全 文 ：第 ww卷 第 |期
u s s {年 | 月
林 业 科 学
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平邑甜茶谷氨酸受体同源基因( ΜηΓΛΡ316)
的克隆 !表达及转化 3
主春福t ou 彭福田t 彭 静t ou 姜远茂t 李光杰t
kt1 山东农业大学园艺科学与工程学院 国家作物生物学重点实验室 泰安 uztst{ ~
u1 山东省沂水县果茶服务中心 沂水 uzywssl
摘 要 } 根据 Š¨ ±…¤±®中检索到的苹果谷氨酸受体基因k ΓΛΡ¶l的 ∞≥×序列 o采用 • „≤∞方法克隆平邑甜茶谷氨酸
受体同源基因 ΜηΓΛΡ ∀该基因全长 v yss ¥³o编码 |wy个氨基酸 o推测分子质量为 tsz1{s| ®∏∀将 ΜηΓΛΡ编码氨基
酸与其他已知的谷氨酸受体氨基酸进行同源性比较 o发现 «Š• 属于谷氨酸受体第三亚家族 kŠ•vl o且与拟南芥
„·Š•v1y的同源关系最近 o故将其命名为 ΜηΓΛΡ316kŠ¨ ±…¤±®注册号 }∞ƒwvuxzul ∀亲水性分析表明 o«Š•v1y包
含有动物离子型谷氨酸受体k¬Š∏•¶l的 y个具有重要功能的保守结构域 ∀荧光定量 °≤• 结果显示 oΜηΓΛΡ316 在
根 !茎 !叶中均有所表达 o且在叶中的表达量最高 ~p谷氨酸和 Œ…„处理能够诱导根中 ΜηΓΛΡ316 的表达 ∀成功构
建了 vx≥ }}ΜηΓΛΡ316 反义表达载体 o并对−皇家嘎拉. 苹果进行农杆菌介导的遗传转化 ∀
关键词 } 平邑甜茶 ~ ΜηΓΛΡ316 ; 基因克隆 ~表达分析 ~转化
中图分类号 }≥zt{1wy ~±|wv1u 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kuss{ls| p ssw{ p sy
收稿日期 }ussz p tt p su ∀
基金项目 }国家自然科学基金资助项目kvsxztu{yl o山东省自然科学基金资助项目k≠ussz⁄s{l ∀
3 彭福田为通讯作者 ∀
Χλονινγ oΕξπρεσσιον ανδ Τρανσφορµατιον οφ ΜηΓΛΡ316 Γενειν
Μαλυσ ηυπεηενσισϖαρ q πινγψιενσισ
«∏≤«∏±©∏tou °¨ ±ªƒ∏·¬¤±t °¨ ±ª¬±ªtou ¬¤±ª≠∏¤±°¤²t ¬Š∏¤±ª­¬¨t
kt1 Στατε Κεψ Λαβορατορψοφ Χροπ Βιολογψ Χολλεγε οφ Ηορτιχυλτυρε Σχιενχε ανδ Ενγινεερινγ o Σηανδονγ Αγριχυλτυραλ Υνιϖερσιτψ Ται. αν uztst{ ~
u1 Ψισηυι Φρυιτ ανδ Τεα Σερϖιχε Χεντεροφ Σηανδονγ Προϖινχε Ψισηυι uzywssl
Αβστραχτ} ΜηΓΛΡ ª¨ ±¨ º¤¶¬§¨±·¬©¬¨§©µ²° Μαλυσ ηυπεηενσισ √¤µq πινγψιενσισ ¥¼ • „≤∞ ²± ·«¨ ¥¤¶¬¶²© ¤³³¯¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§
