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Construction of A Pine Needle Symbiotic Engineered Bacterium Exhibiting the Insecticidal Activity to Dendrolimus punctatus

松叶面抗虫共生工程菌的构建


将来自Bacillusthuringiensissubsp.kurstaki的杀虫基因cryIAc通过综合质粒载体pEG601,整合到松树共生细菌B.cereus(Bc752)的染色体上,得到的工程菌对马尾松毛虫幼虫有明显的杀虫活性。此综合质粒含有能在营养期表达BtcryIAc基因的强启动子、cryIAc杀虫基因、四环素抗性标记基因tetr、8.0kb的EcoRI-NcoB.cereus(O147)染色体片段。将综合质粒通过电击导入Bc752中,综合质粒与Bc752染色体发生同源重组,将BtcryIAc基因整合到Bc752的染色体上。通过对转化子的DNA酶切分析、PCR扩增、SDS-PAGE凝胶电泳检测、Westernblot、电镜观察、毒力测定,结果表明BtcryIAc基因已经整合到松树共生细菌Bc752的染色体上,并可高效表达。

Bt cryIAc gene from Bacillus thuringiensis subsp. Kurstaki was introduced into the chromosome of pine symbiotic bacterium Bacillus cereus (Bc752) by an integrative vector pEG601. The vector contains a strong vegetative promoter, the cryIAc gene (identified as a 7.4 kb SphI-NruI fragment of DNA from B. thuringiensis HD-73), the tetracycline resistance gene (tetr) and an 8.0 kb EcoRI-NcoI fragment of chromosomal DNA from Bc752 to allow for homologous recombinant between the vector and the bacterial chromosome. Transformation of Bc752 with plasmid pEG601 by electroporation resulted in the engineered symbiotic bacteria. Insertion of the vector DNA into the chromosome was demonstrated by analysis of DNA restriction enzymes and PCR amplification. Recombination strains containing Bt cryIAc gene produced the 133ku protoxin which could be detected by SDS-PAGE, ELISA, electronmicroscope observation and insect bioassays.


