全 文 ： 第 vy卷 第 u期u s s s年 v 月
林 业 科 学
≥≤Œ∞‘׌„ ≥Œ∂ „∞ ≥Œ‘Œ≤ „∞
∂ ²¯1vy o ‘²1u
¤µqou s s s
树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究 µ
) ) ) Βοτρψοσπηαερια属 u{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ°和 • „°⁄解析
张星耀 赵仕光tl 吕 全 贾秀贞
k中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 北京 tsss|tl
刘会香ul
k山东农业大学林学院 泰安 uztsssl
摘 要 }Βοτρψοσπηαερια ≤ ¶¨q ·¨§¨ ‘²·qk无性阶段是 ∆οτηιορελλα ≥¤¦¦ql属病原真菌能引起多种林木溃疡病的
发生 o在我国分布区域十分广泛 ∀病原菌因较大的寄主范围和地理分布区域表现出明显的分子遗传分化 o通
过对来自 x个区 tw个寄主种k品种l的 vs个菌株进行 u{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ°和 • „°⁄解析 o结果表明 o所有
供试菌株都能扩增出稳定一致的 u{≥ µ⁄‘„ 条带 oy种内切酶不能区分该属内部的 u{≥ µ⁄‘„ 差异 ∀ • „°⁄
结果表现出该属丰富的多样性k|u1{t h l o在 s1{wx相似系数的水平上所有菌株被识别为 tv类 o其中有地理
分化 !寄主分化的表现 o也有不表现地理 !寄主分化的 ∀从 ⁄‘„ 水平上证实引起雪松溃疡病的病原为 Β .
δοτηιδεα ,表明 Β . δοτηιδεα不仅能够寄生被子植物 o还能寄生裸子植物 o有非常宽阔的寄主范围 ∀随机扩增
引物 Žty和 • tw可以作为陕西菌株和湖南菌株与其它地区菌株区别的鉴别性引物 ∀传统上认为苹果轮纹
病菌( Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³q πιριχολα k‘²¶¨l Ž²ª¤±¨ ½¤º¤ ·¨≥¤®∏°¤l为苹果干腐病菌k Β . βερενγεριανα
¥¨ ‘²·ql的专化型 o它们与杨树溃疡病原分属两个种 ∀本试验分析表明这种分类较为合理 ∀
关键词 } Βοτρψοσπηαερια属 ou{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ° o • „°⁄o鉴别性引物
收稿日期 }t|||2ts2tw ∀
基金项目 }国家自然科学基金k项目批准号 v|zzsytzl !国家林业局森林保护学重点开放性实验室基金 ∀
tl西北林学院讲师 o在职博士研究生 ∀
ul山东农业大学助教 o客座研究人员 ∀
ΜΟΛΕΧΥΛΑΡ ΓΕΝΕΤΙΧ ∆Ις ΕΡΣΙΤΨ ΟΦ ΠΑΤΗΟΓΕΝΙΧ
ΦΥΝΓΑΛ ΓΡ ΟΥΠ ΧΑΥΣΙΝΓ ΤΡΕΕ ΧΑΝΚΕΡ µ
) ) ) u{Σ ρ∆ΝΑ2ΠΧΡ2ΡΦΛΠ ΑΝ∆ ΡΑΠ∆ ΑΝΑΛΨΣΙΣ ΟΦ
ΒΟΤΡ ΨΟΣΠΗΑΕΡΙΑ ΣΠΠ.