¶¨ ∏´¨±¦¨ ·¤ªk∞≥×l §¤·¤¥¤¶¨ q ΜηΓΛΡ ¦⁄‘„ º¤¶v yss ¥³¬± ¯¨ ±ª·«¤±§ ±¨¦²§¨§¤³µ²·¨¬± °²¯ ¦¨∏¯¨ º¬·«|wy ¤°¬±² ¤¦¬§¶o
º«²¶¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µ°¤¶¶º¤¶ ¶¨·¬°¤·¨§²©tsz1{s| ®∏q≥¨ ∏´¨±¦¨ ¤¯¬ª±°¨ ±·²© «Š• º¬·«²·«¨µ°¨ °¥¨µ¶²©·«¨ Š• kª¯∏·¤°¤·¨
µ¨¦¨³·²µl ©¤°¬¯¼¶«²º¨ §·«¤·«Š• º¤¶¦¯²¶¨ ¼¯ µ¨ ¤¯·¨§·²¦¯¤§¨ ¶ Αραβιδοπσισ Š•¶¤±§º¤¶¦¯²¶¨¶··² „·Š•v1y q׫¨µ¨©²µ¨ o
º¨ ±¤°¨ §¬·ΜηΓΛΡ316 kŠ¨ ±…¤±® ¤¦¦¨¶¶¬²± ‘²q}∞ƒwvuxzul q ‹¼§µ²³¤·«¼ ¤±¤¯¼¶¬¶¬±§¬¦¤·¨§·«¤·«Š•v1y ¦²±·¤¬±¨ §¶¬¬
¶¬ª±¤·∏µ¨ §²°¤¬±¶²©¤±¬°¤¯ ¬²±²·µ²³¬¦Š¯∏•¶q±∏¤±·¬·¤·¬√¨ µ¨¤¯2·¬°¨ °≤• ¤±¤¯¼¶¬¶§¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤·ΜηΓΛΡ316 º¤¶ ¬¨³µ¨¶¶¨§
¬±µ²²·¶o¶·¨°¶¤±§¯¨ ¤√¨ ¶q ׫¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ¯¨ √¨ ¯ ¬± ¯¨ ¤√¨ ¶ º¤¶«¬ª«¨µ·«¤± ·«¤·¬± µ²²·¶¤±§¶·¨°¶q 2ª¯∏·¤°¤·¨ ¤±§Œ…„
·µ¨¤·°¨ ±·¶º¨ µ¨ ¤¥¯¨·²¬±§∏¦¨ ·«¨ ¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© ΜηΓΛΡ316 ¬±µ²²·¶qײ¶·∏§¼·«¨ ©∏±¦·¬²± ²© ΜηΓΛΡ316 , º¨ ¬±·µ²§∏¦¨§·«¨
¤±·¬¶¨±¶¨ ΜηΓΛΡ316 ∏±§¨µ·«¨ ¦²±·µ²¯ ²©vx≥ ³µ²°²·¨µ²©≤¤∏¯¬©¯²º¨ µ°²¶¤¬¦√¬µ∏¶¬±·² Μαλυσ δοµεστιχα¦√ q•²¼¤¯ Š¤¯¤³¯¤±·¶q
Κεψ ωορδσ} Μαλυσ ηυπεηενσισ √¤µq πινγψιενσισ~ ΜηΓΛΡ316 ª¨ ±¨ ~ª¨ ±¨ ¦¯²±¬±ª~ ¬¨³µ¨¶¶¬²±~·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±
谷氨酸可以作为养分被植物直接吸收利用k张青等 oussx ~彭勇等 ousszl o而且近年来研究表明谷氨酸可
作为信号分子调控植物的生长发育 o推测谷氨酸受体蛋白可能参与其信号转导过程k • ¤¯¦«2¬∏ ετ αλqoussyl ∀
在动物中 o离子型谷氨酸受体k¬Š∏•¶l是神经系统中胞间通讯的关键组分 o能作为非选择性配体门控的阳离
子通道而起作用 ∀根据它们的配体选择性及离子电导特性 o¬Š¯∏•¶可以分为 v个功能亚组 o分别为 „°„受
