全 文 ：第 wt卷 第 x期
u s s x年 | 月
林 业 科 学
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双价抗病基因植物表达载体构建及
在烟草中表达的初步研究 3
陈 英t 戴咏梅u 黄敏仁t 诸葛强t 王明庥t
kt1 南京林业大学林木遗传和基因工程重点实验室 南京 utssvz ~ u q上海市花卉育种中心 上海 utsszul
摘 要 } 多基因转化是基因工程研究热点之一 ∀本研究应用 ⁄‘„重组技术 o将两个抗病机制不同 o抗菌谱较广的
抗病基因k天麻抗真菌蛋白 ΓΑΦΠ和兔防御素 ΝΠt基因l构建在一个植物表达载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ°2‘°t上 o两者具有
各自的 ΧαΜςvxΣ启动子和 Νοσ终止子 ∀通过根癌农杆菌介导 o采用叶盘法转化烟草 o°≤• 和 °≤•2≥²∏·«¨µ±分析证明
已将 ΝΠt和 ΓΑΦΠ基因整合到烟草基因组中 ∀离体抑菌实验表明转基因植株对真菌和细菌表现出一定的抗性 ∀
以上结果表明通过该表达载体进行遗传转化可获得含双价抗病基因植物 o并能有效表达 o提高转基因植物抗病
能力 ∀
关键词 }防御素基因 ΝΠt ~天麻抗真菌蛋白基因 ΓΑΦΠ~双价抗病基因植物表达载体 ~转基因烟草 ~抗病性
中图分类号 }±z{ 文献标识码 }„ 文章编号 }tsst p zw{{kussxlsx p ss{t p sx
收稿日期 }ussx p st p sy ∀
基金项目 }上海市农业科技攻关项目k第 w p w号l和南京林业大学高学历人才基金项目资助 ∀
3 黄敏仁为通讯作者 ∀
ςεχτορ Χονστρυχτιον ωιτη Τωο ∆ισεασε2ρεσιστανχε Γενεσ ανδ
Τηειρ Εξπρεσσιον ιν Τρανσγενιχ Τοβαχχο
≤«¨ ± ≠¬±ªt ⁄¤¬≠²±ª°¨ ¬u ‹∏¤±ª ¬±µ¨±t «∏ª¨ ±¬¤±ªt • ¤±ª ¬±ª¬¬∏t
kt qΚεψΛαβορατορψοφ Φορεστ Γενετιχσ ανδ Γενε Ενγινεερινγ o Νανϕινγ Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Νανϕινγ utssvz ~
u q Σηανγηαι Φλοωερ Βρεεδινγ Χεντρε Σηανγηαι ussszul
Αβστραχτ } Š¨ ±¨ ·¬¦·µ¤±¶©²µ°¤·¬²± º¬·« °∏¯·¬³¯¨ª¨ ±¨ ¶¬¶²±¨ ²©·«¨ ³²³∏¯¤µµ¨¶¨¤µ¦«¨¶¬± ª¨ ±¨ ±¨ª¬±¨ µ¨¬±ªq⁄¬©¨ ±¶¬± º«¬¦«¬¶
µ¨¶¬¶·¤±··² °¤±¼ ®¬±§¶²©√¬µ∏¶o¥¤¦·¨µ¬∏° ¤±§©∏±ª¤¯ o¤±§Š¤¶·µ²§¬¤„±·¬©∏±ª¤¯ °µ²·¨¬± kŠ„ƒ°l º«¬¦««¤¶·«¨ µ¨¶¬¶·¤±·¤¥¬¯¬·¼
·² °²µ¨ ·«¤±·º¨ ±·¼ ®¬±§¶²©©∏±ª¤¯ º¨ µ¨ ∏¶¨§©²µ·«¨ √¨ ¦·²µ¦²±¶·µ∏¦·¬²±q„¯¶²o·«¨ °¨ ¦«¤±¬¶°¶²©¤±·¬2§¬¶¨¤¶¨ ¥¼·º²ª¨ ±¨ ¶¤µ¨
§¬©©¨µ¨±·©µ²° ¤¨¦«²·«¨µq…¼∏¶¨ ²©⁄‘„ µ¨¦²°¥¬±¤·¬²± °¨ ·«²§¤√¨ ¦·²µk³…¬±vx≥Š„ƒ°2 ‘°tl·«¤·¦²±·¤¬±¶·«¨ ·º²¤±·¬2§¬¶¨¤¶¨
