以妨
碍病原真菌的生长遥 过量表达来源于不同物种中的
几丁质酶基因可以增强转基因植物对真菌病的抗
性袁同时延缓病程渊匀燥则蚤噪燥泽澡蚤 藻贼 葬造援袁 员怨缘怨曰 蕴燥则蚤贼燥 藻贼
葬造援袁员怨怨愿曰 月燥造葬则 藻贼 葬造袁 圆园园园曰 酝葬则藻澡葬灶贼 藻贼 葬造援袁 员怨怨愿冤遥
孟亮等渊圆园园源冤利用植物几丁质酶基因转化美洲黑
杨渊孕燥责怎造怎泽 凿藻造贼燥蚤凿藻泽冤袁提高了其对部分真菌性病害
的抗性遥 几丁质酶基因 月遭糟澡蚤贼员 来源于球孢白僵菌
摇 第 苑 期 黄摇 艳等院 过量表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 以提高毛白杨对叶枯病的抗性
渊月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬冤袁本实验室已将其成功导入毛
白杨中袁发现其对杨树叶枯病具有良好的抗病效果
渊允蚤葬 藻贼 葬造援袁圆园员园冤遥
植物黄酮类化合物在植物抗病方面扮演着重要
角色袁其中单宁能直接阻碍病原微生物尤其是真菌
的侵染和发育渊李武汉等袁 员怨怨缘曰 石雪辉等袁 员怨怨苑曰
刘国坤等袁 圆园园猿冤袁蕴粤砸是单宁代谢合成过程中的关
键酶基因袁在前期工作中袁本实验室成功克隆了杨树
单宁代谢合成过程中的关键基因 蕴粤砸猿袁将其导入毛
白杨中过量表达袁打破单宁合成代谢途径中的限速
步骤袁单宁合成量显著提高遥 抗病试验发现院 单宁
含量与转基因植株的抗病性成正相关关系渊再怎葬灶
藻贼 葬造援袁 圆园员圆冤遥
基于上述结果袁本研究将具有良好抗病效果的
球孢白僵菌几丁质酶基因 月遭糟澡蚤贼员 通过二次转化转
入 蕴粤砸猿 过量表达的毛白杨中袁获得同时过量表达
蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 基因毛白杨渊贾之春等袁圆园员员冤袁探讨
了作用机制不同的 圆 种抗病相关基因之间是否具有
协同抗病效果袁期望为杨树转基因抗病工程育种提
供一条新的思路遥
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
根癌农杆菌 渊 粤早则燥遭葬糟贼藻则蚤怎皂 贼怎皂藻枣葬糟蚤藻灶泽冤 菌株
蕴粤月源源园源袁质粒 责缘 原 月遭糟澡蚤贼员袁以及二次遗传转化中所
用植物材料超量表达 蕴粤砸猿 毛白杨 渊 孕燥责怎造怎泽
贼燥皂藻灶贼燥泽葬冤均为本实验室保存遥 杨树叶枯菌为由西
北农林科技大学胡景江教授惠赠遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 二次遗传转化与转基因植株获得摇 二次遗
传转化所用的材料为 蕴粤砸猿 过量表达毛白杨无菌
苗袁筛选基因为 匀赠早袁用含 责缘 原 月遭糟澡蚤贼员 质粒的根癌
农杆菌菌株 蕴粤月源源园源 二次转化 蕴粤砸猿 过量表达毛白
杨袁筛选基因为 晕孕栽陨陨袁具体过程按 允蚤葬 等渊圆园员园冤进
行遥 待转基因生根苗长至 圆 糟皂 左右时移栽至温室
土壤中培养遥
员郾 圆郾 圆摇 转基因植株的 孕悦砸检测摇 以二次转基因毛
白杨基因组 阅晕粤 为模板袁通过扩增标记基因 匀赠早尧
晕孕栽陨陨 和目的基因 月遭糟澡蚤贼员 进行筛选遥 利用 灾藻糟贼燥则
晕栽陨愿 和 阅晕粤 杂贼葬则生物学软件设计目的基因特异性
引物袁由金思特生物科技有限公司代为合成遥 引物
序列如表 员 所示遥
孕悦砸反应条件为 怨源 益预变性 猿 皂蚤灶袁然后 怨源 益
变性 猿园 泽尧缘远 益退火 猿园 泽尧苑圆 益延伸 员 皂蚤灶袁共 猿缘 个
循环袁最后 苑圆 益延伸 员园 皂蚤灶遥 扩增产物用 员豫琼脂
糖凝胶电泳检测遥
表 员摇 本研究所涉及的引物序列
栽葬遭援 员摇 孕则蚤皂藻则泽 怎泽藻凿 蚤灶 贼澡蚤泽 泽贼怎凿赠
基因 郧藻灶藻泽 引物 孕则蚤皂藻则泽
晕孕栽陨陨 云院缘忆 原 粤郧郧悦栽粤栽栽悦郧郧悦栽粤栽郧粤悦栽郧郧 原猿忆砸院缘忆 原 栽悦郧郧郧粤郧悦郧郧悦郧粤栽粤悦悦郧栽粤 原猿忆
月遭糟澡蚤贼员 云院缘忆 原 栽栽悦悦粤栽栽郧栽栽郧郧悦栽栽悦悦粤悦悦 原猿忆砸院缘忆 原 悦郧栽粤悦郧栽 粤粤栽粤郧栽悦悦悦粤悦悦 原猿忆
匀赠早 云院缘忆 原 粤栽悦郧郧粤悦郧粤栽栽郧 悦郧栽悦郧悦粤栽悦 原猿忆砸院缘忆 原 郧栽郧栽悦 粤悦郧栽栽郧悦粤粤郧粤悦悦栽郧 原猿忆