体 !Ž„受体和 ‘⁄„受体 ∀已确定的动物¬Š¯∏•¶包含 y个具有重要功能的保守结构域 o其中包括 u个与大
肠杆菌的谷氨酰胺结合蛋白kŠ¯ ±‹l有相似性的配体结合结构域 ≥t !≥u ov个跨膜结构域 t !v !w及一个凹
膜结构域 uk⁄¬±ª¯ §¨¬±¨ ετ αλqot||| ~ ¤§§¨±oussul ∀拟南芥kΑραβιδοπσιστηαλιαναl上已成功克隆 us个谷氨酸
受体基因k ΑτΓΛΡ¶l o并根据序列的同源性分为 v个亚家族k≤«¬∏ ετ αλqoussu ~¤¦²°¥¨ ετ αλqousstl ~¬等
kussyl在水稻k Ορψζα σατιϖαl中成功克隆了 ΟσΓΛΡ311 基因 o同时 Ž¤±ª等kussyl在小萝卜k Ραπηανυσσατιϖυσl上
也克隆了 ΡσΓΛΡ 基因 o但是这些基因的许多功能还是未知的 ∀ Ž¬°等kusstl利用转基因方法研究表明
ΑτΓΛΡ312可能参与稳定钙素的动态平衡 o超表达 ΑτΓΛΡ312 的拟南芥植株表现缺钙症状 o并对 Žn和 ‘¤n胁
迫超敏感 o但供应钙素则可缓解以上症状 ∀ Ž¤±ª等kussv ~usswl研究表明 ΑτΓΛΡ111可以调节 ≤ !‘代谢和脱
落酸的生物合成及信号转导 ∀
平邑甜茶k Μαλυσ ηυπεηενσισ √¤µq πινγψιενσισl是我国特有的植物种 o广泛用作苹果砧木 ~它具有高度无融
合生殖能力 o实生苗个体一致性非常好 o易于检测处理间的差异k杨洪强等 ot||zl ∀本文以平邑甜茶的新根
为试材成功克隆了 ΜηΓΛΡ316全长基因 o初步研究了其表达特性 o并利用农杆菌介导的方法进行了−皇家嘎
拉.苹果k Μαλυσ δοµεστιχα¦√ q•²¼¤¯ Š¤¯¤l的遗传转化 o为进一步克隆平邑甜茶中 ΓΛΡ¶家族的其他成员以及研
究 ΓΛΡ¶基因在平邑甜茶生长发育中的作用奠定了基础 ∀
t 材料与方法
111 材料
以平邑甜茶新根为材料 ∀ ⁄‘„回收纯化试剂盒 !³⁄t{2×载体 !פ´ 酶 !×w2⁄‘„连接酶和限制性内切酶
购自大连宝生物公司 ∀大肠杆菌k Εσχηεριχηια χολιl菌株 ⁄‹xΑ和农杆菌k Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl…„wwsw菌
株由本实验室保存 ∀ ≥„• ×א • „≤∞ ¦⁄‘„ „°³¯¬¦¤·¬±ª Ž¬·为 ≤¯ ²±·¨¦«公司产品 ∀ ⁄‘„ 测序与引物合成由
Œ±√¬·µ²ª¨±公司完成 ∀
112 引物设计和合成
根据已知的拟南芥 !水稻和小萝卜中 Š•¶的氨基酸序列 o利用 ‘≤…Œ的·…„≥׳程序k«·³}ΠΠººº q±¦¥¬q
±¯ ° q±¬«qª²√Π…„≥×Πl查询苹果上 Š• 的 ∞≥× 序列 o设计特异引物用于 xχ• „≤∞和 vχ • „≤∞∀xχ • „≤∞引物
Š≥°t }xχ2≤„≤ׄ„Š≤Š„≤≤„„ŠŠŠ×Š≤׊„≤׊×2vχ ~vχ• „≤∞引物 Š≥°u }xχ2≤„׊„׊׊ŠŠŠ×Š×Š„≤Š2vχ ∀根据
测序拼接结果 o设计特异引物 °x2t !°x2u和 °v2t !°v2u o采用巢式 °≤• 进行 ΜηΓΛΡ316 全长基因克隆 ∀ °x2t }