全 文 :第 wt卷 第 w期
u s s x年 z 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤„∞
∂²¯1wt o‘²1w
∏¯ qou s s x
松叶面抗虫共生工程菌的构建
赵同海t 徐 静u 徐红梅v 张青文u 陈京元v
kt1 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 tsss|t ~ u1 中国农业大学昆虫学系 北京 tsss|w ~
v1 湖北省林业科学研究院森林保护研究所 武汉 wvssz|l
摘 要 } 将来自 Βαχιλλυστηυρινγιενσισ¶∏¥¶³q κυρστακι的杀虫基因 χρψŒ„¦通过综合质粒载体 ³∞Šyst o整合到松树共生
细菌 Β q χερευσk…¦zxul的染色体上 o得到的工程菌对马尾松毛虫幼虫有明显的杀虫活性 ∀此综合质粒含有能在营
养期表达 …·χρψŒ„¦基因的强启动子 !χρψŒ„¦杀虫基因 !四环素抗性标记基因 τετρ !{1s ®¥的 Εχο•Œp Νχο ´ Β qχερευσ
k’twzl染色体片段 ∀将综合质粒通过电击导入 …¦zxu中 o综合质粒与 …¦zxu染色体发生同源重组 o将 …·χρψŒ„¦基因
整合到 …¦zxu的染色体上 ∀通过对转化子的 ⁄‘„酶切分析 !°≤• 扩增 !≥⁄≥ p °„Š∞凝胶电泳检测 !• ¶¨·¨µ± ¥¯²·!电镜
观察 !毒力测定 o结果表明 …·χρψŒ„¦基因已经整合到松树共生细菌 …¦zxu的染色体上 o并可高效表达 ∀
关键词 } 苏云金芽孢杆菌 ~杀虫蛋白 ~松叶面共生菌 ~工程菌 ~马尾松毛虫
中图分类号 }±{t| 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsw p stt{ p sx
收稿日期 }ussv p s| p t{ ∀
基金项目 }中国林科院重点基金项目 ~国家林业局森林保护学重点实验室资助 ∀
Χονστρυχτιον οφ Α Πινε Νεεδλε Σψµ βιοτιχ Ενγινεερεδ Βαχτεριυµ
Εξηιβιτινγ τηεΙνσεχτιχιδαλ Αχτιϖιτψτο ∆ενδρολιµυσ πυνχτατυσ
«¤² ײ±ª«¤¬t ÷∏¬±ªu ÷∏‹²±ª°¨ ¬v «¤±ª ±¬±ªº¨ ±u ≤«¨ ±¬±ª¼∏¤±v
kt1 Ινστιτυτε οφ Φορεστ Εχολογψo Ενϖιρονµεντ ανδ Προτεχτιον o ΧΑΦ Βειϕινγ tsss|t ~ u1 ∆επαρτµεντ οφ Εντοµολογψo Χηινα Αγριχυλτυραλ
Υνιϖερσιτψ Βειϕινγtss|w ~ v1 Ινστιτυτε οφ Φορεστ Προτεχτιον o Ηυβει Αχαδεµψοφ Φορεστρψ Ωυηανwvssz|l
Αβστραχτ } …·χρψŒ„¦ª¨ ±¨ ©µ²° Βαχιλλυστηυρινγιενσισ¶∏¥¶³q κυρστακι º¤¶¬±·µ²§∏¦¨§¬±·²·«¨ ¦«µ²°²¶²°¨ ²©³¬±¨ ¶¼°¥¬²·¬¦