蕴粤砸猿 云院缘忆 原 悦郧郧栽郧粤栽郧郧郧粤悦粤郧栽栽粤粤粤郧 原猿忆砸院缘忆 原 悦栽郧栽郧粤栽郧郧栽郧粤悦栽悦栽郧郧郧悦粤郧悦 原猿忆
择贼蕴粤砸猿 云院缘忆 原 悦悦栽悦悦粤粤郧悦粤粤栽悦栽郧悦栽粤粤郧悦粤悦栽 原 猿忆砸院缘忆 原 栽悦粤栽郧郧栽郧悦悦粤栽栽悦栽栽郧栽栽悦郧悦栽郧 原 猿忆
择贼月遭糟澡蚤贼员 云院缘忆 原 栽栽悦悦粤栽栽郧栽栽郧郧悦栽栽悦悦粤悦悦 原猿忆砸院缘忆 原 悦郧栽粤悦郧栽 粤粤栽粤郧栽悦悦悦粤悦悦 原猿忆
择贼员愿杂 云院缘忆 原 粤栽郧粤栽粤粤悦栽悦郧粤悦郧郧粤栽悦郧悦 原猿忆砸院缘忆 原 悦栽栽郧郧粤栽郧栽郧郧栽粤郧悦悦郧栽栽栽 原 猿忆
员郾 圆郾 猿 摇 总 砸晕粤 的 提 取尧 糟阅晕粤 的 合 成 以 及
砸藻葬造贼蚤皂藻鄄孕悦砸扩增摇 转基因杨树总 砸晕粤 的提取按
照 砸晕粤提取试剂盒渊购自 匝蚤葬早藻灶 公司冤 操作说明
书进行袁糟阅晕粤 的合成使用试剂盒渊匝蚤葬早藻灶 公司冤袁
原 圆园 益保存备用遥 以反转录产物为模板进行
砸藻葬造贼蚤皂藻鄄孕悦砸 扩增 月遭糟澡蚤贼员尧蕴粤砸猿 基因袁扩增引物见
表 员遥 上述引物由金思特生物科技有限公司代为合
成遥 择砸栽鄄孕悦砸采用 杂再月砸 郧则藻藻灶 酝葬泽贼藻则 酝蚤曾 砸藻葬早藻灶贼
渊栽葬运葬砸葬袁 大连冤袁反应体系为院 杂再月砸 郧则藻藻灶 酝葬泽贼藻则
酝蚤曾 员园 μ蕴袁正反义引物 渊员园 μ皂燥造窑蕴 原员 冤各 员 μ蕴袁
糟阅晕粤 圆 μ蕴渊约 猿园 灶早冤袁灭菌水 远 μ蕴遥 反应程序为院
怨源毅悦袁缘 皂蚤灶曰 怨源毅悦 变性 猿园 泽袁缘愿毅悦 退火 猿园 泽袁共 源园
个循环遥 反应程序院怨缘 益 圆 皂蚤灶曰 怨源 益变性 猿园 泽袁缘愿
益 退火 猿园 泽袁苑圆 益延伸 猿园 泽袁共 源园 个循环曰 怨缘 益融
解曲线分析 员缘 泽曰 随后执行 远园 益到 怨缘 益升温过
程袁此过程 圆园 皂蚤灶遥 将目的基因和 员愿杂 基因检测值
的比值作为目的基因转录强度的相对定量值遥 每个
样品设置 猿 个重复对照遥
员郾 圆郾 源摇 二次转基因毛白杨体外抑菌试验摇 菌丝生
长抑制法参照吴文君渊员怨愿愿冤方法进行袁所有器皿及
试剂均无菌遥 选取生长状态一致的转基因及非转基
因植株袁用 栽耘杂缓冲液提取其细胞粗提液袁吸取 缘园园
滋蕴滴入 圆园 皂蕴 已灭菌并降温至 缘园 益的 孕阅粤 培养
基中袁缓慢摇晃混匀袁倒入平放的培养皿中遥 待平板
冷却后袁将 圆愿 益暗培养 圆 耀 源 天的杨树病原真菌的
菌丝体及连带培养基用打孔器取 远 皂皂 圆块袁将有
菌丝的一面黏贴在 孕阅粤培养基正中央袁每处理重复
源 次袁 圆愿 益条件下倒置培养 圆 耀 猿 天袁并用十字交叉
法测定叶枯菌生长直径袁计算抑菌率渊李春雷等袁
圆园园怨冤袁菌丝生长抑菌率 越 渊对照菌落直径 原处理菌
猿怨
林 业 科 学 源愿 卷摇
落直径冤 辕对照菌落直径遥
员郾 圆郾 缘摇 二次转基因毛白杨活体抗真菌病检测摇 选
取大小一致的转基因植株和野生型植株袁将 圆愿 益
暗培养 圆 耀 源 天的杨树叶枯病病原真菌的菌丝体
及连带培养基用打孔器取 远 皂皂 圆块袁用保鲜膜将
生长菌丝的培养基固定在第 圆 或第 猿 片幼叶上袁将
其置于室外阴凉处袁并保持湿润状态袁猿园 天后观察
感病情况袁具体方法见 允蚤葬等渊圆园员园冤遥
员郾 圆郾 远摇 二次转基因毛白杨感病前后可溶性缩合单
宁含量的测定摇 可溶性缩合单宁含量的测定用的是
香草醛法渊杂憎葬蚤灶 藻贼 葬造援袁 员怨缘怨曰 孕则蚤糟藻 藻贼 葬造援袁 员怨苑愿冤袁 取
员 早植物材料研磨袁加入适量丙酮和水的混合液渊丙
酮颐水为苑颐 猿冤曰 圆 缘园园 则窑皂蚤灶 原员离心 员园 皂蚤灶袁取上清于
另一离心管中曰 加入 圆 皂蕴乙醚萃取有机相袁保留水
相曰 重复 圆 次曰 取 园郾 缘 皂蕴 提取液袁猿 皂蕴 猿豫香草醛
渊甲醇溶解冤员郾 缘 皂蕴浓盐酸避光反应 员缘 皂蚤灶袁测反应
液在 韵阅缘缘园 灶皂下的吸光度遥 取芦丁标准品稀释袁并与
香草醛反应测定其 韵阅 值袁制作可溶性缩合单宁标
准曲线袁算出回归方程袁计算出其含量渊各株系随机
选取 圆 株袁每株测 猿 次冤遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨的获得