xχ2„„Š×≤ŠŠ×„Š„׊≤׊ŠŠ×ׄŠ2vχ ~ °x2u } xχ2„≤×××≤׊ŠŠ„ŠŠ×׊Š×××2vχ o °v2t } xχ2„≤×≤„××≤Š×„×≤„
Š„„≤„Š×2vχ ~°v2u }xχ2≤≤„≤×׊Š„Š×׊Š„׊Š×2vχ ∀
113 新根总 ΡΝΑ的提取和 χ∆ΝΑ第一条链的合成
平邑甜茶新根中总 • ‘„ 的提取采用 ≤ׄ…法k≤«¤±ª ετ αλqot||vl进行 o按照 ≥„• ×א • „≤∞ ¦⁄‘„
„°³¯¬¦¤·¬±ªŽ¬·的说明书进行 ¦⁄‘„第一条链的合成 ∀
114 ΡΑΧΕ扩增
°≤• 的反应体系kxs ˏl如表 t所示 o¤¶·¨µ¬¬的成分是 vw1x ˏ°≤•2Šµ¤§¨ • ¤·¨µ~x ˏts ≅ „§√¤±·¤ª¨
u °≤• …∏©©¨µ~t ˏ§‘×° ¬¬ kts °°²¯#ptl ~t ˏxs ≅ „§√¤±·¤ª¨ u °²¯¼°¨ µ¤¶¨ ¬¬∀反应程序为·²∏¦«§²º±
°≤• ox个循环 }|w ε vs ¶ozu ε v °¬±~x个循环 }|w ε vs ¶ozs ε vs ¶ozu ε v °¬±~ux个循环 }|w ε vs ¶o
y{ ε vs ¶ozu ε v °¬±∀测序结果用 ≤²±·¬ª∞¬³µ¨¶¶进行拼接 ∀
表 1 Ρ ΑΧΕ ΠΧΡ 反应体系
Ταβ .1 Ρ ΑΧΕ ΠΧΡ ρεαχτιον σψστεµ
组分 ≤²°³²±¨ ±· xχ2• „≤∞体系xχ2• „≤∞¶¼¶·¨°Πˏ
vχ2• „≤∞体系
vχ2• „≤∞¶¼¶·¨°Πˏ
• „≤∞2• ¤¨§¼ ¦⁄‘„ u1x u1x
˜° kts ≅ l x x
Š≥°t kts Λ°²¯#ptl t )
Š≥°u kts Λ°²¯#ptl ) t
¤¶·¨µ¬¬ wt1x wt1x
总体积 ƒ¬±¤¯ √²¯∏°¨ xs xs
115 ΜηΓΛΡ316全长基因的克隆
°≤• 反应体系 }u1x °°²¯ #pt §‘×° { ˏoux
°°²¯#pt ª≤¯ u x ˏots ≅ „ °≤• 缓冲液 x ˏo
上下游引物各 u ˏk约 ts ³°²¯#ptl ∀逆转录产
物 t ˏo„ פ´ 酶 s1x ˏkx ˜#ˏptl o用重蒸水
补充至总体积 xs ˏ∀°≤• 反应条件为 |w ε 预变
性 x °¬±后 o按以下程序进行 °≤• 扩增 }|w ε 变性
ys ¶oxs ε 退火 ys ¶ozu ε 延伸 |s ¶o共进行 vs个
循环 ~最后 zu ε 延伸 ts °¬±∀采用巢式 °≤• 方
式 o首先用引物 °x2t与 °v2t进行反应 o将 °≤• 产
物稀释 ws倍后 o取 t ˏ作为模板用引物 °x2u和 °v2u进行第 u次 °≤• 扩增 ∀ °≤• 产物经 t h的琼脂糖凝胶
电泳 o切胶回收后与 ³⁄t{2×载体连接 o转化大肠杆菌 ⁄‹xΑo筛选出阳性克隆进行测序 ∀
116 荧光定量 ΠΧΡ
取平邑甜茶种子 o消毒层积后 o播于洗净消毒的河砂中 ∀当幼苗第 y片真叶刚出现时 o将一部分幼苗分
|w 第 |期 主春福等 }平邑甜茶谷氨酸受体同源基因( ΜηΓΛΡ316)的克隆 !表达及转化
根 !茎 !叶收获 o迅速用液氮冷冻后置于 p {s ε 保存备用 ∀其余的幼苗分别浇 tss Λ°²¯ #pt p谷氨酸和