ª¨ ±¨ ¶} ΝΠt ¤±§ ΓΑΦΠ º¤¶¦²±¶·µ∏¦·¨§q  §¨¬¤·¨§ ¥¼ Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσo·«¨ ·º² §¬¶¨¤¶¨2µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ¶ º¨ µ¨
·µ¤±¶©¨µµ¨§¬±·²·²¥¤¦¦²∏¶¬±ª¯¨ ¤©2§¬¶® °¨ ·«²§q• ¶¨∏¯·¶²©°≤• ¤±§°≤•2≥²∏·«¨µ± §¨·¨µ°¬±¤·¬²±¬±§¬¦¤·¨§·«¤·ΝΠt ¤±§ ΓΑΦΠ
ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ¬±·¨ªµ¤·¨§¬±·²·«¨ ·²¥¤¦¦²ª¨±²°¨ qŒ± √¬·µ²·¨¶·¬±ª²©·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶·² √¬µ∏¶o¥¤¦·¨µ¬∏° ¤±§©∏±ª¤¯ ¶«²º¨ §·«¤·
·«¨¼ «¤§·«¨ µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ·²·«¨ ªµ²º·«²© Αγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσo Τριχηοδερµαρεεσει o Σπηαεροπσισσαπινεαo¤±§¬·º¤¶¤³³¨¤µ¨§
·«¤·ΝΠt ¤±§ ΓΑΦΠ ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§ ©¨©¬¦¬¨±·¯¼¬±·µ¤±¶ª¨±¬¦·²¥¤¦¦²¤±§·«¨ ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶«¤§§¬¶¨¤¶¨2µ¨¶¬¶·¤±·¤¥¬¯¬·¼
·²³¤·«²ª¨±¶q׫¨µ¨©²µ¨ o¥¼ ∏¶¬±ª·«¬¶√¨ ¦·²µ·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·¶º¬·«·«¨ ·º²¤±·¬2§¬¶¨¤¶¨ ª¨ ±¨ ¶º¨ µ¨ ²¥·¤¬±¨ §º«¬¦« º¨ µ¨ ³µ²√¨ §
·² ¥¨ ¬¨³µ¨¶¶¨§ ©¨©¬¦¬¨±·¯¼ ¤±§·«¨ ¤¥¬¯¬·¼ ²©¤±·¬2§¬¶¨¤¶¨ ¦²∏¯§¥¨ ¬±¦µ¨¤¶¨§q
Κεψ ωορδσ} ΝΠt ~Š¤¶·µ²§¬¤ „±·¬©∏±ª¤¯ °µ²·¨¬± k ΓΑΦΠl ~√¨ ¦·²µº¬·«·º² ¤±·¬2§¬¶¨¤¶¨ ª¨ ±¨ ¶~·µ¤±¶ª¨±¬¦·²¥¤¦¦²~§¬¶¨¤¶¨2
µ¨¶¬¶·¤±¦¨
病害是导致农林业减产主要原因之一 ∀人们一直努力通过各种育种方法进行抗病品种的选育 o基因工
程是其中有效的途径之一 ∀国内外科学家已利用转基因技术在植物抗病基因工程方面进行了不少有益的研
究 o获得了许多转基因抗病植物 ∀但由于植物在生长过程中会受到多种病害k细菌 !真菌 !病毒和线虫等l的
袭击 o单独转入某一个抗病基因往往具有一定的局限性 ∀为了提高转基因植物的广谱抗病性和持久性 o更好
地抵御不同病害 o就需要同时转入一个以上的 !广谱抗性的抗病基因 o因此多基因载体的构建和遗传转化的
研究日渐增多 ∀
兔防御素是迄今为止表现出抗微生物谱最广的防御素k§¨©¨ ±¶¬±l之一 o对革兰氏阴性菌 !阳性菌 !分枝杆
菌 !真菌 !被膜病毒 !‹Œ∂ 病毒在不同程度上都有抑制作用 o还能杀灭鼠肿瘤等恶性细胞k¨«µ¨µετ αλqot||vl ∀
天麻抗真菌蛋白kª¤¶·µ²§¬¤¤±·¬©∏±ª¤¯ ³µ²·¬¨±o ΓΑΦΠl位于天麻次生块茎的表皮和皮层 o对天麻次生块茎阻抑蜜