以过表达 蕴粤砸猿 基因的毛白杨 渊表达载体为
孕悦载杂晕 原 蕴粤砸猿袁由潮霉素筛选获得冤为材料袁将
责缘 原 月遭糟澡蚤贼员表达载体采用农杆菌介导的叶盘法进
行二次遗传转化袁经卡那霉素筛选袁获得大量再生小
苗袁移栽温室培养 圆 个月左右遥 以转基因植株基因
组 阅晕粤 和载体质粒为模板袁分别扩增 蕴粤砸猿 垣
月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因植株的标记基因 晕孕栽陨陨渊苑源怨
遭责冤和 月遭糟澡蚤贼员渊远员圆 遭责冤以及 匀赠早渊缘怨远 遭责冤遥 扩增结
果如图 员袁获得了与预期大小一致的片断袁而非转基
因植株未扩增出特异条带遥 上述结果初步证明目的
基因 蕴粤砸猿 与 月遭糟澡蚤贼员 已整合到毛白杨基因组上遥
为了检测外源抗病基因 月遭糟澡蚤贼员 和 蕴粤砸猿 基因在
转基因植株中的表达水平袁荧光定量 孕悦砸检测发现
渊图 圆冤袁月遭糟澡蚤贼员 基因在 缘 个转基因株系中表达量均
较高曰 蕴粤砸猿 基因在转基因毛白杨中也成功转录并
表达袁与非转基因植株相比袁株系 蕴 原 月源尧蕴 原 月远 和
蕴 原 月怨 中 蕴粤砸猿 在 皂砸晕粤 水平上表达量最高袁株系
蕴 原 月猿和 蕴 原 月缘 次之遥 上述结果证明目的基因
蕴粤砸猿 与 月遭糟澡蚤贼员 在毛白杨中能够成功地表达遥
圆郾 圆摇 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨对杨树
叶枯病体外抑菌分析
为了验证 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 共表达是否提高了
图 员摇 孕悦砸检测 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 基因共
表达的转基因毛白杨
云蚤早援 员摇 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 悦澡蚤灶藻泽藻 憎澡蚤贼藻
责燥责造葬则 糟燥鄄贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 憎蚤贼澡 月遭糟澡蚤贼员 葬灶凿 蕴粤砸猿援
葬袁遭袁糟院孕悦砸检测转基因毛白杨中 月遭糟澡蚤贼员袁晕孕栽 袁匀赠早 基因
孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 怎泽藻凿 早藻灶藻鄄泽责藻糟蚤枣蚤糟 责则蚤皂藻则泽 燥枣
月遭糟澡蚤贼员袁晕孕栽 袁匀赠早曰 酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则 阅蕴圆园园园曰 晕院非转基因
植株渊阴性对照冤晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 葬泽 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 孕院
质粒渊阳性对照冤孕造葬泽皂蚤凿 阅晕粤 葬泽 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 员 耀 愿院同时
含 蕴粤砸猿袁 月遭糟澡蚤贼员 基因植株 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿
蕴粤砸猿 葬灶凿 月遭糟澡蚤贼员援
图 圆摇 砸藻葬造贼蚤皂藻鄄孕悦砸检测转基因毛白杨中
月遭糟澡蚤贼员袁蕴粤砸猿 基因的表达水平
云蚤早援 圆摇 栽则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 造藻增藻造泽 燥枣 月遭糟澡蚤贼员 葬灶凿 蕴粤砸猿
蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 遭赠 则藻葬造贼蚤皂藻鄄孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽援
宰栽院非转基因植株 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽遥 蕴 原 月 猿 耀 远袁怨院
