全 文 ： 第 vz卷 第 v期u s s t年 x 月
林 业 科 学
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¤¼ou s s t
银杏愈伤组织超低温保存的研究 3
徐刚标tl 易 文wl
k中南林学院 株洲 wtussyl
李美娥ul
k湖南省林业厅 长沙 wtssszl
郑从义vl
k武汉大学 武汉 wvsszul
摘 要 } 本文对银杏子叶愈伤组织进行了超低温保存研究 ∀结果表明 o冰冻保护剂 !冷冻速度对解冻后材料
相对存活率影响较大 o冻前预培养和预冻至某一温度停留一段时间也较为重要 ∀在含高浓度山梨醇或甘露醇
的培养基上预培养 u§的愈伤组织 o用 ts h二甲基亚砜 n s qx °²¯#pt山梨醇作为冰冻保护剂 o以 t ε #°¬±pt速
度降温 o在 p tx ε !p vx ε 分别停留 ts °¬±和 vs°¬±后 o投入液氮中保存 t§o细胞相对存活率可达 ys h以上 ∀
再培养时 o细胞能恢复生长 ∀
关键词 } 银杏 o子叶 o愈伤组织 o超低温保存
收稿日期 }t|||2tt2uw ∀
基金项目 }湖南省自然科学基金k湘科字k|zlvz号 p tsl ∀
3 本研究试验是在武汉大学中国典型培养物保藏中心完成的 o得到了彭珍荣 !李广武两教授的支持 o论文承中南林学院何 方教授
审阅 o在此一并致谢 ∀
tl !ul !vl !wl为作者顺序 ∀
ΤΗΕ ΣΤΥ∆ΙΕΣ ΟΦ ΧΡΨΟΠΡΕΣΕΡ ς ΑΤΙΟΝ ΟΦ ΧΑΛΛΥΣ
ΦΟΡ ΜΑΙ∆ΕΝΗΑΙΡ ΤΡΕΕk ΓΙΒΓΚΟ ΒΙΛΟΒΑ Λql
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k ΧεντραλΣουτη Φορεστρψ Υνιϖερσιτψ Ζηυζηου wtussyl
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k Φορεστρψ ∆επαρτµεντ οφ Ηυναν Προϖινχε Χηανγσηα wtssszl
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k Ωυηαν Υνιϖερσιτψ Ωυηαν wvsszul
Αβστραχτ} ≥·∏§¬¨¶²©¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤µ¬²± ²©¦¤¯ ∏¯¶²© °¤¬§¨±«¤¬µ·µ¨¨k Γινγκο βιλοβα ql ≤²·¼¯ §¨²± º¨ µ¨ ¦²±§∏¦·¨§q׫¨
µ¨ ¤¯·¬√¨ √¬¤¥¬¯¬·¼ ²©¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¨ §°¤·¨µ¬¤¯¶º¤¶ ©¨©¨¦·¨§¥¼ ¥²·«²©¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·¤±§©µ¨ ½¨¬±ªµ¤·¨qŒ·º¤¶¤¯¶²¬°³²µ·¤±··²
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¦²±¦¨±·µ¤·¬²±²©¶²µ¥¬·²¯ ²µ°¤±±¬·²¯ ©²µ·º² §¤¼¶2º¬·«·«¨ ¦²°¥¬±¤·¬√¨ ¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±·ts h ⁄¬°¨ ·«¼¯ ¶∏¯©²¬¬§¨ k⁄≥’l n
s qx °²¯#pt ¶²µ¥¬·²¯2¶¯²º ©µ¨ ½¨¬±ª¤·t ε #°¬±pt2°¤¬±·¤¬±¬±ª©²µts °¬± ¤·p tx ε ¤±§©²µvs °¬± ¤·p vx ε 2§¬µ¨¦·¯¼