环菌侵染有关 o离体抑菌实验表明天麻抗真菌蛋白对多种真菌均有抑菌活性k胡忠等 ot|{{l ∀因此本研究将
兔防御素基因 ΝΠt和天麻抗真菌蛋白基因 ΓΑΦΠ构建在一个载体上 o转化烟草 o以期提高转基因烟草对多
种病害的抗性 o并且探索一条有效的多基因转化途径 ∀
图 t 双价抗病基因植物载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t的构建路线
ƒ¬ªqt ≤²±¶·µ∏¦·¬²± ²© ¬¨³µ¨¶¶¬²± √¨ ¦·²µ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t
º¬·«·º²§¬¶¨¤¶¨ µ¨¶¬¶·¤±¦¨ ª¨ ±¨ ¶
t 材料和方法
111 材料和试剂
大肠杆菌k Εσχηεριαχηια χολιl⁄‹xΑo根癌农杆菌
kΑγροβαχτεριυµ τυµεφαχιενσl工程菌株 …„wwsw ~质粒
³…¬±vx≥‘° p t o³…¬±vx≥Š„ƒ° o³⁄vsu p ƒ∏o³Š∞
p z½©均由中国科学院遗传与发育生物研究所孙勇
如研究员提供 ~
以烟草无菌苗为实验材料 o分化培养基 }≥ n y
p …„ u °ª#pt n Œ„„ s1x °ª#pt ~筛选培养基 }≥
n y p …„ u °ª#pt n Œ„„ s1x °ª#pt n Ž¤± xs °ª#
pt n ¦¨© xs °ª#pt ~生根培养基 }tΠu≥ n Ž¤± xs
°ª#pt n ¦¨©xs °ª#pt ~
瑞氏木霉kΤριχηοδερµα ρεεσειl由南京林业大学化
工学院余世袁教授提供 ~松枯梢病菌k Σπηαεροπσισ
σαπινεαl由南京林业大学森环学院韩正敏教授提供 ∀
112 双价抗病基因植物表达载体 πΒιν35ΣΓΑΦΠ−
ΝΠΙ的构建
采用常规 ⁄‘„重组技术 o涉及质粒提取 !转化
酶切 !片段回收 !连接和重组子的鉴定等 ∀具体构
建路线如图 t所示 }通过 ‹¬±§¶ n ∞¦²• ´双酶切将
基因表达盒/ vx≥ p ΝΠt p ΝΟΣ终止子0切下 o连接
与用同样的双酶切载体 ³⁄vsu p ƒ˜上 o即中间载
体 ³⁄vsu p ƒ˜ p vx≥‘°t o在 ‹¬±§¶前增加了 ÷«²Œ
位点 ~用 ÷«²Œn ∞¦²•Œ分别双酶切中间载体 ³Š∞ p
z½©和 ⁄vsu p ƒ˜ p vx≥‘°t o连接为第二个中间载
体 ³Š∞ p ‘°t¥~³Š∞ p ‘°t¥的基因表达盒/ vxΣ
p ΝΠt p Νοσ终止子0两端均具有 ‹¬±§¶位点 o采
用 ‹¬±§¶单酶切将其切下 o连接于含另一抗病基因
植物表达载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ°的 ‹¬±§¶处 o构建为双
价抗病基因表达载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°上 o两个基
因具有各自的 ΧαΜςvxΣ启动子和 Νοσ终止子 ∀
113 烟草遗传转化
参照 §¨ …¯²¦®kt|{{l的方法 o将 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p
‘°tЏ„…wwsw培养至 ’⁄yss Υt1s o离心 o重悬 o取组培 v周龄的无菌烟草叶片 o去中脉 o剪成 s1x ∗ t1s ¦°u 的叶
盘浸染于菌液中 ts °¬±o用无菌滤纸吸干多余菌液 o移至分化培养基 ux ε 暗培养 w{ «o再将叶片转入筛选培
养基继续暗培养约 t周 o待叶盘边缘长出淡黄色愈伤组织后移到光下培养 ∀每 v周继代 t次 ∀当芽长至