共表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 的转基因株系 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蕴粤砸猿 葬灶凿 月遭糟澡蚤贼员援 葬袁遭表示不同转基因株
系的差异显著性袁字母相同表示差异不显著 葬袁遭 皂藻葬灶泽
贼澡藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽袁 贼澡藻 泽葬皂藻
造藻贼贼藻则 皂藻葬灶泽 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻渊琢 越 园郾 园缘袁憎蚤贼澡 猿 则藻责造蚤糟葬贼藻泽冤 援
毛白杨对叶枯病的抗性袁将叶枯病菌接种在含不同
株系细胞粗提液的 孕阅粤 培养基上袁培养 圆 天后发
现袁在含非转基因植株细胞粗提液的 孕阅粤 培养基
上袁菌落直径较大渊图 猿 粤 原 凿冤袁而在含转基因植株
细胞粗提液的 孕阅粤 培养基上菌落直径不同程度减
小袁其中含 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨细
胞粗提液的培养基上菌落直径最小渊图 猿粤 原 葬冤遥
计算各种细胞粗提液对叶枯病菌的抑制率渊图 猿月冤遥
结果初步证明院 在体外抑菌试验中袁同时过量表达
蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 基因的毛白杨可以较好的抑制叶枯
病菌的生长遥
源怨
摇 第 苑 期 黄摇 艳等院 过量表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 以提高毛白杨对叶枯病的抗性
图 猿摇 各转基因植株体外抑菌试验
云蚤早援 猿摇 陨灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 燥枣 枣怎灶早葬造 早则燥憎贼澡 遭赠 贼澡藻 糟藻造造 藻曾贼则葬糟贼泽 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 蚤灶 增蚤贼则燥
粤院细胞粗提液对叶枯病体的外抑菌效果 陨灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 燥枣 枣怎灶早葬造 早则燥憎贼澡 遭赠 贼澡藻 糟藻造造 藻曾贼则葬糟贼泽 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 月院细胞粗提液对叶枯病的抑制
率 栽澡藻 陨灶澡蚤遭蚤贼蚤燥灶 则葬贼藻 燥枣 枣怎灶早葬造 早则燥憎贼澡 遭赠 贼澡藻 糟藻造造 藻曾贼则葬糟贼泽 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽援 葬院蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达基因毛白杨 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽
燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员曰 遭院过量表达 蕴粤砸猿 基因毛白杨 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蕴粤砸猿曰 糟院过量表达 月遭糟澡蚤贼员 基因毛白杨
栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 月遭糟澡蚤贼员曰 凿院非转基因植株 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽遥 葬袁遭表示不同转基因株系的差异显著性袁字母相同表示差
异不显著 葬袁遭 皂藻葬灶泽 贼澡藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽袁 贼澡藻 泽葬皂藻 造藻贼贼藻则 皂藻葬灶泽 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻渊琢 越 园郾 园缘袁憎蚤贼澡 猿 则藻责造蚤糟葬贼藻泽冤 援