xs °ª#®ªpt Œ…„溶液 o处理 vs °¬±后取根 o迅速用液氮冷冻 o置于 p {s ε 保存备用 ∀
采用 פ´ ¤±探针法进行荧光定量 °≤• 反应 o使用 °µ¬°¨ µ∞¬³µ¨¶¶软件设计引物和探针 ∀引物 Šƒ }
×≤„„„×≤≤×׊ŠŠ≤×× ~ Š• }„„×≤„×≤„×ׄ׊≤≤׊׊Š ∀探针 }©°¤ n ≤≤Š≤≤××≤×××≤×≤Š×׊Š„„≤ n ·¤°µ¤∀
以µt{¶• ‘„作为管家基因 ∀
117 ΜηΓΛΡ316反义表达载体的构建
以含有 ΜηΓΛΡ316编码区序列的 ³⁄t{2×载体为模板 o用引物 tv2w{和 °x2u进行 °≤• 扩增 o筛选出含
有 ΜηΓΛΡ316编码区反向插入 ³⁄t{2×载体的菌落 o采用碱裂解法提取质粒 o用 Ξβα´和 Σαλ´进行双酶切 o
反应条件是 vz ε v «o经 t h的琼脂糖凝胶电泳 o回收 ΜηΓΛΡ316目的基因 ∀同时 o用 Ξβα´和 Σαλ´双酶切
植物表达载体 ³…Œtut o电泳回收载体片断 ∀回收的 ΜηΓΛΡ316 目的基因与 ³…Œtut在 ×w2⁄‘„连接酶的作用
下连接过夜 o转化大肠杆菌 ⁄‹xΑo通过 °≤• 和双酶切进行鉴定 ∀
118 −皇家嘎拉. 苹果的遗传转化
参照刘庆忠等kusstl的方法进行遗传转化 ∀将构建的植物表达载体 ³…Œtut2«Š•v1y 转入农杆菌
…„wwsw ∀切割好的外植体于农杆菌中浸蘸 o用无菌滤纸吸去多余液体转移到预筛选培养基k≥附加 y2…„
w1s °ª#pt !Œ…„ s1w °ª#pt !羧苄青霉素 uxs °ª#ptl中 o黑暗条件下培养 v ∗ w §∀然后移入筛选培养基k≥
附加 y2…„ w1s °ª#pt !Œ…„ s1w °ª#pt !羧苄青霉素 uxs °ª#pt !卡那霉素 us °ª#ptl中 o在黑暗条件下培养
v ∗ w §后转光照条件下kux ε oty «光照和 { «黑暗l培养 y周 ∀期间每隔 u周更换 t次新鲜选择培养基 ∀
选取抗卡那霉素的新梢 o在附加 us °ª#pt卡那霉素的增殖培养基上扩繁 ∀在 tΠu≥附加 Œ…„ s1t °ª#pt的
生根培养基上诱导生根 ∀
u 结果与分析
211 ΜηΓΛΡ316 5χΡΑΧΕ 和 3χΡΑΧΕ的克隆
以平邑甜茶新根 ¦⁄‘„为模板 o采用 xχ• „≤∞和 vχ• „≤∞扩增分别得到 u yss ¥³的 xχ• „≤∞产物k图 tl和
t uss ¥³的 vχ• „≤∞产物k图 ul o分别将其与 ³⁄t{2×载体连接 o转化大肠杆菌 ⁄‹xΑo获得重组质粒用于测
序 ∀测序结果拼接后得到一个 v yss ¥³大小 !编码 |wy个氨基酸的序列 o推测分子量为 tsz1{s| ®∏∀将该序
列的核苷酸与氨基酸序列分别在 ‘≤…Œ服务器的 …¯¤¶·k¥¯¤¶·±和 ¥¯¤¶·³l软件进行检索 o初步推断所克隆的基因
为谷氨酸受体基因 ∀
212 ΜηΓΛΡ316全长基因的克隆
根据 xχ• „≤∞和 vχ• „≤∞的拼接结果设计特异引物 °v2t !°x2t !°v2u和 °x2u ∀以 °v2t和 °x2t的 °≤• 产物
为模板 o用 °v2u和 °x2u做巢式 °≤• 扩增获得一个 u |ss ¥³的目的片断k图 vl o与 ³⁄t{2×载体连接 o转化大