t ¦°左右 o转至生根培养基诱导生根 o生根后移栽至 ux ε 左右的温室中 ∀
u{ 林 业 科 学 wt卷
114 转基因烟草的 ΠΧΡ 分析
用 ≤ׄ…法提取具有 Ž¤±抗性的部分转基因植株和阴性植株的总 ⁄‘„ ∀ ΝΠt双引物分别为 tl Š×Š
ׄŠ Š„× ≤≤„ ׊Š ׊Š ×≤× Š×Š ≤Š× Š≤„ Š„≤ Š oul ŠŠŠ „Š„ Š≤× ≤„Š ׄŠ ×≤≤ „„„ ≤„× Š× ~ΓΑΦΠ双引
物分别为 tl „≤Š ×≤× „Š„ „ŠŠ Š„× ≤ŠŠ ×׊ „„× oul Š„× ≤×≤ Š„Š Š≤≤ „Š„ „Š≤ ≤Š≤ ≤Š≤ ×Š× ∀°≤• 扩
增程序为 }|w ε 预变性 x °¬±o|w ε 变性 vs ¶oys ε 复性 vs ¶ozu ε 延伸 vs ¶o进行 vs个循环后再延伸 ts °¬±∀
115 ΠΧΡ − Σουτηερν分析
提取 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t质粒 o用 ÷¥¤´和 ≥¤¦´进行双酶切 o电泳并回收相应目的基因片段作为待标记
的探针 oΓΑΦΠ约 wss ¥³oΝΠt约 uss ¥³∀采用由 •²¦«¨ 公司生产的 ⁄ŒŠ p ¤¥¨¬¯¬±ª试剂盒进行探针标记 ∀以
非转化植株和 °≤• 阳性植株总 ⁄‘„为模版 o对 ‘°t和 Š„ƒ°两个基因同时进行 °≤• 扩增 o电泳 o转膜 ∀然后
采用该试剂盒杂交和显影分析 ∀
116 转基因植株的抑菌实验
本实验采用琼脂糖孔穴扩散法k方宏筠等 ot|||l o分别取非转化植株和 °≤• 检测为阳性植株的幼叶于
无菌研钵中捣碎 o按照 t ª#°pt加入无菌磷酸钠缓冲液k³‹y1wl o研成匀浆 ∀将匀浆转入无菌离心管中 ow ε
抽提过夜 ots sss µ#°¬±pt w ε 离心 us °¬±o取上清供测试用 ∀
将农杆菌工程菌株…„wwsw培养至对数期 ow sssµ#°¬±pt室温离心 ts °¬±o收集菌体 o用无菌磷酸钠缓冲
液洗涤 u次 ∀取 tss ˏ菌悬液 o加入温度约 ws ε 的 …固体培养基中 o充分混匀 o铺平板 ∀待培养基冷却凝
固后 o用无菌枪头培养基平板上打孔 o取出琼脂块 o分别加入阴性对照和待测样品 uss ˏou{ ε 温箱内培养 o
uw ∗ vy «后观察抑菌结果 ∀
将瑞氏木霉和松枯梢病菌分别接种于马铃薯培养基平板上 ovs ε 培养至菌丝萌发 ∀用无菌枪头分别在
菌丝处和空白马铃薯培养基平板圆心位置打孔 o取出空白琼脂块 o将有菌丝的琼脂块填入其中 ovs ε 培养至
菌丝直径约为 v ¦°∀再在接种孔左右两边打孔 o取出琼脂块 o分别加入阴性对照和待测样品 uss ˏovs ε 温
箱内培养 ouw ∗ vy «后观察抑菌结果 ∀
u 结果与分析
211 双价抗病基因载体 πΒιν35ΣΓΑΦΠ− ΝΠ1的鉴定
/ vxΣ p ΝΠt p Νοσ0基因表达盒k长 t1v ®¥l是通过 ‹¬±§¶单酶切 o插入 ³…¬±vx≥Š„ƒ°的 ‹¬±§¶处连接而
成的 ∀随机挑取转化子培养 o提取质粒 o并进行 ‹¬±§¶酶切鉴定 o切下了 t1v®¥的片段k图 ul o说明双价抗病
 }tss¥³¤§§¨µ~t }³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t进行 ‹¬±§¶酶切 o切下约 t1v®¥片段 ‹¬±§ ¶
µ¨¶·µ¬¦·§¬ª¨¶·¬²± ²©³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‹°t ot qv ®¥~u }³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t ~