«¤±ª ÷¬±ª¼¤² «¤² ≥«¬ª∏¤±ª | ±∏¤± ¬¤ ÷¬∏½«¨ ±
( Τηε Ρεσεαρχη Ινστιτυτε οφ Φορεστ Εχολογψ, Ενϖιρον µεντ ανδ Προτεχτιον , ΧΑΦ Βειϕινγ tsss|t)
¬∏ ‹∏¬¬¬¤±ª
( Φορεστρψ Χολλεγε οφ Σηανγδονγ Αγριχυλτυρε Υνιϖερσιτψ Ταιαν uztsss)
Αβστραχτ : Βοτρψοσπηαερια ≤ ¶¨q ·¨§¨ ‘²·qo¬·¶¤¶¨¬∏¤¯ ³«¤¶¨ ¬¶ ∆οτηιορελλα ≥¤¦¦qo¦¤∏¶¨¶¦¤±®¨ µ²© °¤±¼ √¤µ¬2
·¨¬¨¶²©·µ¨ ¶¨¤±§¬·¶§¬¶·µ¬¥∏·¬²± µ¨ª¬²±¬¶√ µ¨¼ º¬§¨ q׫¨ ¶¨ ·º²¤ª¨ ±·¶¦¤∏¶¨ °²¯ ¦¨∏¯¤µª¨ ±¨ §¬√ µ¨¶¬·¼q°≤ •2¤°³¯¬2
©¬¨§u{≥ µ⁄‘„ ³µ²§∏¦·¶²©vs¬¶²¯¤·¨¶©µ²° x µ¨ª¬²±¶¤±§tw √¤µ¬¨·¬¨¶²©«²¶··µ¨ ¶¨º µ¨¨ ·«¨ ¶¤°¨q ׫¨ ³²¯¼°²µ2
³«¬¶° ²± §¬ª¨¶·¬²± º¬·«¶¬¬µ¨¶·µ¬¦·¬²± ±¨½¼° ¶¨º¤¶±¨ ¤µ¯¼·«¨ ¶¤°¨q≥²o·«¨ u{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ° ¤±¤¯¼¶¬¶º¤¶
±²·¶∏¬·¤¥¯¨©²µ§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬±ª·«¨ ¶³¨¦¬¨¶º¬·«¬± ª¨ ±¨ µ¤q • „°⁄ ¤±¤¯¼¶¬¶²© ¤¯¯·«¨ ¬¶²¯¤·¨¶¶«²º §¨·«¤··«¨ µ¨ º¤¶
¤¥∏±§¤±·³²¯¼°²µ³«¬¦⁄‘„ º¬·«¬±·«¨ ª¨ ±¨ µ¤k|u1{t h l q „¯ ¯·«¨ ·¨¶·¨§¬¶²¯¤·¨¶º µ¨¨ §¬√¬§¨§¬±·² tv ¦¯∏¶·¨µ¶¤¦2
¦²µ§¬±ª·²s1{wx ¶¬°¬¯¤µ¬·¼q ’±¨ ³¤µ·²©¬¶²¯¤·¨¶°¤±¬©¨¶·¨§·«¨ §¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬²± ¥¨¦¤∏¶¨ ²©§¬©©¨ µ¨±·²µ¬ª¬±¤±§«²¶·q
׫¨ ³¤·«²ª¨ ± ²© Χεδρυσ δεοδαρᦤ±®¨ µº¤¶³µ²√ §¨·² ¥¨ Β . δοτηιδεα αχχορδινγ ·²¬·¶⁄‘„ ³²¯¼°²µ³«¬¶° q≥²o
·«¨ «²¶·²©·«¨ ³¤·«²ª¨ ± º¤¶√ µ¨¼ º¬§¨ o¬±¦¯∏§¬±ª¤±ª¬²¶³¨µ° ¤±§ª¼°±²¶³¨µ° q × º² ³µ¬° µ¨¶²© • „°⁄ ¤±¤¯¼¶¬¶o
Žty ¤±§ • tw o¦²∏¯§ ¥¨ ·«¨ ¬§¨±·¬©¬¦¤·¬²± ³µ¬° µ¨¶¤¶§¬©©¨ µ¨±·¬¤·¬±ª·«¨ ¬¶²¯¤·¨¶²© ≥«¤±¬¬³µ²√¬±¦¨ ¤±§ ‹∏±¤±
³µ²√¬±¦¨ ©µ²° ²·«¨µ¶q• „°⁄¤±¤¯¼¶¬¶§¨ °²±¶·µ¤·¨§·«¤··«¨ ·µ¤§¬·¬²±¤¯ ·¤¬²±²°¼ ²© Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³q
πιριχολαk‘²¶¨lŽ²ª¤±¨ ½¤º¤ ·¨≥¤®∏°¤¤¶·«¨ ¶³¨¦¬¤¯¬½¤·¬²± ²© Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·qº¤¶µ¨¤¶²±¤¥¯¨q„±§·«¨ ¶¨
·º²³¤·«²ª¨ ±¶¦¤∏¶¬±ª¤³³¯¨¦¤±®¨ µº µ¨¨ §¬©©¨ µ¨±·¶³¨¦¬¨¶©µ²° ·«¤·²±¨ ¦¤∏¶¬±ª°²³¯¤µ¦¤±®¨ µq