肠杆菌 ⁄‹xΑ∀测序结果与 xχ• „≤∞和 vχ• „≤∞拼接序列的编码区完全相同 o说明获得了 ΜηΓΛΡ316 的完整
编码区 ∀
图 t ΜηΓΛΡ3 . 6 的 xχ• „≤∞产物
ƒ¬ªqt xχ• „≤∞ ³µ²§∏¦·¶²© ΜηΓΛΡ3 . 6
 q⁄u sss °¤µ®¨µ~t1xχ• „≤∞产物 xχ• „≤∞
³µ²§∏¦·¶q
图 u ΜηΓΛΡ3 . 6 的 vχ• „≤∞产物
ƒ¬ªqu vχ• „≤∞ ³µ²§∏¦·¶²© ΜηΓΛΡ3 . 6
 q⁄u sss °¤µ®¨µ~t qvχ• „≤∞产物
vχ• „≤∞ ³µ²§∏¦·¶q
图 v ΜηΓΛΡ3 . 6 编码区片断
ƒ¬ªqv ∞±¦²§¬±ª¦⁄‘„ ©µ¤ª° ±¨·¶
²© ΜηΓΛΡ3 . 6
 q⁄u sss °¤µ®¨µ~t q°≤•
产物 °≤• ³µ²§∏¦·¶q
sx 林 业 科 学 ww卷
213 ΜηΓΛΡ316基因的序列分析
利用 ≤˜≥ׄ÷ √¨ µqt1{软件k«·³}ΠΠººº2¬ª¥°¦q∏2¶·µ¤¶¥ªq©µΠ…¬²Œ±©²Πl将拟南芥 „·Š•¶!水稻 ’¶Š•v1t与
«Š•v1y的氨基酸序列进行系统进化树分析 o发现 «Š•v1y属于拟南芥 Š•¶家族中的第 v亚家族且与
„·Š•v1y的同源关系最近k图 wl ∀
图 w ΜηΓΛΡ316 与拟南芥 ΑτΓΛΡ¶!
水稻 ΟσΓΛΡ311 的进化树分析
ƒ¬ªqw °«¼¯²ª¨ ±¨ ·¬¦·µ¨¨²© ΜηΓΛΡ316 ¤±§
Αραβιδοπσιστηαλιανα ΑτΓΛΡ¶o Ορψζα σατιϖα ΟσΓΛΡ311
Š¨ ±…¤±®登录号 „¦¦¨¶¶¬²± ‘²q}拟南芥 Αραβιδοπσιστηαλιανα „·Š•t1t }‘°pt{zsyt ~„·Š•t1u }
‘°p t||yxt ~ „·Š•t1v } ‘°p t||yxu ~ „·Š•t1w } ‘°p t{zws{ ~ „·Š•u1t } ‘°p t|{syu ~
„·Š•u1u } ‘°p t{ssw{ ~ „·Š•u1v } ‘°p t{sswz ~ „·Š•u1w } ‘°p t|w{|| ~ „·Š•u1x }
±|ƒ‘x ~ „·Š•u1y } ‘°p t|yyz| ~ „׊•u1z } ‘°p t{swzy ~ „·Š•u1{ } ‘°p t{swzx ~
„·Š•u1| } ‘°p t{swzw ~ „·Š•v1t } „≠w|xww{ ~ „·Š•v1u } ‘ p usu|xz ~ „·Š•v1v }
„≠wyvy|u ~ „·Š•v1w } ‘ p tssv|{ ~ „·Š•v1x } „≠w|xww| ~ „·Š•v1y } ‘ p ttxssz ~
„·Š•v1z }‘ ptu{z|| ~水稻 Ορψζα σατιϖα ’¶Š•v1t }⁄±vsxws{ q
利用 °µ²·≤²°³ ∂ µ¨¶¬²± y1t 软件
k«·³}ΠΠººº q¶²©·¥¨µµ¼q¦²°Π¥¨µµ¼q³«·°¯ l
对 «Š•v1y 进行亚细胞定位预测 o
发现 «Š•v1y定位于质膜上 ∀利用
א ‹  √¨ µ¶¬²± u1sk˜•«·³}ΠΠººº q
¦¥¶q§·∏q§®Π¶¨µ√¬¦¨¶Πא ‹ 2u1sΠl 对
«Š•v1y进行亲水性分析 o结果显示
«Š•v1y包含 v个跨膜结构域kt !