³¯∏±ª¬±ª¬±·²‘2¶·²µ¨§©²µt §¤¼2µ¤³¬§¯¼·«¤º¬±ª¤·ws ε º¤·¨µq׫¨ µ¨ ¤¯·¬√¨ √¬¤¥¬¯¬·¼k××≤ √¤¯∏¨l º¤¶¥¨¼²±§ys h q׫¨
µ¨¦²√¨ µ¼ ªµ²º·«²© °¤·¨µ¬¤¯¶¶·²µ¨§¤·∏¯·µ¤2·¨°³¨µ¤·∏µ¨ º¤¶²¥¶¨µ√¨ §q
Κεψ ωορδσ} ¤¬§¨±«¤¬µ·µ¨¨o≤²·¼¯ §¨²±o≤¤¯ ∏¯¶o≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±
银杏原产我国 o是当今地球上最为古老的植物之一 o为我国二级保护植物 ∀其种仁和叶具有极高的
药用价值 ∀它是目前经济价值最高 !效益最好的经济树种和首选的庭园绿化树种 o在学术上也有很高的
研究价值 ∀因此 o开展银杏种质资源保存具有极为重要的现实意义 ∀一些银杏产区已营建了银杏种质
资源圃k郭善基 ot||vl o但这种保存方法占地面积大 o花工多 o且易受各种自然灾害的侵袭而失去要保存
材料的危险 ∀
超低温保存是在现代生物技术和低温生物学基础上发展起来的 ∀自 t|zv年 ‘¤ª和 ≥·µ¨ ·¨首次报道
在液氮中成功地保存了胡萝卜细胞后 o植物种质超低温保存技术因其不仅能长期保持细胞生物学特征 o
而且还具有大大减少传统的植物种质资源保存过程中所需的大量人力 !物力 !时间 o并保证材料无病 !
虫 !毒等的侵入 o便于运输等优点 o开始倍受植物界的关注 ∀业已证实 o超低温保存植物种质是可行的
k∂¬¯¯¤¥¯²¥²¶ ετ αλqot||x ~徐刚标 ousssl ∀但在乔木上研究应用不多k徐刚标 ousssl ∀本文首次对我国特
有 !珍贵的多用途经济树种银杏开展这方面研究 o旨在为银杏种质保存开辟一条新途径 o同时也为超低
温技术在树木保存上应用研究提供理论和方法学参考 ∀
t 材料与方法
111 实验材料
用中南林学院经济林研究室选育出的湖南梅核 Œ号银杏类型 o用其成熟胚的子叶诱导出的愈伤组
织为实验材料 ∀
112 实验方法
t qu qt 银杏愈伤组织诱导与继代培养 银杏愈伤组织诱导与继代培养按徐刚标等提供的方法k徐刚标
等 ot|||l ∀诱导培养基为 ≥ n ‘„„u qs °ª#pt n …„u qs °ª#pt n蔗糖 v h o继代培养基为 ≥ n ‘„„u qs
°ª#pt n ×u qs °ª#pt n ∂¦x qs °ª#pt n蔗糖 v h ∀
t qu qu 银杏愈伤组织超低温保存 冰冻保护剂筛选 本实验参考前人研究工作k路铁刚等 ot||x ~孙龙
华等 ot||s ~郑光植等 ot|{v ~殷晓辉等 ot||y ~∞µ¬¦¤ot||w ~¤¬± ετ αλqot||y ~‘²µª¤¤µ§ ετ αλqot||v ~• ¬¨±«²∏§ ετ
αλot||x ~≠¤°¤§¤ ετ αλqot||vl o共设计 {种冰冻保护剂 ∀除二甲基亚砜k⁄≥’l外 o各类冰冻保护剂先溶
于 tΠu≥培养基大量元素培养液中 o于 tsx ε 高温高压灭菌 ts °¬±o无菌条件下加入二甲基亚砜 ∀
冰冻保护剂加入 选择首次继代培养 ut§的银杏愈伤组织kuss °ªl放入有刻度的 ts °试管中 o分
两组实验 ∀一组在室温下加入冰冻保护剂 o另一组在冰浴上加入预冷至 s ε 左右的冰冻保护剂 o处理时
间均为 t «∀
预培养 将愈伤组织接种在含蔗糖 !山梨醇 !脯氨酸 !甘露醇 !海藻糖等高渗物质的继代培养基上 o
预培养 u §∀
预处理 在冷库kw ε l里预处理 wx °¬± ∗ t «∀
化冻 !洗涤及细胞存活力测定 细胞活力测定参考文献介绍的方法k∞µ¬¦¤ot||wl ∀称取银杏愈伤组
织 uss °ªo加入 x °××≤试剂 o在 uu ε ∗ ux ε o黑暗中静置 t{ ∗ us «o倒去 ××≤液 o蒸馏水洗涤 u ∗ v次 o
然后加入 x °|x h的乙醇 oys ε 水浴中处理 ux °¬±o用 zxt分光光度计在 w{x ±°波长处测试提取液的