v }³…¬±vx≥Š„ƒ°进行 ‹¬±§¶酶切 ‹¬±§¶ µ¨¶·µ¬¦·§¬ª¨¶·¬²± ²©³…¬±vx≥Š„ƒ° ~
w }³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t
图 u ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t酶切检测
ƒ¬ªqu • ¶¨·µ¬¦2§¬ª¨¶·¬²±¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ²©³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t
基因载体 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t构建
完成 ∀最后 o将构建好的表达载体
³…¬±vx≥‘°ŒŠ„ƒ° p ‘°t通过液氮冻
融法转入根癌农杆菌工程菌株
…„wwsw中 ∀
212 Καν抗性植株的获得
将烟草叶片转入筛选培养基
约 u 周后 o叶片膨大 o周围开始皱
缩 o并有淡黄色愈伤组织生成 o而
阳性对照愈伤长势更好 o有芽点产
生 ~阴性对照仅仅叶片有些膨大 ∀
此时将它们移到光下kty «#§ptl o
再过两周转化叶片长出 Ž¤±抗性苗 o阳性对照几乎没有分化出抗性芽 ∀将芽移入含 Ž¤± xs °ª#pt的生根培
养基上 o大部分在 ts §左右都能正常生根 ∀
213 Καν抗性植株的 ΠΧΡ 检测
选取 us株生长状态较好的 Ž¤±抗性苗和 t株非转基因植株 o用 ≤ׄ…法提取植物总 ⁄‘„ oΓΑΦΠ基因采
用双引物进行 °≤• 扩增 ∀结果表明 o转基因植株同阳性对照k质粒 ³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°tl一样 o在约 uss¥³
v{ 第 x期 陈 英等 }双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究
k ΝΠt基因片段l和 wss¥³k ΓΑΦΠ基因片段l处各有一条特征带 o而在阴性对照的泳道上却没有该特征带
k图 vl ∀
 }tss¥³ ¤¯§§¨µ~≤Žn }阳性对照 o³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t质粒 ~
≤Žp }阴性对照 o未转化植株 ‘²±2·µ¤±¶ª¨±¬¦³¯¤±·~t p z }转基因植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶q
图 v 部分转双价抗病基因烟草的 Ž¤±抗性植株的 °≤• 检测
ƒ¬ªqv °≤• ¤°³¯¬©¬¦¤·¬²± ²©¶²°¨Ž¤±2µ¨¶¬¶·¤±·³¯¤±·¶²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²
≤Žn }阳性对照 o ΓΑΦΠ基因片段和 ΝΠt基因片段 ~
≤Žp }阴性对照 o未转化植株 o‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·~t p ts }转基因植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·¶
图 w 部分转双价抗病基因烟草植株 °≤• p ≥²∏·«¨µ±杂交
ƒ¬ªqw °≤• p ≥²∏·«¨µ± ²©¶²°¨·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²
214 ΠΧΡ − Σουτηερν杂交分析
为进一步验证 ΝΠt基因和 ΓΑΦΠ