圆郾 猿摇 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨对叶枯
病活体抗性分析
进一步对 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白
杨进行活体抗病效果分析遥 选取非转基因植株尧过
量表达 蕴粤砸猿尧过量表达 月遭糟澡蚤贼员 以及上述 砸藻葬造贼蚤皂藻鄄
孕悦砸检测过的 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因植株袁
在其叶上接种叶枯病袁保湿培养袁发现非转基因植株
和转空载体植株感病情况严重袁培养 猿 天时叶片上
就出现病斑袁过量表达 蕴粤砸猿 和过量表达 月遭糟澡蚤贼员 基
因植株叶片在接种病原菌第 远 天时仅菌块粘附的部
分感病袁至 员圆 天时仅小面积感病渊图 源葬冤曰 植株培
养 猿园 天袁接种叶枯病菌的非转基因和转空载体毛白
杨整株感病袁其感病面积高达 怨园豫以上渊图 源遭冤曰 然
而 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨仅接种菌
块的叶片上少面积感病渊图 源糟冤遥 上述结果表明袁
蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨对叶枯病具有
更好的抗病效果遥
图 源摇 转基因毛白杨对叶枯病的抗性分析
云蚤早援 源摇 粤灶贼蚤鄄枣怎灶早葬造 葬泽泽葬赠 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 葬早葬蚤灶泽贼 粤援 葬造贼藻则灶葬贼藻 蚤灶 增蚤增燥
葬院转基因植株叶片抗病结果 粤灶贼蚤鄄枣怎灶早葬造 葬泽泽葬赠 燥枣 贼澡藻 造藻葬增藻泽 藻曾糟蚤泽藻凿 枣则燥皂 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 遭院 转基因毛白杨叶片感病面积 栽澡藻
糟葬造糟怎造葬贼蚤燥灶 燥枣 造藻泽蚤燥灶 葬则藻葬泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 造藻葬增藻泽曰 糟院转基因毛白杨植株抗病结果 粤灶贼蚤鄄枣怎灶早葬造 葬泽泽葬赠 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 蚤灶 增蚤增燥援 宰栽院非转基
因植株 晕燥灶鄄贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽曰 责月陨员圆员院空载体 耘皂责贼赠 增藻糟贼燥则曰 蕴圆袁蕴源院过量表达 蕴粤砸猿 毛白杨 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蕴粤砸猿曰 月猿袁
月远院转 月遭糟澡蚤贼员 基因毛白杨 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 月遭糟澡蚤贼员曰 蕴 原 月远尧蕴 原 月怨院过量表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 基因毛白杨 栽则葬灶泽早藻灶蚤糟
责造葬灶贼泽 燥增藻则藻曾责则藻泽泽藻凿 蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员曰下同 栽澡藻 泽葬皂藻 遭藻造燥憎援 葬袁遭表示不同转基因株系的差异显著性袁字母相同表示差异不显著 葬袁遭
皂藻葬灶 贼澡藻 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻 燥枣 凿蚤枣枣藻则藻灶糟藻 燥枣 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽袁 贼澡藻 泽葬皂藻 造藻贼贼藻则 皂藻葬灶 灶燥 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶糟藻渊琢 越 园郾 园缘袁憎蚤贼澡 猿 则藻责造蚤糟葬贼藻泽冤曰下同 栽澡藻 泽葬皂藻
遭藻造燥憎援
缘怨
林 业 科 学 源愿 卷摇