Κεψ ωορδσ: Βοτρψοσπηαερια , u{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ° o • „°⁄oŒ§¨ ±·¬©¼¬±ª³µ¬° µ¨¶
Βοτρψοσπηαερια ≤ ¶¨q ·¨§¨ ‘²·qk无性阶段是 ∆οτηιορελλα ≥¤¦¦l属引起的树木溃疡病是目前我国人工林的
重大生物灾害之一k张星耀 ot||{¤l o它分布于我国广大区域 o包括东北 !华北 !江淮 !江西 !西北等地区 ∀该属
真菌可危害近 uss个杨树种 !杂交种和无性系 o造成生长量的损失和死亡k向玉英 ot|{zl ∀除了杨树外 o还危
害核桃 !柳树 !梧桐 !刺槐 !苹果 !石榴 !桃树以及雪松等 ∀较大的寄主范围和地理分布区域促使病原菌发生
分化 o是产生分子遗传多样性的机制之一k张星耀 ot|||l ∀
研究该病原真菌的分子遗传多样性 o对于掌握病原菌对寄主的适应性 !致病性和地理分化具有重要意
义 o为抗病育种和溃疡病的可持续控制提供理论依据 o同时为溃疡病病原真菌类群的分子系统积累原始数
据 ∀
t 材料和方法
1 q1 供试菌
供试菌为 Βοτρψοσπηαερια属内 u个种的 vs个菌株k见表 tl o地理分布区域包括西北暖温带半干旱
半湿润季风气候区 o东北温带干旱 !半干旱季风型大陆性气候区 o江淮平原北亚热带湿润区 o华北湿润 !
半湿润暖温带区南部的黄淮平原和华北湿润 !半湿润地区北部 ~寄主包括杨树的多个品种 !槐树 !桃树 !
石榴 !雪松以及苹果等 ∀虽然供试菌株并没有涵盖所有寄主及地理区域 o但从整体范围上看具有代表
性 ∀在野外具有典型症状的寄主上采得病组织后 o采用一般的组织分离法和菌落边缘菌丝纯化法得到
菌株k方中达 ot|z|l ∀在 °≥„k马铃薯 ussªo蔗糖 usªo琼脂 usªo水 tsss°l平面培养基上培养 o并据在
培养基上产生的子实体对菌株的分类地位进行形态解剖鉴定 ∀鉴定后的菌株进一步人工接种至寄主
枝条 o证实其致病性 o并根据在寄主接种部位出现典型症状的组织上产生的子实体 o再次对菌株进行形
态解剖鉴定 ∀经上述过程最后确定分类地位的菌株进行进一步单分生孢子分离纯化 o纯化后的菌株用
于分子遗传多样性研究的试验 ∀试验用菌株保存于 °≥„斜面培养基上 ∀使用前在 °≥„平面培养基上
培养 ts§左右 o随后在菌落边缘取直径 v°° 的菌饼接种至液体培养基k马铃薯 ussªo蔗糖 usªo水
tsss°l中 ouz ε !静置 !无光照培养 ts§后收获菌丝 ∀收获后的菌丝经灭菌无离子水 v次洗净后保存
于 p us ε 备用 ∀
1 .2 ∆ΝΑ的提取
⁄‘„提取方法主要参考 «∏ ‹ ±¨ª等的方法kt||vl o并作部分改进 ∀具体方法如下 }将 s1t ª菌丝
剪断 o加 xss ˏ提取缓冲液ktss °  ×µ¬¶2‹≤¯o³‹|1s ~ws °  ∞⁄× „ o³‹{1sl otss ˏts h ≥⁄≥ ovss
ˏ氯化苄 o充分混匀 oxs ε 培育 t «o每 x °¬±充分混匀 t次 ∀加 vss ˏv  醋酸钠 o³‹x1s o冰中保持
tx °¬±o然后离心kttsss µ³° ow ε ous °¬±l o取上清液 ∀加入 tru体积的饱和酚 o抽提 u次 o加 urv体积
的冷异丙醇 o混匀 o放置冰箱中 t «以上 ∀离心ktusss µ³° ots °¬±l o去上清液 ∀zs h冷乙醇洗涤 u ∗ v
次 o每次 ts °¬±并离心ktusss µ³°l ∀充分干燥 o去除乙醇k阴干l ∀加适量k约 tss ˏl×∞溶解 o并加入
• ‘¤¶¨ „kus Λªr°l ovz ε 处理 wx °¬±后 o置 p us ε 保存备用 ∀
1 .3 28Σ ρ∆ΝΑ的 ΠΧΡ 扩增
试验采用在真菌 !植物和动物的 µ⁄‘„ 扩增中广泛使用的 u种引物 }• ’ • kx. 2„≤≤≤ Š≤ × „„≤ ×2