基因是否已整合到植物基因组中 o对
°≤• 阳性植株进行了 °≤• p ≥²∏·«¨µ±
杂 交 ∀ 图 w 中 第 一 泳 道 为
³…¬±vx≥Š„ƒ° p ‘°t质粒的双基因 °≤•
扩增产物 o第二泳道为非转化植株的
°≤• 产物 o第 v至第 tu泳道为 Ž¤±抗
性植株 °≤• 产物 ∀从图 w可以看出 o
在筛选培养基上能正常分化 o生长健壮的 Ž¤±抗性植株 o均产生两条带分子量与阳性对照相同 o即约 uss¥³
和 wss¥³的杂交带 ∀上述结果表明 ΝΠt基因和 ΓΑΦΠ基因已整合到烟草基因组中 ∀
215 ΠΧΡ 阳性植株抑菌作用检测
琼脂糖孔穴扩散实验结果证明 }转基因烟草具有一定的抑制根癌农杆菌 !瑞氏木霉和松枯梢病菌的活性
k图 xl ∀说明 ΝΠt基因和 ΓΑΦΠ基因已经整合到烟草基因组中 o并且得到有效的表达 ∀
…„wwsw ~ 瑞氏木霉 Τ qρεεσει ~ 松枯梢病菌 Σ qσαπινεα
≤Žp }未转化植株 ‘²±2·µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·~x }转基因植株 ×µ¤±¶ª¨ ±¬¦³¯¤±·
图 x 转双价抗病基因烟草植株离体抑菌活性检测
ƒ¬ªqx „±·¬§¬¶¨¤¶¨ ¤¦·¬√¬·¼¬± √¬·µ²²©·µ¤±¶ª¨ ±¬¦·²¥¤¦¦²
v 讨论
利用多基因同时改良植物性状是目
前基因工程的研究热点之一 k≥·¤±·²±o
t||{l ∀ ‹ §¨¬kt||yl通过基因枪法将 tu
个质粒转入大豆 ~冯道荣等kt|||l将 Βp
t ov p葡聚糖酶基因和碱性几丁质酶基
因同时转入水稻 o证明转双抗真菌基因
的水稻植株同时提高了对稻瘟病和枯纹
病菌的抗性 ∀但将多个基因构建在不同
的表达载体上依次或同时转入同一受
体 o不仅耗时费力 o而且得到多基因的效率也会随着载体数的增加而大幅度地下降k≤«¨ ± ετ αλqot|{{ ~戴顺洪
等 ot||{l ∀如将目的基因构建在同一个表达载体上 o多基因表达载体构建完成后 o只需通过一次转化就可方
便而成功地获得多价基因同时表达的转基因植物k≤«µ¬¶·²∏ot||sl ∀如多价抗真菌病表达载体 ΡΧuw n ΡΑΧuu
n ΡΧΗtsk冯道荣等 ousssl oΑΠuw n Γλυk陈雁等 oussvl o Χηι n Γλυk吴家和等 ousswl o并且通过一次转化获得
了转多价基因的抗病水稻和抗黄萎病棉花 ∀本研究将两个抗病基因构建于同一表达载体上 o通过一次转化
即可获得含双价抗病基因的转基因植株 o极大地提高了转化效率 ∀
林木生长周期长 o树体高大 o其所遭受的病害较农作物而言更为复杂 o因此选择适宜的抗病基因非常关
键 ∀兔防御素抗菌谱很广 o抗性机理特殊 o病原菌不易对起产生抗性 o因此在植物抗病基因工程中应用极为
广泛 o已转入烟草k傅荣昭等 ot||{l !小麦k郭殿京等 ot|||l !杨树k赵世民等 ot|||l等 o对细菌和病毒表现出
w{ 林 业 科 学 wt卷
抗性 ∀天麻抗真菌蛋白离体抑菌实验表明多种真菌 o如小麦赤霉病菌k Γιββερελλα σαυβινετιχl !苹果树轮纹病菌
k Μαχροπηοµα κυωατσυκαιl !葡萄霜霉病菌k Πλασµοπαρα χιτιχολαl !棉花黄萎病k ςερτιχιλλιυµ δαηλιαεl和杉木炭疽病
菌等k Χολλετοτροχηυµ γλοεοσποριοιδεσl均有抑菌活性tlk胡忠等 ot|{{l ∀可见两个基因的抗菌机制不同 o抑菌谱各
异 o在林木基因工程中有极大的应用情景 ∀
tl 王义琴 qusst q天麻抗真菌蛋白kŠ„ƒ°l的 ¦⁄‘„克隆 !原核表达及离体抑菌活性研究 q中科院遗传与发育研究所博士论文