圆郾 源摇 转基因毛白杨在叶枯病处理前后单宁含量的
测定
在高等植物中袁无色花色素还原酶基因 蕴粤砸 是
控制单宁代谢合成的关键酶基因袁而单宁化合物可
有效抑制的真菌生长遥 在本文中 蕴粤砸猿 在抗病过程
中并不起直接作用袁而是通过单宁来实现袁为了进一
步验证上述转基因毛白杨抗病结果袁笔者检测了转
基因毛白杨在叶枯病处理前后单宁含量的变化遥
从图 缘 发现院 在叶枯菌处理前袁蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员
共表达转基因毛白杨具有较高的单宁含量袁过量表
达 蕴粤砸猿 的株系次之曰 在叶枯菌处理 员圆 天后袁单宁
含量均有不同程度的增加袁各个株系处理前后单宁
总量的差异达到显著水平遥 上述结果表明院蕴粤砸猿 垣
月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨中过量表达的 蕴粤砸猿 显
著提高了单宁含量袁其对提高杨树叶枯病抗病性起
到了重要作用遥
图 缘摇 叶枯病处理前后转基因毛白杨中
单宁化合物含量测定
云蚤早援 缘摇 悦燥灶凿藻灶泽藻凿 贼葬灶灶蚤灶 糟燥灶贼藻灶贼泽 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 悦澡蚤灶藻泽藻 憎澡蚤贼藻
责燥责造葬则 葬枣贼藻则 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 憎蚤贼澡 粤援 葬造贼藻则灶葬贼藻 渊云则援 冤 运藻蚤泽泽造藻则
猿摇 讨论
本研究将球孢白僵菌几丁质酶基因 月遭糟澡蚤贼员 通
过二次转化转入 蕴粤砸猿 过量表达毛白杨中袁 砸藻葬造
贼蚤皂藻鄄孕悦砸检测发现院 圆 基因均能在转基因毛白杨体
内有效表达渊图 圆冤遥 离体抑菌试验证实院 蕴粤砸猿 垣
月遭糟澡蚤贼员 共表达转基因毛白杨抑制叶枯菌的效果比
单独过量表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 的植株更明显渊图
猿冤遥 进一步的活体接菌试验也得到了同样的结果
渊图 源冤袁叶枯病处理的转基因毛白杨后可溶性缩合
单宁含量均不同程度上升袁蕴粤砸猿 垣 月遭糟澡蚤贼员 共表达
转基因毛白杨中的含量比仅过量表达单个基因的植
株略高渊图 缘冤遥 上述结果表明院 过量表达 蕴粤砸猿 和
月遭糟澡蚤贼员 基因能协同提高毛白杨对叶枯病的抗性遥
蕴粤砸是单宁合成途径中的关键酶基因袁将杨树
内源基因 蕴粤砸导入毛白杨中过量表达袁从而打破单
宁合成代谢途径中的限速步骤袁使得单宁的合成量
提高袁对改善杨树生长状况和提高杨树抗病性具有
重要意义渊杂贼藻增藻灶泽 藻贼 葬造援袁 圆园园源冤遥 单宁重要生物活性
之一是对真菌病害的抗性袁但其抗病机制并不是很
清楚袁推测原因在于袁大多病原真菌可以分泌水解酶
来分解植物组织内大分子物质袁而植物也可分泌出
抑制水解酶的酸性物质袁单宁就是其中之一袁真菌水
解酶受到抑制后在一定程度上延缓了病程的发展
渊刘国坤等袁 圆园园猿曰 酝蚤则葬灶凿葬 藻贼 葬造援袁 圆园园苑曰 酝藻造造憎葬赠
藻贼 葬造援袁 圆园园怨冤遥
另外袁来自于球孢白僵菌的几丁质酶 月遭糟澡蚤贼员 基
因转入杨树后均表现出了良好的抗病效果 渊 允蚤葬
藻贼 葬造援袁 圆园员园冤袁主要在于其表达的蛋白能降解真菌菌
丝体壁的主要成分之一几丁质袁从而达到抑真菌的
效果袁同时该几丁质酶基因来源于真菌袁相比植物特
有的几丁质酶来说真菌几丁质酶基因转化植物后表
达水平更高袁植物可以获得更高效的抗病性渊冯金
荣等袁 圆园园远冤遥 本研究将来源于球孢白僵菌几丁质
酶基因 月遭糟澡蚤贼员 通过二次转化转入杨树内源基因
蕴粤砸猿 过量表达株中袁发现共表达株表现出明显的抗
病效果遥
本试验仅初步研究了 蕴粤砸 基因与 月遭糟澡蚤贼员 的协
同抗病作用袁并未对其协同机制进行深一层次的研
究袁但这 圆 种抗病基因之间或者其蛋白之间是否存
在更层次的协调机制还有待进一步验证遥
参 考 文 献
冯金荣袁惠丰立袁文祯中援 圆园园远援 真菌几丁质酶及其在植物真菌病害
防治中的作用援 河南农业科学袁渊愿冤院愿猿 原 愿缘援
贾之春援 圆园员员援外源抗病基因和单宁代谢合成关键酶基因 蕴粤砸猿 在毛
白杨中协同抗病机理研究援 西南大学生命科学学院硕士学位
论文援