v !wl o一个 ‘末端信号肽 ≥³o一个
凹膜结构域 Μu ∀ ≥³与 t !v与 w
之间分别为配体结合结构域 Š¯ ±‹t和
Š¯ ±‹uk图 xl ∀
214 荧光定量 ΠΧΡ
采用荧光定量 °≤• 方法分析
ΜηΓΛΡ316 的 表 达 特 性 ∀ 纵 坐 标
°• ‘„相对含量表示目的基因相对拷
贝数Π管家基因相对拷贝数 ∀结果显
示 oΜηΓΛΡ316在平邑甜茶根 !茎 !叶中
均有表达 ~叶中的表达量最高 o根中
的表达量最低 o仅为叶中表达量的
ts1x h k图 yl ∀由图 z可以看出 p谷
氨酸 和 Œ…„ 处 理 能 诱 导 根 中
ΜηΓΛΡ316的表达 o°• ‘„ 相对含量分
别比对照高 y{y1w h和 t|y1w h ∀
图 x «Š•v1y的亲水性分析
ƒ¬ªqx ‹¼§µ²³¤·«¼ ³¯²·¤±¤¯¼¶¬¶²© «Š•v1y
215 抗性再生植株的获得
为了确定 ΜηΓΛΡ316 基因的功
能 ,构建了 ΜηΓΛΡ316 的反义表达载
体 ∀将 ΜηΓΛΡ316 反向插入植物表达
载体 ³…Œtut的 vx ≥启动子的下游 o采
用农杆菌介导法进行−皇家嘎拉. 苹果
的遗传转化 o在筛选培养基上获得抗
性再生植株k图 {l ∀
v 结论与讨论
自从 ¤°等kt||{l首次从拟南芥
中克隆到了植物 ΓΛΡ 基因后 o关于
ΓΛΡ基因与植物生长发育之间关系的
研究变得日益增多 o但它们在植物生理活动中的许多作用仍然不清楚 ∀目前已从拟南芥基因组中分离出了
us个 ΓΛΡ¶基因 o可以分为 v个蛋白家族 o并且都包含动物¬Š¯∏•¶的所有信号结构域k⁄¤√¨ ±³²µ·oussul ∀¤°
等kt||{l研究表明 o植物 Š•¶参与光信号转导过程 ∀ Ž¬°等kusstl研究表明 o超表达 ΑτΓΛΡ312 的转基因拟
南芥幼苗表现很多形态上的改变 o如植株顶部出现坏疽 o植株变矮 o出现大量二次花序及生长缓慢等 ∀ Ž¤±ª
tx 第 |期 主春福等 }平邑甜茶谷氨酸受体同源基因( ΜηΓΛΡ316)的克隆 !表达及转化
等kussyl采用微阵列分析表明拟南芥植株超表达 ΡσΓΛΡ 可促进防御基因和茉莉酸k„l生物合成基因的表
达 o并可明显抑制灰霉病菌的生长 ~ •¶Š• 作为质膜中谷氨酸门控的 ≤¤un通道而起作用 ∀¬等kussyl研究
认为 oΟσΓΛΡ311基因在维持水稻根尖分生组织细胞正常分化 !促进细胞存活中发挥重要作用 ∀
图 y 荧光定量 °≤• 分析 ΜηΓΛΡ3 . 6
在不同组织中的表达
ƒ¬ªqy • ¤¨¯2·¬°¨¤±¤¯¼¶¬¶²© ΜηΓΛΡ3 . 6
¬¨³µ¨¶¶¬²±¬± §¬©©¨µ¨±··¬¶¶∏¨¶
图 z p谷氨酸和 Œ…„对根中
ΜηΓΛΡ3 . 6 表达的影响
ƒ¬ªqz ∞©©¨¦·¶²©2Š¯ ∏¤±§Œ…„ ²±·«¨
¬¨³µ¨¶¶¬²± ²© ΜηΓΛΡ3 . 6 ¬±µ²²·¶
图 { 抗性−皇家嘎拉.苹果植株的获得
ƒ¬ªq{ • ¶¨¬¶·¤±·³¯¤±·¶²©− • ²¼¤¯ Š¤¯¤.