¥¤¦·¨µ¬∏° Βαχιλλυσχερευσ k…¦zxul ¥¼ ¤± ¬±·¨ªµ¤·¬√¨ √¨ ¦·²µ³∞Šyst1 ׫¨ √¨ ¦·²µ¦²±·¤¬±¶¤¶·µ²±ª √¨ ª¨·¤·¬√¨ ³µ²°²·¨µo·«¨
χρψŒ„¦ª¨ ±¨ k¬§¨±·¬©¬¨§¤¶¤z1w ®¥ ΣπηŒp ΝρυŒ©µ¤ª°¨ ±·²©⁄‘„ ©µ²° Βqτηυρινγιενσισ ‹⁄p zvl o·«¨ ·¨·µ¤¦¼¦¯¬±¨ µ¨¶¬¶·¤±¦¨
ª¨ ±¨ kτετρl ¤±§¤± {1s ®¥ Εχο•Œ p Νχµ¤ª°¨ ±·²©¦«µ²°²¶²°¤¯ ⁄‘„ ©µ²° …¦zxu ·² ¤¯ ²¯º ©²µ«²°²¯²ª²∏¶µ¨¦²°¥¬±¤±·
¥¨·º¨ ±¨·«¨ √¨ ¦·²µ¤±§·«¨ ¥¤¦·¨µ¬¤¯ ¦«µ²°²¶²°¨ q×µ¤±¶©²µ°¤·¬²± ²©…¦zxu º¬·«³¯¤¶°¬§³∞Šyst ¥¼ ¨¯ ¦¨·µ²³²µ¤·¬²± µ¨¶∏¯·¨§¬±
·«¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¨§¶¼°¥¬²·¬¦¥¤¦·¨µ¬¤qŒ±¶¨µ·¬²± ²©·«¨ √¨ ¦·²µ⁄‘„ ¬±·²·«¨ ¦«µ²°²¶²°¨ º¤¶§¨ °²±¶·µ¤·¨§ ¥¼ ¤±¤¯¼¶¬¶²© ⁄‘„
µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼°¨ ¶¤±§°≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²±q• ¦¨²°¥¬±¤·¬²±¶·µ¤¬±¶¦²±·¤¬±¬±ª…·χρψŒ„¦ª¨ ±¨ ³µ²§∏¦¨§·«¨ tvv®∏³µ²·²¬¬± º«¬¦«
¦²∏¯§¥¨ §¨·¨¦·¨§¥¼ ≥⁄≥ p °„Š∞o∞Œ≥„ o¨¯ ¦¨·µ²±°¬¦µ²¶¦²³¨ ²¥¶¨µ√¤·¬²± ¤±§¬±¶¨¦·¥¬²¤¶¶¤¼¶q
Κεψ ωορδσ} Βαχιλλυσ τηυρινγιενσισk…·l ~¬±¶¨¦·¬¦¬§¤¯ ³µ²·¨¬±~ ³¬±¨ ±¨ §¨¯¨ ¶¼°¥¬²·¬¦ ¥¤¦·¨µ¬¤~ ±¨ª¬±¨ µ¨¨§ ¥¤¦·¨µ¬∏°~
∆ενδρολιµυσ πυνχτατυσ
松毛虫k ∆ενδρολιµυσl是危害松树的重要害虫 o也是我国历史性的森林大害虫 o每年发生面积达 txs多万
«°u o造成巨大的经济损失和环境影响 ∀苏云金芽孢杆菌k Βαχιλλυστηυρινγιενσισo…·l是目前害虫生物防治 !植物
抗虫育种和杀虫工程微生物构建中研究较为深入 o应用较为广泛的一类微生物 o其杀虫剂已广泛应用于农
业 !林业和卫生害虫的生物防治k陈昌洁 ot||sl ∀ …·杀虫剂也广泛用于松毛虫的生物防治 o但是 …·杀虫剂在
实际使用中存在的无残留属性要求人们必须经常性地使用 o才能持续地控制害虫的发生k蒲蛰龙 ot||ul ∀
将 …·杀虫基因通过基因重组技术构建成工程微生物 o可提高杀虫晶体蛋白的产量 !扩大杀虫谱 !延长持