吸收值k××≤值l相对值 o并用其表示细胞活力 ∀
细胞活力 €处理后细胞 ××≤值未处理细胞 ××≤值 ≅ tss h
再培养 化冻洗涤后的愈伤组织 o立即接种到继代培养基中 o于 uw ε 暗培养 ∀
u 结果与分析
211 冻保护剂毒性
本项研究试验共选用 {种冰冻保护剂 o分别在室温和冰浴上加入 ∀结果表明 o在室温下加入各冰冻
保护剂都在不同程度上对银杏愈伤组织具有毒害作用 o而在冰浴上加入 o各冰冻保护剂对细胞毒性大大
地缓轻 o甚至没有表现出与对照之间 ××≤值差异 ∀两种处理方法都表现出复合冰冻保护剂比单一冰冻
保护剂对细胞毒性小 o其中室温下处理更为明显 ∀在同一处理方法 o同一冰冻保护剂不同重复间 ××≤
值也有较大的差异 ∀我们认为 o这可能与银杏愈伤组织本身的生理活性异质性有关 ∀表 t是 v次重复
试验的平均值 ∀
表 1 不同冰冻保护剂及其处理对银杏愈伤组织活性影响
Ταβ .1 Εφφεχτσ οφ διφφερεντ χρψοπροτεχταντσ ανδ τρεατµεντσ ον τηε ϖιγορ οφ χαλλυσ
冻保护剂
≤µ¼²³µ²·¨¦·¤±·
冰浴 Œ¦¨ º¤·¨µ
××≤值 ××≤ √¤¯∏¨ 活性 ∂¬ª²µk h l
室温 „°¥¬¨±··¨°³¨µ¤·∏µ¨
××≤值 ××≤ √¤¯∏¨ 活性 ∂¬ª²µk h l
ts h甲基亚砜 n s qx°²¯#pt山梨醇
ts h ⁄¬°¨ ·«¼¯ ts h ¶∏¯©²¬¬§¨ k⁄≥’l n s qx°²¯#pt ¶²µ¥¬·²¯
t q{s || qw t qyt {| qy
ts h甲基亚砜 n ts h蔗糖 ts h ⁄≥’ n ts h ¶∏¦µ²¶¨ t qzz |z q{ t qxy {{ qt
ts h甲基亚砜 n ts h甘油 ts h ⁄≥’ n ts h ª¯∏¦¨µ²¯ t qy| |v qw t qxs {u qv
tv 第 v期 徐刚标等 }银杏愈伤组织超低温保存的研究
冻保护剂
≤µ¼²³µ²·¨¦·¤±·
冰浴 Œ¦¨ º¤·¨µ
××≤值 ××≤ √¤¯∏¨ 活性 ∂¬ª²µk h l
室温 „°¥¬¨±··¨°³¨µ¤·∏µ¨
××≤值 ××≤ √¤¯∏¨ 活性 ∂¬ª²µk h l
ts h甲基亚砜 n { h葡萄糖 ts h ⁄≥’ n { h ª¯∏¦²¶¨ t qzs |v q| t qw| {v qs
ts h甲基亚砜 n { h水解乳蛋白 ts h ⁄≥’ n { h ‹ t qzy |z qu t qyt {| qw
ts h甲基亚砜 n ts h甘油 n x h蔗糖
ts h ⁄≥’ n ts h ª¯∏¦¨µ²¯ n ts h ¶∏¦µ²¶¨ t qz| |{ q{ t qwz {t qz
ts h甲基亚砜 n { h葡萄糖 n ts h聚乙二醇
ts h ⁄≥’ n { h ª¯∏¦²¶¨ n ts h °²¯¼¨ ·«¯ ±¨¨ ª¯¼¦²¯k°∞Šl t q{t tss t qxs {v qv
x h甲基亚砜 x h ⁄≥’ t qyw |s qy t qvs zy qt
对照 ≤Ž t q{t tss t q{s tss
212 冰冻保护剂对银杏愈伤组织保存效果的影响
以 t ε #°¬±pt的降温速度从 w ε 降温 o在 p tx ε 和 p vx ε 分别停留 ts °¬±和 vs °¬±后 o投入液氮
中 ∀贮藏 t §后取出 o在 ws ε 水浴中快速化冻 o室温下用洗涤液洗涤 u次 o然后测试 ××≤ 值 o结果见表
u ∀从表 u中可看到 ts h二甲基亚砜 n { h水解乳蛋白及 ts h二甲基亚砜 n s qx °²¯#pt山梨醇保存效
果最好 o平均相对存活率分别为 wx q{ h和 wy qw h ~ts h二甲基亚砜 n ts h蔗糖 !ts h二甲基亚砜 n
{ h葡萄糖 n ts h聚乙二醇及 ts h的二甲基亚砜 n { h的葡萄糖次之 o平均存活率分别为 vz qx h !