× „„Š≤2v. l和 • zkx. 2× „≤ × „≤≤ „≤≤ „„Š„× ≤ ×2v. lk张星耀 ot||{¥~• ¤¨§¨µ˜ ετ αλ. ,t|{x ~∂¬¯ª¤¯¼¶
yz 林 业 科 学 vy卷
• ετ αλ. ,t||sl o委托华美生物技术公司k北京l合成 o在 °≤ • 仪k° µ¨®¬±2∞¯ ° µ¨⁄‘„ ׫¨µ°¤¯ ≤¼¦¯ µ¨
w{sl上扩增 ∀反应总体积为 tss ˏo其中模板 ⁄‘„xs ±ª左右 ots ≅的  ªu n ts ˏots ≅的 °≤ • 反应缓
冲液 ts ˏo§‘×°kts°  lw ˏoפª酶 x˜ o以灭菌无离子水补足 tss ˏ∀反应条件为 }|w ε 预变性 w
°¬±以后 o|w ε 变性 t °¬± !xu ε 退火 t °¬±和 zu ε 延伸 u °¬±为一个循环 o共计 wx个循环后 ozu ε 保
持 ts °¬±∀为防止扩增过程中高温引起反应液蒸发 o于反应液表面加入 us ˏ矿物油 ∀相同条件下设
无模板 ⁄‘„的扩增反应为对照 ∀扩增产物在 t1y h的琼脂糖k°µ²° ª¨¤产品l凝胶k含有 xˏt h的溴
化乙锭rtss °l上 !t ≅ ׅ∞缓冲液 !电压 {s ∂ !v «电泳分离 o紫外灯下观察 !照相记录 ∀选用华美公
司 ¤§§¨µtss ¥³的 °≤ • °¤µ®¨ µ作为分子量标记 ∀
表 1 供试菌及其寄主和采集地 ≠
Ταβ .1 Τηεισολατεσ υσεδ ιν τηεστυδψ ανδ τηειρ ηοστ ανδ οριγιν
菌株
Œ¶²¯¤·¨
种
≥³¨ ¦¬¨¶
寄主
‹²¶·³¯¤±·
采集地
յ»±
…§t Βοτρψοσπηαερια δοτηιδεα 北京杨k Ποπυλυσ≅ βειϕινγενσισ • q≠ q‹¶∏l 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤¤±¬¬
…§u Β . δοτηιδεα 箭杆杨kΠ. νιγρο q√¤µqτηεϖεστιναk⁄²§¨l…¨ ¤±ql 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤¤±¬¬
…§v Β . δοτηιδεα 小美旱k Π. σι µ ονιι ≤¤µµq≅ k Πψραµιδαλισ …ª¨n ≥¤¯¬¬ °¤·¶∏§¤±¤ Ž²¬§½¦√ q°²³¯¤µ¬¶. ll 辽宁铁岭 ׬¨ ¬¯±ªo¬¤²±¬±ª
…§w Β . δοτηιδεα y|杨k Π. δελτοιδεσ ¦¯ q/ Λυξ0l 湖南 ‹∏±¤±
…§x Β . δοτηιδεα 雪松k Χεδρυσ δεοδαραk• ²¬¥qlŠ q⁄²±l 河南 ‹ ±¨¤±
…§y Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .l 北京温泉 • ±¨ ∏´¤± o …¨ ¬­¬±ª
…§z Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .l 北京海淀 ‹¤¬§¬¤±o …¨ ¬­¬±ª
…§{ Β . δοτηιδεα 青杨k Π. χατηαψανα • «¨§l 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤±¬¬
…§| Β . δοτηιδεα 银新杨k Π. αλβα √¤µq Πψραµιδαλισ …ª¨ l 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤±¬¬
…§ts Β . δοτηιδεα 银白杨k Π. αλβα q≅ Π. τοµεντοσα ≤¤µµl 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤±¬¬
…§tt Β . δοτηιδεα 黑杨k Π. νιγρα ql 陕西杨陵 ≠¤±ª¯¬±ªo≥«¤±¬¬