效期 o从而扩大 …·的使用范围 ∀ ’¥∏®º¬¦½kt|{yl将 …·杀虫基因转入了在玉米k Ζεα µαψσl根际定植的荧光假
单孢菌 Πσευδοµονασφλυορεσχενσ体内 o可以控制地下害虫的危害 ∀×∏µ±¨ µ等kt||tl 和 ¤°³¨¯等kt||wl 利用同
源重组技术 o将 …·杀虫基因转入在玉米维管束定植的内生细菌 Χλαϖιβαχτερ ξψλι ¶∏¥¶³qχψνοδοντισ体内 o利用工
程菌 ≤÷≤Π…·防治钻蛀性害虫欧洲玉米螟k Οστρινια νυβιλαλισl o可减少危害 ys h ∀ ≥¨ ¬¯±ª¨µ等kt||{l将 …·
κυρστακι杀虫基因导入根围定居菌 Βαχιλλυσπυµιτυσ体内 o用于防治地下害虫西方灰地老虎kΑγροτισ ορτηογονιαl ∀
赵同海等kt||yl !徐静等kussul将 …·χρψŒ„¦杀虫基因转入棉花k Γοσσψπιυµ ηιρσυτυµl内生细菌 o构建的重组工
程菌对棉铃虫k Ηελιοτηισ αρµιγεραl等棉花的鳞翅目害虫具有较高的杀虫活性 ∀ פ±ª • ¬¨等kussvl将人工合成
的 …·χρψŒ„¦基因转化火炬松k Πινυσ ταεδαl成熟的胚状体 o得到的转基因植株对马尾松毛虫k ∆ενδρολιµυσ
πυνχτατυσl和台湾大蓑蛾k Χρψπτοτηελεα φορµοσιχολαl具有明显的抗虫效果 ∀
胡炳福kt|{{ ~usssl对从松树针叶表面分离得到的两株优势共生细菌k Πσευδοµονασtzx和 Β q χερευσzxu o
…¦zxul进行了研究 o结果显示 o两株细菌引入松林生态系统后能迅速占领植物表面 o形成优势菌群k或/隔离
墙0l o抑制病原菌和其他有害菌 o调节植物的微生物环境 o促进植物生长 o具有防病促生的作用 ∀本研究采用
同源重组的方法 o将 …·χρψŒ„¦杀虫基因导入 …¦zxu菌株的染色体上 o构建松针叶面抗虫共生工程细菌 o使二
者的特点结合起来 o达到持续控制松毛虫的目的 ∀
t 材料和方法
111 材料
供试菌株 }松叶面共生菌 …¦zxuk抗硫酸链霉素突变株l由湖北省林科院胡炳福提供 ~抗虫蛋白基因
χρψt„¦供体菌 ∞Šzvtxk…¦xy| p y含质粒 ³∞Šxstl与 …·菌野生菌株 ‹⁄p zvk含 χρψt„¦目的基因l由中国农业
大学张青文提供 ∀
112 方法
t1u1t 综合质粒 ³∞Šyst的构建 提取含营养期表达 …·χρψŒ„¦基因的质粒 ³∞Šxst和宿主菌 …¦zxu染色体
⁄‘„ o分别用 Εχο•Œp ΝχοŒ酶切 o回收的质粒大片段和来自 …¦zxu的 v1x®¥的插入片段 o用 ×w ⁄‘„连接酶连
接 o形成综合质粒 ³∞Šyst ∀连接反应采用5分子克隆6的常规方法进行 ∀
t1u1u 综合质粒 ³∞Šyst向松针叶面共生细菌 …¦zxu中的转化 …¦zxu感受态细胞的制备依 …µ¬¤±等kt|{|l
的方法进行 o转化采用电转化法 o并辅以 ≤¤≤¯ u感受态转化法作为对照 ∀
t1u1v 转化子 ⁄‘„的 ΣπηŒp ΝρυŒ酶切检测 取转化子 ⁄‘„溶液 t{ ˏ与 u ˏ的 ts ≅限制酶缓冲液混匀 o
加入 t ∗ u ˜的限制酶混匀 ovz ε 下温育 t ∗ t1x «o加入 s1x °²¯#pt ∞⁄ׄk³‹ {1sl使终浓度达 ts °°²¯#pt终