笔者通过根癌农杆菌介导 o转化烟草 o获得了转双价抗病基因植株 ∀转基因的烟草离体抑菌结果表明对
根癌农杆菌 !瑞氏木霉和松枯梢病菌表现出抗性 o说明两个抗病基因均得到了有效的转录和表达 o并且对真
菌和细菌生长有一定的抑制作用 o抗菌谱较单一抗病基因广 ∀因此 o本研究为进一步利用这两个基因 !利用
所构建的双价抗病基因表达载体转化其他植物 o如林木 !花卉 !农作物提供了理论和实践基础 ∀但今后还需
对转基因植株所插入两个抗病基因间的相互作用以及两个基因的遗传稳定性进行深入研究 ∀此外 o本研究
所构建的载体选用的启动子为组成型强表达启动子 o对转基因植株本身以及环境存在一定的影响 o采用组织
特异型或诱导型启动子更加适宜 o这还需要进一步研究 ∀
参 考 文 献
陈 雁 o饶勇强 o孟金陵 qussv q转双价广谱抗病基因创造甘蓝型油菜抗菌核病新品种的研究 q分子植物育种 otkwl }wxz p wyv
戴顺洪 o李良材 o丁月云 o等 qt||{ q水稻基因枪多基因转化研究 q遗传学报 ouxkwl }vwx p vxs
方宏筠 o王关林 o王火旭 o等 qt||| q抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株 q植物学报 owtkttl }tt|u p tt|{
冯道荣 o许新萍 o卫剑文 o等 qt||| q使用双抗真菌蛋白基因提高水稻抗病性研究 q植物学报 ottktl }t p x
冯道荣 o许新萍 qusss q多个抗病抗虫基因在水稻中的遗传和表达 q科学通报 owxktxl }tx|v p tx|z
傅荣昭 o彭于发 o曹光诚 o等 qt||{ q兔防御素 ‘° p t基因在转基因烟草中的表达及其对青枯病的抗性研究 q科学通报 owvktl }t p w
郭殿京 o傅荣昭 o张晓东 qt||| q小麦中外源基因瞬间表达调控研究及兔防御素k‘° p tl基因的转化 q遗传学报 ouykul }ty{ p tzv
胡 忠 o杨增明 o王 钧 qt|{{ q天麻球茎中一种抗真菌蛋白的分离和部分特性 q云南植物研究 ots }vzv p v{s
吴家和 o张献龙 o罗晓丽 o等 qussw q转几丁质酶和葡聚糖酶基因棉花的获得及其对黄萎病的抗性 q遗传学报 ovtkul }t{v p t{{
赵世民 o祖国诚 o刘根齐 qt||| q通过农杆菌介导法将兔防御素 ‘° p t基因导入毛白杨k Ποπυλυστοµεντοσαl q遗传学报 ouykyl }ztt p ztw
≤«¨ ± o ¤µ°¨ ¼ ° oפ¼¯²µ‘qt|{{ q∞¬³µ¨¶¶¬²± ¤±§¬±«¨µ¬·¤±¦¨ ²© °∏¯·¬³¯¨·µ¤±¶ª¨ ±¨ ¶¬±µ¬¦¨ ³¯¤±·¶q‘¤·∏µ¨ …¬²·¨¦«oty }tsys p tsyw
≤«µ¬¶·²∏° qt||s q≤²·µ¤±¶©²µ°¤·¬²±©µ¨ ∏´¨ ±¦¬¨¶²©©²µ¨¬ª± ª¨ ±¨ ¶¬± ¶²¥¨¤± ¦¨¯¯ ¦∏¯·∏µ¨ q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·oz|kul }}vvz p vwt
§¨ …¯²¦®  qt|{{ qŠ¨ ±²·¼³¨2¬±§¨ ³¨ ±§¨±·¯ ¤¨©§¬¶¦·µ¤±¶©²µ°¤·²± ²©³²·¤·² k Σολανυµ τυβεροσυνl ∏¶¬±ª „ªµ²¥¤¦·¨µ¬∏°·∏°¨ µ©¤¦¬¨±¶q׫¨ ²µ„³³¯ Š¨ ±¨ ·ozykxl }
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x{ 第 x期 陈 英等 }双价抗病基因植物表达载体构建及在烟草中表达的初步研究