…§tu Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .) 北京平谷 °¬±ªª∏o …¨ ¬­¬±ª
…§tv Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .) 北京长阳 ≤«¤±ª¼¤±ªo …¨ ¬­¬±ª
…§tw Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .) 山东泰安 פ¬¤± o≥«¤±§²±ª
…§tx Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .) 北京 …¨ ¬­¬±ª
…§ty Β . δοτηιδεα 中槐k Σοπηορα ϕαπονιχα ql 北京九龙山 ¬∏¯²±ª¶«¤±o…¨¬­¬±ª
…§tz Β . δοτηιδεα 杨树k Π. ¶³ql 辽宁大连 ⁄¤¯¬¤±o¬¤²±¬±ª
…§t{ Β . δοτηιδεα 北京杨k Π. ≅ β .) 北京 …¨ ¬­¬±ª
…§t| Β . δοτηιδεα 小美旱k Π. σ. ≅ ( Π. σ. ° qll 辽宁铁岭 ׬¨ ¬¯±ª¬¤²±¬±ª
…§us Β . δοτηιδεα 小美旱k Π. σ. ≅ ( Π. σ. ° qll 辽宁铁岭 ׬¨ ¬¯±ª¬¤²±¬±ª
…§ut Β . δοτηιδεα 桃树k Πρυνυσ περσιχαkql…¤·¶¦«ql 辽宁丹东 ⁄¤±§²±ª¬¤²±¬±ª
…§uu Β . δοτηιδεα 桃树k Π. π .l 北京 …¨ ¬­¬±ª
…§uv Β . δοτηιδεα 石榴k Πυνιχα γρνατυ µ l 山东泰安 פ¬¤± o≥«¤±§²±ª
…§uw Β . δοτηιδεα 石榴k Π. γ .l 北京香山 ÷¬¤±ª¶«¤± o …¨ ¬­¬±ª
…¥t Β . βερενγεριανα δε ‘²· 苹果k Μαλυσ πυ µιλα) 北京平谷 °¬±ªª∏o …¨ ¬­¬±ª
…¥u Β . βερενγεριανα 苹果k Μ . π .) 北京长阳 ≤«¤±ª¼¤±ªo …¨ ¬­¬±ª
…¥v Β . βερενγεριανα 苹果k Μ . π .) 山东泰安 פ¬¤± o≥«¤±ª§²±ª
…¥w Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³qπιριχολα 苹果k Μ . π .) 北京平谷 °¬±ªª∏o …¨ ¬­¬±ª
…¥x Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³qπιριχολα 苹果k Μ . π .) 北京长阳 ≤«¤±ª¼¤±ªo …¨ ¬­¬±ª
…¥y Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³qπιριχολα 苹果k Μ . π .) 山东泰安 פ¬¤± o≥«¤±§²±ª
≠菌株 …§v由西北林学院病理室提供 o…§x由河南农业大学任国兰教授提供 o在此谨致谢意 o其余由作者自己采集分离 ∀ ∞¬¦¨³·©²µ
·«¨ ¬¶²¯¤·¨¶¦²¯¯¨ ¦·¨§¤±§¬¶²¯¤·¨§¥¼·«¨ ¤∏·«²µ¶o…§v º¤¶³µ²√¬§¨ §¥¼·«¨ °¤·«²¯²ª¼ ⁄¬√¬¶¬²± ²© ‘²µ·«2º ¶¨·ƒ²µ¨¶·µ¼ ≤²¯¯¨ ª¨ ¤±§…§x ¥¼ °µ²©¨¶2
¶²µ• ±¨ Š∏²¯¤± o ‹ ±¨¤± „ªµ¬¦∏¯·∏µ¨ ˜±¬√ µ¨¶¬·¼ q
1 q4 内切酶筛选和酶解反应
通过用 °√∏µ o•¶¤´ o≥¤∏v„ ´ o
פª´ o‘µ∏´ o¶³ ´ o…¶¶‹ µ o‹¤¨
¶ o∞¦²• ´ o‹³¤ µ o°¶·´ o∞¦²• ∂ o
‹¬±§¶ o…¤°‹ ´ o‹«¤´等 tx种内切
酶作酶解试验 o其中 y种酶有切点k表