止反应 ∀酶切产物通过 s1z h的琼脂糖凝胶电泳检测 ∀
t1u1w °≤• 扩增检测转化子
tl引物的设计参照 ≥∏¨ 等 kt||vl方法进行 oχρψŒ 特异性引物的序列分别为 }°µ¬°¨ µ t }xχ p
×≤„≤××≤≤≤„×≤Š„≤„×≤ׄ≤≤ ~°µ¬°¨ µu }xχ p „×≤„≤׊„Š×≤Š≤××≤Š≤„׊××׊„≤×××≤×≤ ∀
ul°≤• 扩增 }°≤• 反应体系建立后 o摸索其循环参数为 }|w ε 变性 t °¬±oxx ε 退火 t °¬±ozu ε 延伸 t
°¬±ovs次循环 o采用热启动 ∀
vl°≤• 产物的回收 !纯化与检测 }°≤• 产物的纯化与回收采用 °µ²°¨ ª¤公司 •¬½¤µ§× °≤• °µ²§∏¦·¶
°∏µ¬©¬¦¤·¬²± ≥¼¶·¨°进行 o°≤• 产物的检测采用 u h ׄ∞琼脂糖凝胶电泳检测 ∀
t1u1x ≥⁄≥ p °„Š∞凝胶电泳检测 分离胶浓度为 x h o具体步骤见文献k奥斯伯等 ot||{l o经染色 !脱色后 o
凝胶拍照显示结果 ∀从未染色的凝胶中回收毒蛋白作为抗原注射接种兔 ∀
t1u1y 抗原的纯化及免疫接种 采用 ≥¨ ³«¤§¨¶Š p zxk°«¤µ°¤¦¬¤公司l凝胶过滤分离纯化抗原 o用缓冲液
°…≥k³‹z1ul洗脱 o流速为 t °#°¬±pt o收集第一峰 o免疫接种委托中国农业科学院原子能研究所进行 ∀
t1u1z 抗血清的纯化 用硫酸铵沉淀 ŒªŠ o具体方法见文献k奥斯伯等 ot||{l ∀
t1u1{ ∞Œ≥„检测 参照 פ®¤«¤¶«¬等kt||{l方法 o采用双抗夹心 ∞Œ≥„法检测 ≤µ¼Œ„¦毒蛋白抗原 o步骤见
文献k奥斯伯等 ot||{l ∀
t1u1| 电镜观察 依李荣森等kt||ul方法进行 o取对数生长中期和芽孢形成期的工程菌培养液经洗涤离心
后 o用于制备透射电镜观察的样品 ∀
t1u1ts 毒力测定 将充分活化的工程菌株 o按体积分数 ts h接种量转接于 …液体培养基中 ou{ ε ouss
µ#°¬±pt振荡培养至孢子囊破裂 o芽孢和伴孢晶体释放出来 ∀将此菌液喷洒松针至滴水为度 o晾干后饲喂 u
龄马尾松毛虫幼虫 ∀y §后统计死亡率 ∀
|tt 第 w期 赵同海等 }松叶面抗虫共生工程菌的构建
u 结果和分析
211 转化子 ∆ΝΑ的 ΣπηΙ和 ΝρυΙ酶切分析
在目的基因 …·χρψŒ„¦片段的两端分别存在有 ΣπηŒ和 ΝρυŒ酶切位点 o由这两种酶切割的 χρψŒ„¦基因片
段长度约为 z1w ®¥∀ χρψŒ„¦基因供体菌 ∞Šzvtx和转化子的 ⁄‘„经 ΣπηŒp ΝρυŒ酶切后均出现 z1w ®¥条带 o
而未经转化的受体菌 …¦zxu的 ⁄‘„则无此带 o这表明 χρψŒ„¦基因已经整合到 …¦zxu的染色体上k如图 t所
示l ∀
图 t 转化子 ⁄‘„ ΣπηŒp ΝρυŒ酶切图
ƒ¬ªqt „±¤¯¼¶¬¶²© ΣπηŒp ΝρυŒ©µ¤°¨ ±·¶©µ²°·µ¤±¶©²µ°¤±·¶
¤}Κ⁄‘„ΠΗιν§ ¶ °¤µ®¨µ~¥o§}转化子 ≥‹ p t ×µ¤±¶©²µ°¤±·
≥‹ p t ~¦}转化子 ≥‹ p u ×µ¤±¶©²µ°¤±·≥‹ p u ~¨}∞Šzvtx ~©}
…¦zxu
图 u 转化子 ⁄‘„ °≤• 扩增图