vw q{ h !vx qx h ~而含甘油的 v种保护剂效果最差 ∀
表 2 不同冰冻保护剂对银杏愈伤组织冰存后活性影响
Ταβ .2 Εφφεχτσ οφ χρψοπροτεχταντσ ον τηεσυρϖιϖαλοφ µαινδενηαιρ τρεε χαλλυσστορεδ ιν ΛΝ φορ λ δαψ
冰冻保护剂 ≤µ¼²³µ²·¨¦·¤±· ××≤值 ××≤ √¤¯∏¨ 存活率 ¶∏µ√¬√¤¯k h l
ts h甲基亚砜 n s qx°²¯#pt山梨醇
ts h ⁄≥’ n s qx°²¯#pt¶²µ¥¬·²¯ s q{| wy qw
ts h甲基亚砜 n { h水解乳蛋白
ts h ⁄≥’ n { h ‹ s q{z wx q{
ts h甲基亚砜 n ts h蔗糖
ts h ⁄≥’ n ts h ¶∏¦µ²¶¨ s qzu vz qx
ts h甲基亚砜 n { h葡萄糖
ts h ⁄≥’ n { h ª¯∏¦²¶¨ s qyz vx qx
ts h甲基亚砜 n { h葡萄糖 n ts h聚乙二醇
ts h ⁄≥’ n { h ª¯∏¦²¶¨ n ts h °∞Š s qyy vw q{
ts h甲基亚砜 n ts h甘油
ts h ⁄≥’ n ts h ª¯∏¦¨µ²¯ s qvy t{ q{
ts h甲基亚砜 n ts h甘油 n x h蔗糖
ts h ⁄≥’ n ts h ª¯∏¦¨µ²¯ n ts h ¶∏¦µ²¶¨ s qws us q|
将冰冻后的愈伤组织接种到新鲜的继代培养基上 o除了 ts h二甲基亚砜 n { h水解乳蛋白处理的
材料变褐外 o其它材料均能生长 o但生长速度十分缓慢 ∀由于样品数量少 o未定期测量鲜重生长量 ∀
213 预培养对银杏愈伤组织保存效果影响
将愈伤组织继代在含山梨醇 !脯氨酸 !甘露醇 !海藻糖等高渗物质的 ≥培养基上预培养 u §后 o在
冰浴上加入 ts h二甲基亚砜 n s qx °²¯#pt山梨醇 o在冰浴上保持 wx °¬±o然后以 t ε #°¬±pt的降温速度
从 w ε 降至 p tx ε !停留 ts °¬±o仍以 t ε #°¬±pt速度降到 p vx ε o停留 vs °¬±o最后投入液氮 ∀t§后取
出 ows ε 化冻洗涤 o测定 ××≤值 ∀结果发现k表 vl o在含高浓度甘露醇 !山梨醇的 ≥培养基上预培养 u§
的银杏愈伤组织超低温保存后的 ××≤值得到提高 o而海藻糖 !脯氨酸预培养处理效果次之 o蔗糖似乎效
果不明显 ∀这表明 o预培养处理可提高分裂相细胞的比例和减少细胞内自由水含量 o增强了愈伤组织细
胞抗寒能力 ∀关于不同高渗物质处理造成冰存后细胞的 ××≤ 值差异 o是由于材料本身特性 o还是由于
重复次数太少k仅重复 v次l o有待进一步研究 ∀
uv 林 业 科 学 vz卷
表 3 预培养处理对银杏愈伤组织保存效果影响
Ταβ .3 Εφφεχτ οφ πρε− χυλτυρινγ ον συρϖιϖαλ οφ Μαιδενηαιρ τρεε χαλλυσστορεδ φορ 1 δαψιν ΛΝ
化合物 ≤°³²∏±§ 浓度 ≤²±¦¨±·µ¤·¬²±k°²¯#ptl ××≤ 值 ××≤ √¤¯∏¨ 存活率 ≥∏µ√¬√¤¯ k h l
山梨醇 s qzx s q|y ys qw
≥²µ¥¬·²¯ t qss s q|{ ? s qts yt q|
甘露醇
¤±±¬·²¯
s qzx
t qss
s q|z ? s qts
s q|{ ? s qtt
yt qt
yt qz
脯氨酸
°µ²¯¬±¨