ul o用于 • ƒ°解析 ∀
表 2 对供试菌株有切点的内切酶
Ταβ .2 Ρεστριχτιον ενζψµεσ υσεδ ιν τηε αναλψσισ οφ ΡΦΛΠ
酶 ∞±§²±∏¦¯ ¤¨¶¨ ≥¤∏v„ ´ • ¶¤´ ‹³¤µ ¶³´ ‹¤¨ ¶ פª´
识别位点
• ¦¨²ª±¬½¤·¬²± ¶¬·¨ ¡Š„× ≤ Š×¡„≤ ≤¡≤ ŠŠ ≤¡≤ ŠŠ ŠŠ¡≤≤ ס≤ Š„
最适反应温度
’³·¬°∏° ·¨°³¨µ¤·∏µ¨ vz ε vz ε vz ε vz ε vz ε yx ε
zz u期 张星耀等 }树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究 µ
酶解反应总体积为 ux ˏo其中 ⁄‘„扩增产物 ts ˏo限制性内切酶 u ˏo相应的缓冲液 u ˏo灭菌
无离子水 tt ˏo最适反应温度完全酶解kt «以上l后 o加入 ∞⁄× „溶液使终浓度为 ts °  o终止反应 ∀
酶解产物在 t1y h琼脂糖凝胶k含有 x ˏt h的溴化乙锭rtss °l上 !t ≅ ׅ∞缓冲液 !{s∂ 电压 !v «
电泳分离 o紫外灯下观察 !照相记录 ∀选用华美公司 ¤§§¨µtss¥³的 °≤ • °¤µ®¨ µ作为分子量标记 ∀
从 ⁄‘„提取 o经 °≤ • 扩增至酶切及电泳分离 o整个试验的重复次数大于 u ∀
1 .5 Ρ ΑΠ∆分析的 ∆ΝΑ随机扩增及其引物的选择
实验中所用引物由 ’³¨µ¤± × ¦¨«q公司合成 oפª酶由中国科学院遗传研究所生产 ∀
扩增条件 采用 ux ˏ反应体系 ∀包括 u1x ˏ缓冲液ktss °  ×µ¬¶2‹≤¯otx °   ª≤ u¯ oxs ° 
Ž≤ l¯ ot ˏ的随机引物 os1x ˏ的 §‘×°kts °  l os1u ˏ的 פª酶kx˜rˏl ot ˏ的模板 ⁄‘„ 和
t|1{ ˏ的灭菌双蒸水 o反应体系中最后加入 us ˏ矿物油以防止反应液蒸发 ∀
反应程序 |w ε 预变性 w °¬±后进入循环 }|w ε 变性 wx ¶¨¦ov| ε
退火 t °¬±ozu ε 延伸 t °¬± ws ¶¨¦o共 wx个循环 o然后在 zu ε 延伸 ts
°¬±结束反应 ∀
扩增反应在 °≤• 扩增仪k°¨ µ®¬±2∞¯ ° µ¨⁄‘„ ׫¨µ°¤¯ ≤¼¦¯¨ µw{sl上
进行 ∀相同条件下设无模板 ⁄‘„ 的扩增反应为对照 ∀扩增产物在
t1y h的琼脂糖k°µ²° ª¨¤产品l凝胶k含有 x ˏth的溴化乙锭rtss °l
上 !t ≅ ׅ∞缓冲液 !电压 {s ∂ !v «电泳分离 o紫外灯下观察 o照相记录 ∀
选用华美公司 ¤§§¨µtss ¥³的 °≤• °¤µ§¨µ作为分子量标记 ∀
从 ⁄‘„提取 o经 °≤ • 随机扩增至电泳分离 o整个试验的重复次数
大于 u ∀
使用 ws个引物kŽŒ×¶}’°Žt ∗ us和 ’°• t ∗ usl进行 ⁄‘„ 的随
机扩增 o其中 tv个引物k见表 vl具有重复性好 !特异性高且谱带强 !适
合判读 !有较高多态性的表现 o用于 • „°⁄分析 ∀
1 q6 数据处理及分析
表 3 用于 Ρ ΑΠ∆分析的引物序列
Ταβ .3 Νυχλεοτιδεσεθυενχεοφ ΠΧΡ
πριµερ υσεδ ιν τηεστυδψ
引物
•µ¬°¨ µ
ŽŒ×¶
序列
≥¨´ ∏¨±¦¨
kx. p v. l
Žs| ≤≤≤ׄ≤≤Š„≤
Žty Š„Š≤Š×≤Š„„
Žt| ≤„≤„ŠŠ≤ŠŠ„
Žus Š×Š×≤Š≤Š„Š
•su ≤„≤„Š≤׊≤≤
•sw ≤≤≤Š×„Š≤„≤
•s{ ≤≤≤Š×׊≤≤×
• s| ׊„Š≤„≤Š„Š
•tt Š×„Š≤≤Š×≤×
• tv ŠŠ„≤Š„≤„„Š
•tw ≤„ŠŠ„××≤≤≤
• tx ŠŠ„≤„„≤Š„Š
•us „≤ŠŠ≤„„ŠŠ„
根据某一条谱带在样品中出现和不出现 o出现赋值为/ t0 !不出现赋值为/ s0 o统计各菌株的扩增谱带数 o