李春雷袁崔国新袁许志茹袁等援 圆园园怨援 植物二氢黄酮醇 源 原还原酶基因
的研究进展援 生物技术通讯袁猿怨 渊猿冤院源源圆 原 源源缘援
李武汉袁朱摇 伟袁景摇 耀援 员怨怨缘援 马尾松瘤锈病与酚类物质关系的研
究援 西北林学院学报袁 员园 渊猿冤院圆缘圆 原 圆缘愿援
刘国坤袁吴祖建袁谢联辉袁等援 圆园园猿援 植物单宁对烟草花叶病毒的抑
制活性援 福建农林大学学报院自然科学版袁猿圆 渊猿冤院圆怨圆 原 圆怨缘援
孟摇 亮袁崔德才援 圆园园源援 转几丁质酶基因黑杨的获得援 生物技术通
报袁渊猿冤院源愿 原 缘员援
石雪辉袁王淑英袁吴艳纯袁等援 员怨怨苑援 葡萄叶片中单宁尧木质素与抗黑
痘病的关系援 葡萄栽培与酿酒袁渊源冤院愿 原 员员援
吴文君援 员怨愿愿援 植物化学保护实验技术导论援 西安院陕西科学与教育
出版社袁 员源员 原 员源缘援
月燥造葬则 允 孕袁晕燥则藻造造蚤 蕴袁宰燥灶早 运 宰袁藻贼 葬造援 圆园园园援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 藻灶凿燥糟澡蚤贼蚤灶葬泽藻
枣则燥皂 栽则蚤糟澡燥凿藻则皂葬 澡葬则扎蚤葬灶怎皂 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 葬责责造藻 蚤灶糟则藻葬泽藻泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻
贼燥 葬责责造藻 泽糟葬遭 葬灶凿 则藻凿怎糟藻泽 增蚤早燥则援 孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁怨园渊员冤院苑圆 原 苑苑援
匀燥则蚤噪燥泽澡蚤 运袁陨蚤凿葬 杂援 员怨缘怨援 耘枣枣藻糟贼 燥枣 造赠贼蚤糟 藻灶扎赠皂藻 枣则燥皂 月葬糟蚤造造怎泽 糟蚤则糟怎造葬灶泽
远怨
摇 第 苑 期 黄摇 艳等院 过量表达 蕴粤砸猿 和 月遭糟澡蚤贼员 以提高毛白杨对叶枯病的抗性
葬灶凿 糟澡蚤贼蚤灶葬泽藻 枣则燥皂 杂贼则藻责贼燥皂赠糟藻泽 泽责援 燥灶 粤泽责藻则早蚤造造怎泽 燥则赠扎葬藻援 晕葬贼怎则藻袁
员愿猿渊源远缘缘冤院 员愿远 原 员愿苑援
允蚤葬 在 悦袁杂怎灶 再 酝袁再怎葬灶 蕴袁藻贼 葬造援 圆园员园援 栽澡藻 糟澡蚤贼蚤灶葬泽藻 早藻灶藻 渊月遭糟澡蚤贼员冤
枣则燥皂 月藻葬怎增藻则蚤葬 遭葬泽泽蚤葬灶葬 藻灶澡葬灶糟藻泽 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥 悦赠贼燥泽责燥则葬
糟澡则赠泽燥泽责藻则皂葬 蚤灶 孕燥责怎造怎泽 贼燥皂藻灶贼燥泽葬 悦葬则则援 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠 蕴藻贼贼藻则泽袁
猿圆渊怨冤院 员猿圆缘 原 员猿猿圆援
蕴燥则蚤贼燥 酝袁杂澡藻则蚤凿葬灶 蕴援 宰燥燥袁陨则藻灶藻 郧葬则糟蚤葬 云藻则灶葬灶凿藻扎袁藻贼 葬造援 员怨怨愿援 郧藻灶藻泽
枣则燥皂 皂赠糟燥责葬则葬泽蚤贼蚤糟 枣怎灶早蚤 葬泽 葬 泽燥怎则糟藻 枣燥则 蚤皂责则燥增蚤灶早 责造葬灶贼 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 贼燥
枣怎灶早葬造 责葬贼澡燥早藻灶泽援 孕则燥糟 晕葬贼造 粤糟葬凿 杂糟蚤 哉杂粤袁怨缘渊员源冤院 苑愿远园 原 苑愿远缘援
酝葬则藻澡葬灶贼 砸袁 阅葬增藻赠 酝 砸袁 蕴怎糟葬泽 允 粤袁 藻贼 葬造援 员怨怨愿援 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 葬
糟澡蚤贼蚤灶葬泽藻 贼则葬灶泽早藻灶藻 蚤灶 则燥泽藻 渊砸燥泽葬 澡赠遭则蚤凿 蕴援 冤 则藻凿怎糟藻泽 凿藻增藻造燥责皂藻灶贼 燥枣
遭造葬糟噪泽责燥贼 凿蚤泽藻葬泽藻 渊阅蚤责造燥藻葬则责燥灶 则燥泽葬藻 宰燥造枣冤 援 酝燥造藻糟怎造葬则 月则藻藻凿蚤灶早袁
源渊员冤院 员愿苑 原 员怨源援
酝藻造造憎葬赠 砸 阅袁 栽则葬灶 蕴 栽袁 孕则燥怎泽藻 酝 月袁 藻贼 葬造援 圆园园怨援 栽澡藻 憎燥怎灶凿 原 袁
责葬贼澡燥早藻灶 原 袁 葬灶凿 怎造贼则葬增蚤燥造藻贼 月鄄则藻泽责燥灶泽蚤增藻 酝再月员猿源 早藻灶藻 藻灶糟燥凿藻泽 葬灶