ƒ¬ªqu °≤• ¤±¤¯¼¶¬¶²© χρψŒ„¦ª¨ ±¨
¤}…¦zxu ~¥}毒蛋白 „¦型基因 χρψŒ„¦ª¨ ±¨ ~¦q转化子
≥‹ p t ×µ¤±¶©²µ°¤±·≥‹ p t ~©} ‹⁄p zv ~§}转化子 ≥‹ p u
·µ¤±¶©²µ°¤±·≥‹ p u ~¨}°…• vuuΠΜσπŒ °¤µ®¨µ~ª} ∞Šzvtx ~
«}³∞Šyst
图 v ≥⁄≥ p °„Š∞凝胶电泳检测 ≤µ¼Œ„¦毒蛋白
ƒ¬ªqv ≥⁄≥ p ³²¯¼¤¦µ¼¯¤°¬§¨ ª¨¯ ¨¯ ¦¨·µ²³«¨µ²ªµ¤°
¤}‹⁄p zv ~¥}蛋白质分子量标准 °µ²·¨¬± °²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·
°¤µ®¨µ~¦o¨ oª}转化子 ≥‹ p u ×µ¤±¶©²µ°¤±·≥‹ p u ~§o©o«}
转化子 ≥‹ p t ×µ¤±¶©²µ°¤±·≥‹ p t ~­}…¦zxu
212 ΠΧΡ 扩增检测
用自行设计的 χρψŒ„¦特异性引物 °µ¬°¨ µt !°µ¬°¨ µu o在适宜
条件下 o分别以转化子 ⁄‘„ !综合质粒 ³∞Šyst !未经转化的
…¦zxu ⁄‘„ 为模板 o扩增结果如图 u 所示 }结果显示转化子
⁄‘„ !综合质粒 ³∞Šyst !‹⁄p zv的质粒 ⁄‘„和对照 ⁄‘„ 均能
扩增出长约 s1x ®¥的 χρψŒ„¦目的片段 o而未经转化的受体菌
…¦zxu则无此条带 o表明转化子 ⁄‘„中有 χρψŒ„¦基因存在 ∀
表 1 抗 Βτ χρψΙΑχ毒蛋白抗血清的 ΕΛΙΣΑ效价及其与 χρψΙΑχ的交叉反应
Ταβ . 1 Τηε τιτερσ οφ αντι χρψΙΑχ αντισερυµ ανδ χροσσ ρεαχτιϖιτιεσ οφ χρψΙΑχ
血清类型
×¼³¨ ²©¶¨µ∏°
样品
≥¤°³¯¨
血清稀释倍数 ⁄¬¯∏·¬²± ²©¶¨µ∏°
tΠtsy tΠtsx tΠtsw tΠtsv tΠtsu tΠts
抗血清 „±·¬¶¨µ∏° χρψŒ„¦ s1wxu t1vus t1ysv  t1yx  t1yx  t1yx
阴性兔血清 ‘¨ª¤·¬√¨ ¶¨µ∏° s1vsz s1v|{ s1ws| s1xv{ s1xy| s1zwz
抗血清 „±·¬¶¨µ∏° ≥‹pt s1wvu t1tus  t1x  t1x  t1x  t1x
≥‹pu s1vu{ s1|xw  t1x  t1x  t1x  t1x
…¦zxu s1u|{ s1wsz s1wv| s1v|t s1x{| s1zxy
213 Σ∆Σ − ΠΑΓΕ凝胶电泳
用 ≥⁄≥ p °„Š∞凝胶电泳检测转化子 χρψŒ„¦基因的表达与
否 o结果如图 v所示 }…·≤µ¼Œ„¦毒蛋白约为 tvv ®∏o与对照未转
化受体菌 …¦zxu相比 o转化子与 …·野生菌株均有 tvv ®∏的条带
出现 o这表明转化子均表达了 …·≤µ¼Œ„¦毒蛋白 ∀
214 ΕΛΙΣΑ检测结果
对抗血清进行 ∞Œ≥„效价检测表明 ots万倍稀释时抗血清与阴性血清反应的 ’⁄值比仍然大于 u1t倍
k见表 tl o因此认为制备抗血清最高有效稀释度应为 ts万倍以上 ∀而以不同稀释度抗血清对转化子 ≥‹ p t !