并依据公式 Σ €u Ναβ/ (να n νβ) o计算样品间的相似系数 Σ∀公式中 Ναβ代表两样品间共有的谱带数 oνα代表
α样品的总谱带数 , νβ代表 β样品的总谱带数 ∀
用非加权平均连锁法k˜°Š „l分析供试菌株间的亲缘关系 ∀相似系数的计算和系统聚类分析均由
‘×≥≠≥k∂ µ¨¶¬²± tqzuot||xl分析软件自动完成 ∀
u 结果与分析
2 .1 28Σ ρ∆ΝΑ扩增结果
所有供试菌株在上述 u{≥ µ⁄‘„的 °≤• 扩增体系和条
件下均得到稳定的一条谱带 o分子量为 tv{s ¥³∀供试菌株
的扩增图谱如图版 t所示 ∀
2 .2 28Σ ρ∆ΝΑ的酶切图谱
y种内切酶对供试菌株 u{≥ µ⁄‘„的酶切图谱如图版 t
所示 o每种内切酶对于 vs个菌株的酶切谱带都表现出完全
一致性 k表 wlo表明试验所用内切酶不足以区分
Βοτρψοσπηαερια属内部 u{≥ µ⁄‘„的差异 ∀
2 .3 ΡΑΠ∆扩增结果及其聚类分析
表 4 各内切酶对供试菌株的酶切谱带数及其分子量
Ταβ .4 Τηε νυµ βερ ανδ λενγτη οφ φραγ µεντσ οφισολατεσ
διγεστεδ βψσιξ ρεστριχτιον ενζψµεσ
内切酶
∞±½¼° ¶¨
各带型和分子量
…¤±§¶¤±§¬·¶°²¯ ¦¨∏¯¤µº ¬¨ª«·
合计
ײ·¤¯
‹³¤µ yts vss uvs tvs tss tvzs
¶³´ yts vss uvs tvs tss tvzs
≥¤∏v„ ´ xus vvs uws tys tvs tv{s
‹¤¨ ¶ v{s vss txs tus |xs
פª´ xss v{s uws tvs tss tvxs
•¶¤´ yvs v{s vxs tvys
使用 tv个引物进行 • „°⁄扩增 o得到 txv条谱带k图版 ul o其中 twu条出现多态性 o占总带数的
|u1{t h ∀对所用谱带进行聚类分析 o得到相似系数矩阵k表 xl !树状聚类图k图 tl ∀
{z 林 业 科 学 vy卷
|z u期 张星耀等 }树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究 µ
图 t 供试菌株 • „°⁄聚类 ˜°Š  „树状图
ƒ¬ªqt ˜°Š  „ ¦¯∏¶·¨µ§¨ ±§µ²ªµ¤° ¥¤¶¨§²± • „°⁄§¤·¤©µ²° vs ¬¶²¯¤·¨¶∏¶¬±ªtv §¬©©¨ µ¨±·³µ¬° µ¨¶
根据 s1{wx的相似系数水平可以将供试的 vs个菌株分为 tv类 ∀其中来自陕西杨陵不同杨树品
种上的菌株 …§t !…§u !…§| !…§ts !和 …§tt聚为一类 o表现出病原菌的地理分化k来自同一地区的菌株表
现出更强的亲缘性l o另外有来自于相同寄主的菌株聚为一类 o表现出明显的寄主分化 o如分别来自北
京和山东的北京杨上的菌株 …§y !…§tu !…§tv和 …§tw聚为一类 o分别来自辽宁 !北京的桃树上的两菌株
…§ut和 …§uu聚为一类 o以及来自中槐的菌株 …§ty单独成为一类 ∀但是在表现出地理分化 !寄主分化
的同时 o也有不表现分化的情况 ∀同样来自陕西杨陵的菌株 …§{与其余 x个聚在一起的陕西菌株中最
大的相似系数也仅为 s1{{u o被聚在另外一类中 o而与分别来自于辽宁 !河南 !湖南的菌株 …§v !…§x !…§w
聚为一类 ~同样来自北京杨上的菌株 …§tu !…§tx !…§z !…§t{分属于不同类群 o没有表现出寄主分化 o以
及石榴上的山东菌株 …§uv和北京菌株 …§uw之间的相关系数仅为 s1{ts o分属于两个类群 ∀同一地区
小美旱上的 v个菌株 …§v !…§t|和 …§us中 o后两者亲缘关系十分接近 o相关系数达 s1|w{ o而 …§v则聚
在另外一个较远的类群中 ∀
…§x是引起雪松溃疡病的菌株 ovs个菌株中唯一来自于裸子植物寄主上的 ∀从系统聚类树中可以
明显看出它与其它所有阔叶树上的菌株没有表现出明显差异 o甚至体现出的多态性只是局限于 Β .