砸圆砸猿 酝再月 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 贼澡葬贼 则藻早怎造葬贼藻泽 责则燥葬灶贼澡燥糟赠葬灶蚤凿蚤灶
泽赠灶贼澡藻泽蚤泽 蚤灶 责燥责造葬则援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤燥造燥早赠袁 员缘园渊圆冤院 怨圆源 原 怨源员援
酝蚤则葬灶凿葬 酝袁 砸葬造责澡 杂 郧袁 酝藻造造憎葬赠 砸袁 藻贼 葬造援 圆园园苑援 栽澡藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶葬造
则藻泽责燥灶泽藻 燥枣 澡赠遭则蚤凿 责燥责造葬则 渊 孕燥责怎造怎泽 贼则蚤糟澡燥糟葬则责葬 伊 孕援 凿藻造贼燥蚤凿藻泽冤 贼燥
蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 遭赠 酝藻造葬皂责泽燥则葬 皂藻凿怎泽葬藻 造藻葬枣 则怎泽贼 蚤灶增燥造增藻泽 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣
枣造葬增燥灶燥蚤凿 责葬贼澡憎葬赠 早藻灶藻泽 造藻葬凿蚤灶早 贼燥 贼澡藻 葬糟糟怎皂怎造葬贼蚤燥灶 燥枣
责则燥葬灶贼澡燥糟赠葬灶蚤凿蚤灶泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆园 渊苑冤院
愿员远 原 愿猿员援
孕则蚤糟藻 孕 允袁 杂怎噪 宰 粤袁云则藻藻皂葬灶 粤 耘袁 藻贼 葬造援 员怨苑愿援 陨灶 增蚤贼则燥 葬灶凿 蚤灶 增蚤增燥
蚤灶凿蚤糟葬贼蚤燥灶泽 燥枣 贼澡藻 糟葬则糟蚤灶燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 葬灶凿 贼燥曾蚤糟蚤贼赠 燥枣 枣燥燥凿 凿赠藻泽援
陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 允燥怎则灶葬造 燥枣 悦葬灶糟藻则袁 圆员渊猿冤院 猿远员 原 猿远苑援
杂憎葬蚤灶 栽袁 匀蚤造造泽 宰 耘援 员怨缘怨援 栽澡藻 责澡藻灶燥造蚤糟 糟燥灶泽贼蚤贼怎藻灶贼泽 燥枣 孕则怎灶怎泽
凿燥皂藻泽贼蚤糟葬援 允燥怎则灶葬造 燥枣 贼澡藻 杂糟蚤藻灶糟藻 燥枣 云燥燥凿 葬灶凿 粤早则蚤糟怎造贼怎则藻袁 员园渊圆冤院
远猿 原 远愿援
杂贼藻增藻灶泽 酝 栽袁 蕴蚤灶凿则燥贼澡 砸 蕴援 圆园园源援 陨灶凿怎糟藻凿 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 贼澡藻
蚤灶凿藻贼藻则皂蚤灶葬贼藻 早则燥憎贼澡 燥枣 葬泽责藻灶 渊 孕燥责怎造怎泽 贼则藻皂怎造燥蚤凿藻泽冤援 韵藻糟燥造燥早蚤葬袁
员源缘渊圆冤院 圆怨愿 原 猿园远援
再怎葬灶 蕴袁宰葬灶早 蕴 允袁匀葬灶 在 允袁藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟造燥灶蚤灶早 葬灶凿 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
燥枣 孕贼则蕴粤砸猿袁 葬 早藻灶藻 藻灶糟燥凿蚤灶早 造藻怎糟燥葬灶贼澡燥糟赠葬灶蚤凿蚤灶 则藻凿怎糟贼葬泽藻 枣则燥皂
孕燥责怎造怎泽 贼则蚤糟澡燥糟葬则责葬袁 葬灶凿 蚤贼泽 糟燥灶泽贼蚤贼怎贼蚤增藻 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 藻灶澡葬灶糟藻泽 枣怎灶早葬造
则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 贼则葬灶泽早藻灶蚤糟 责造葬灶贼泽援 允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠渊枣蚤则泽贼
责怎遭造蚤泽澡藻凿 燥灶造蚤灶藻冤 渊圆园员圆 原 园员 原 圆园冤援 澡贼贼责院椅 躁曾遭援 燥曾枣燥则凿躁燥怎则灶葬造泽援
燥则早 辕 糟燥灶贼藻灶贼 辕 藻葬则造赠 辕 圆园员圆 辕 园员 辕 圆园 辕 躁曾遭援 藻则则源圆缘援
渊责任编辑摇 朱乾坤冤
苑怨