≥‹ p u及阴性对照 …¦zxuk未经转
化的受体菌l和阳性对照 …·
ΧρψŒ„¦毒蛋白进行检测结果表
明 ~两个转化子与抗血清的反应
均为阳性k见表 tl ∀由此可知 u
个转化子均表达了 …·ΧρψŒ„¦毒
蛋白 o其中 ≥‹ p t表达量较高 ∀
sut 林 业 科 学 wt卷
215 电镜观察结果
u1x1t 转化子芽孢形成期毒素 蛋白晶体的透射电镜观察结果如图 w o由于 …·χρψŒ„¦毒蛋白具有一定的结
构 o一般为菱形的伴孢晶体 o可电镜观察转化子有无伴孢晶体 ∀从图 w可见转化子 ≥‹ p t在芽孢期形成菱形
伴孢晶体 o表明转化子在芽孢期能够大量表达 …·χρψŒ„¦毒蛋白 ∀
图 w 转化子 ≥‹ p t芽孢期透射电镜观察结果ktu wxs ≅ l
ƒ¬ªqw ²µ³«²¯²ª¼ ²©³¤µ¤¶³²µ¤¯ ¦µ¼¶·¤¯¶§∏µ¬±ª¶³²µ∏¯¤·¬²± ²©≥‹ p t
¬± ¤± ¶¦¤±±¬±ª·µ¤±¶°¬¶¶¬²± ¨¯ ¦¨·µ²± °¬¦µ²¶¦²³¨ ktu wxs ≅ l
≤ }伴孢晶体 ≤µ¼¶·¤¯ ~≥ }芽孢 ≥³²µ¨ ~下同 ׫¨ ¶¤°¨ ¥¨ ²¯º q
图 x 转化子 ≥‹ p t营养期透射电镜观察结果kw| xss ≅ l
ƒ¬ªqx ²µ³«²¯²ª¼ ²©³¤µ¤¶³²µ¤¯ ¦µ¼¶·¤¯¶§∏µ¬±ª·«¨ √ ª¨¨·¤·¬√¨
ªµ²º·«²©≥‹ p t ¬± ¤± ¶¦¤±±¬±ª·µ¤±¶°¬¶¶¬²± ¨¯ ¦¨·µ²±
°¬¦µ²¶¦²³¨ kw| xss ≅ l
u1x1u 转化子营养生长期菌体的透射电镜观察 结果如图 x o从图可以看出 o转化子 ≥‹ p t在营养生长期
能产生伴孢晶体蛋白 ∀这说明插入到 …¦zxu菌株染色体的 …·ΧρψŒ„¦毒素蛋白基因 o不仅可在其本身携带
的依赖于芽孢形成因子的启动子下表达形成伴孢晶体 o也可以在四环素抗性基因的营养期表达启动子下表
达产生毒素晶体蛋白 o而且在双启动子下毒素蛋白的表达量更多 o伴孢晶体也较大 ∀
216 毒力测定
转 χρψŒ„¦基因工程菌 ≥‹ p t !…·野生菌株 ‹⁄p zv和受体菌 …¦zxu培养液对马尾松毛虫二龄幼虫k每个
处理试虫数均为 ys只ly §的生测结果 o三者的校正死亡率分别为 {y1t| h !{u1uw h和 y{1ww h o对照为工程
菌的毒力高于 …·野生菌株 ‹⁄p zv o三者的毒力大小依次为 ≥‹ p t  ‹⁄p zv  …¦zxu ∀
v 讨论
植物微生态学研究表明 o在植物体内外广泛存在着大量的非病原性微生物类群 o其中芽孢杆菌属的细
菌占居着优势地位 o而蜡质芽孢杆菌k Βαχιλλυσχερευσl更是其中的最优势者k梅汝鸿 ot||tl ∀蜡质芽孢杆菌与
苏云金芽孢杆菌之间具有极大的相似性 o在表型鉴定上除不能形成伴孢晶体外几乎没有什么不同 o遗传杂
交也表明它们在遗传上具有极大的同源性k°µ¬¨¶·ot|{tl ∀ Š²±½¤¯ ½¨等kt|{ul和 ≥¦«∏µ·¨µkt|{|l的研究说明 o
苏云金芽孢杆菌 ∆p内毒素蛋白基因可以在蜡质芽孢杆菌中正常地表达 o并形成同样形态的伴孢晶体 ∀本
研究结果也证实 o通过同源重组插入到松树针叶共生菌 …¦zxu菌株染色体上的 …·毒蛋白基因 χρψŒ„¦可以正
常表达 o形成菱形伴孢晶体 o并保持其良好的抗虫生物活性 ∀ …·毒蛋白基因 χρψŒ„¦在蜡质芽孢杆菌细胞内
可以正常表达并具有形成伴孢晶体的能力 o这一点为筛选鉴定转化子带来了极大的便利 o通过镜检伴孢晶体