δοτηιδεα种内 o与另外一个种 Β . βερενγεριανα处于亲缘关系较远的两个类群中 ∀表明 Β . δοτηιδεα不
仅能够寄生被子植物 o还能寄生裸子植物 o有非常广阔的寄主范围 ∀
v 结论和讨论
3 q1 u{≥ µ⁄‘„分析结果表明该编码区段不适宜表现 Βοτρψοσπηαερια属下分类单位的分子多样性 ∀这
与该区段进化速率相对慢 o序列高度保守有关 o它只适宜于进行属 !科乃至目水平上的分类比较 ∀
3 q2 引物 Žty和 • tw可以作为鉴别陕西杨陵菌株k…§t !…§u !…§{ !…§| !…§ts和 …§ttl和湖南菌株
k…§wl与其它菌株区别的特异性引物 ∀ • tw的扩增图谱中 o这两个地区的菌株共有一条 yss ¥³的特殊
s{ 林 业 科 学 vy卷
谱带 o而在 Žty的扩增谱带中这些菌株与其它菌株相比又恰好缺少一条 tsss ¥³的谱带 ∀
3 q3 目前认为苹果干腐病菌 Β . βερενγεριανα与杨树溃疡病菌 Β . δοτηιδεα是同属一属的两个种 o苹果
轮纹病菌 Β . βερενγεριανα §¨ ‘²·q©q¶³q πιριχολα为苹果干腐病菌的专化型 ∀本试验分析结果与这种分
类状况基本一致 o表明它们分类地位的合理性 ∀苹果轮纹病菌 …¥w !…¥x和 …¥y有较高的亲缘关系 ∀而
苹果干腐病菌 …¥t !…¥u和 …¥v并没有表现出紧密的亲缘关系 o…¥u和 …¥v聚在一起 o与其它溃疡病菌
共同形成一类 o与 …¥t只在 s1ysz的相似系数上聚为一类 o种间的相似性大于种内相似性 ∀是不是由
于苹果干腐病菌的分化或不同病原物引起苹果干腐形成这种现象 o有待深入研究 ∀
3 q4 Β . δοτηιδεα种群内部存在着较为丰富的 • „°⁄多态性 o这种多态性能够在一定程度上反映出菌
株的地理分化 !寄主分化 o但同时也有不表现地理分化 !寄主分化的大量多态性存在 ∀溃疡病菌在大范
围内主要依靠人为传播 o受到地理 !社会和经济等多方面的影响 ∀溃疡病菌有潜伏侵染的特性 o人为传
播的主要方式是苗木调运 ∀苗木的调运也受树种的地区适应性影响和限制 o使得不同地区溃疡病菌株
在地区间的传播也受到限制 o随着时间的延长 o则可能形成适应当地气候条件的菌株 o最后产生致病力
和形态上的分化 o在 ⁄‘„的水平上也表现出了一致性和多态性 ∀可以据此推断病原菌的起源 ∀该种
具有广阔的寄主范围 o不但可以寄生被子植物 o还可以以裸子植物为寄主产生致病性 ∀
参 考 文 献
方中达 q植病研究法 o北京 }农业出版社 ot|z| otuz ∗ tvu
向玉英 q杨树病害及其防治 q北京 }中国林业出版社 ot|{z oxx ∗ ys
张星耀 o赵仕光 o朴春根等 q树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究 q´ q小穴壳菌属 !疡壳孢属 !壳囊孢属 !盾壳霉属分类地位的
分子证明 q林业科学 ot||| ovxkvl }vw ∗ ws
张星耀 q森林生物灾害控制的新世纪策略及其实施基础 q中国林业科学院编 o面向 ut世纪的林业 ) ) ) 可持续发展全球战略下的林业科
学技术 q北京 }中国农业科技出版社 ot||{¤}vwt ∗ vwx
张星耀 q基于培养性质模糊解析和 u{≥ µ⁄‘„2°≤ •2• ƒ°解析的外担子菌属真菌的分类学研究 q林业科学 ot||{¥ovwkwl }x| ∗ zt
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t{ u期 张星耀等 }树木溃疡病病原真菌类群分子遗传多样性研究 µ