„ o…}在筛选培养基上生长的抗性植株 • ¶¨¬¶·¤±·³¯¤±·¶¬± ¶¨¯¨ ¦·¬√¨ ° §¨¬∏° ~
≤ }在增殖培养基上生长的−皇家嘎拉.植株 − •²¼¤¯ Š¤¯¤. ³¯¤±·¶¬± µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²± °¨ §¬∏° q
本研究中以平邑甜茶新根为
材料成功克隆了 ΓΛΡ¶的同源基因
ΜηΓΛΡ316 ∀系统进化树分析显示 o
«Š•v1y 属于 Š•¶家族的第三
亚家族且与 „·Š•v1y的同源关系
最近k图 wl ∀利用 א ‹  √¨ µ¶¬²±
u1s程序对 «Š•v1y进行亲水性
分析表明 o«Š•v1y 包含有动物
¬Š¯∏•¶的 y个具有重要功能的保守
结构域 o与其他植物上 Š•¶的结
构相似 ∀采用荧光定量 °≤• 方法
确定 ΜηΓΛΡ316在平邑甜茶根 !茎 !
叶中均有表达且在叶中的表达量最高k图 yl op谷氨酸和 Œ…„能诱导根中 ΜηΓΛΡ316 的表达k图 zl ∀尽管
序列同源性分析和基因表达模式常常作为推测基因功能的重要标准 o但是功能分析才能最终说明它在植物
发育过程中的作用 ∀为确定 ΜηΓΛΡ316在苹果中的功能 o构建 vx≥ }}ΜηΓΛΡ316 反义表达载体 o并对−皇家嘎
啦.苹果进行农杆菌介导的遗传转化 o期望通过转基因植株的某些特征来推测 ΜηΓΛΡ316基因的部分功能 ∀
参 考 文 献
刘庆忠 o赵红军 o刘 鹏 o等 qusst q抗菌肽 …v|基因导入−皇家嘎啦. 苹果及其四倍体植株的培育 q园艺学报 ou{kxl }v|u p v|{ q
彭 勇 o彭福田 o周 鹏 o等 qussz q冬枣对不同形态氮素的吸收与利用 q应用生态学报 ot{kyl }tuyx p tuy| q
杨洪强 o接玉玲 qt||z q苹果砧木实生苗根系个体差异研究 q山东农业大学学报 ou{kwl }w{z p w|t q
张 青 o彭福田 o姜远茂 o等 qussx q草莓对不同形态氮素的吸收与分配 q园艺学报 ovukyl }tszs p tszu q
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ux 林 业 科 学 ww卷
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k责任编辑 徐 红l
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期刊 ∀主要报道森林资源与环境 !水土保持与荒漠化 !木材工业与技术科学 !林业机械与电子工程 !林产化学
与工业 !园林植物与风景园林 !林业经济与管理 !土木工程等以及有关边缘学科的研究成果 ∀另设置专栏集
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价数据库来源期刊 ~中国自然科学核心期刊 ~5中国学术期刊k光盘版l6首批入编期刊 !万方数据k≤«¬±¤¬±©²l
系统入编科技期刊群 ∀被国际国内著名检索刊物如5国际农业与生物科学研究中心k网络版l≤„…Œ6 !5ƒ„6 !
5ƒ°„6 !5剑桥文摘6 !5乌里希期刊指南6 !5哥白尼文摘6 !5• 6 !5中国生物学文摘6等数据库收录 ∀t||u年以
来 o本刊先后多次获得全国优秀科技期刊三等奖 !全国高校优秀学术期刊一等奖 !江苏省优秀自然科学学报
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vx 第 |期 主春福等 }平邑甜茶谷氨酸受体同源基因( ΜηΓΛΡ316)的克隆 !表达及转化