即可判断转化是否成功 o可以免除了一般基因转化研究所必须进行的繁杂的 ‘²µ·«¨µ± …¯²·或 • ¶¨·¨µ± …¯²·步
骤 ∀
苏云金芽孢杆菌 ∆p内毒素蛋白的表达受发育调控 o它只有在静止期才产生芽孢和伴孢晶体 ∀在没有
形成芽孢的环境条件或芽孢形成突变株中 o不产生毒素蛋白k ·¨∏¶ ετ αλqot||sl ∀有关植物内生菌的研究
指出 o植物内生性微生物由于其和植物共同进化 o在植物体内暂时或永久性地丧失了产孢的能力k • «¬·¨ ετ
tut 第 w期 赵同海等 }松叶面抗虫共生工程菌的构建
¤¯ qot|{xl ∀本研究所用的转 …·素蛋白基因的宿主菌 …¦zxu菌株为松树叶表共生菌 o其在松树叶表共生繁
殖是否保持形成芽孢的能力目前还未见到研究报道 ∀但本研究利用 …¦zxu所构建的工程菌 o其 ∆p内毒素抗
虫基因携带有来自蜡质芽孢杆菌 ³…≤ty质粒的可在营养期高效率表达的启动子 o被引入到松树生态系统后 o
在增殖生长的同时 o即使不形成芽孢 o也可以产生毒素蛋白 o发挥抗虫效果 ∀
Β q χερευσ zxu菌株是从马尾松针叶表面分离得到的优势共生细菌 o胡炳福kusssl的研究表明 o…¦zxu菌
能够产生赤霉素kŠ„vl !吲哚乙酸kŒ„„l等促生物质和几丁质酶 !卵磷脂酶 ≤等抑菌物质 o对林木k或苗木l直
接起到促生和抗病作用 ∀卵磷脂酶 ≤同时也是昆虫的 Αp外毒素 o当昆虫的中肠不呈碱性时 o它可帮助细菌
侵入血腔 o破坏肠道 o使害虫致死 o所以 …¦zxu菌本身对马尾松毛虫幼虫也有一定的控制效果 ∀本研究的生
测试验也得到了同样的结果 o但对马尾松毛虫的抗虫效果不如 …·毒蛋白基因供体菌株 ‹⁄p zv o工程菌株
≥‹ p t对马尾松毛虫的毒力效果比 …¦zxu和 ‹⁄p zv都高 o可能是它结合了两者优势的缘故 ∀限于条件 o本
研究没能对工程菌株的 ≤xs进行测定 o这部分工作以及工程菌株对松毛虫的持续控制效果都有待于进一步
的研究 ∀
参 考 文 献
奥斯伯 ƒ o布伦特 • o金斯顿 • ∞o等 q颜子颖 o王海林译 qt||{ q精编分子生物学实验指南 q北京 }科学出版社
陈昌洁 qt||s1 松毛虫综合管理 q北京 }中国林业出版社 ou{u p vss
胡炳福 qt|{{ q两种抗生细菌防治林木病害研究初报 q生物防治通报 owkwl }tzu p tzx
胡炳福 qusss q°Š°• 及其在我国林业上应用研究 q贵州林业科技 ou{kul }wt p wz
李荣森 o戴顺英 o李小刚 o等 qt||u q土壤来源苏云金芽孢杆菌的形态 ∆p内毒素蛋白质及其毒力特性 q微生物学报 ovukyl }v{z p v|v
梅汝鸿 qt||t q植物微生态学发展简史 q见 }梅汝鸿 q第一届中国植物微生态学学术讨论会论文集 q北京 }中国农业大学出版社 oxz p zs
蒲蛰龙 qt||u q昆虫病理学 q广州 }广东科技出版社 oxts
徐 静 o张青文 o丁 军 o等 qussu q…·χρψŒ „k¦l杀虫基因向棉花内生细菌 Βαχιλλυ χερευσ染色体中整合的研究 q农业生物技术学报 otskul }t{| p
t|v
赵同海 o蔡青年 o罗 科 o等 qt||y q棉花内生抗虫细菌的研究 q见 }中国植物保护学会 q中国植物保护研究进展 q北京 }中国科学技术出版社 o
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