s qzx
t qss
s q{| ? s qs|
s q|s ? s qs{
xy qs
xy qw
海藻糖
×µ¨«¤¯²¶¨
s qzx
t qss
s q{{ ? s qts
s q{| ? s qs|
xx qw
xy qs
蔗糖
≥∏µ¦²¶¨
s qzx
t qss
s qzy ? s qs|
s qzw ? s qts
wz qu
wz qs
对照 ≤Ž s qzz ? s qtt w{ qx
214 降温处理
图 t 冰冻方法对银杏愈伤组织冰存效果的影响
ƒ¬ªqt ∞©©¨¦·²©©µ¨ ½¨¬±ª ° ·¨«²§¶²±·«¨ ××≤ √¤¯∏¨ ²©·«¨ ¦¤¯ ∏¯¶¶·²µ¨§¬± ‘©²µt §¤¼
τ 预培养 °µ¨2¦¯∏·∏µ¨ ~υ未预培养 ‘²·³µ¨2¦∏¯·∏µ¨ q
3 ´ qw ε t ε #°¬±
pt
p ws ε ) ) ) ‘~ µ qw ε t ε #°¬±
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p ws ε oys°¬± ) ) ) ‘~ ¶ qw ε t ε #°¬±
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p tx ε ots°¬± t ε #°¬±
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p tx ε ots°¬± u ε #°¬±
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p vx ε ovs°¬± ) ) ) ‘~∏ w ε s qx ε #°¬±
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p tx ε ots°¬± s qx ε #°¬±
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p vx ε ovs°¬± ) ) ) ‘~ √ w ε s qv ε #°¬±
pt
p tx ε ots°¬±t ε #°¬±
pt
p vx ε ovs°¬± ) ) ) ‘~º w ε ) ) ) ‘
3 3 取各冰冻保护剂 ××≤值的平均值 ׫¨ °¨ ¤± ××≤ √¤¯∏¨ ²©§¬©©¨µ¨±·¦µ¼²³µ²·¨¦·¤±··µ¨¤·¬±ª °¤·¨µ¬¤¯¶¤©·¨µ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±
本研究实验共设计了 z种降温程序 o研究结果见图 t ∀程序 ¶和 ∏是一种较理想的冰冻方式 o即以
t ε #°¬±pt或 s qx ε #°¬±ptu种速度降温 o在 p tx ε 停留 ts °¬±op vx ε 停留 vs °¬±后 o再投入液氮中保
存 ∀这两种程序对银杏愈伤组织而言 o不管其是否经过预培养处理 o在其它条件相同的情况下 o冻存后
的存活率都是最高的 ∀经程序 ¶降温 o预培养处理和未经预培养的银杏愈伤组织冻后平均相对存活率
分别为 xu h和 v| h ~经程序 ∏降温 o预培养处理和未经预培养的愈伤组织冰存后平均相对存活率分别
为 xs h和 vu h ∀降温速度过大或过小 o均不利于保存后的愈伤组织存活 o平均相对存活率分别在 tu h
∗ wt h k预培养l和 | h ∗ uv h k未预培养l之间 ∀这说明 o银杏愈伤组织超低温保存的最适宜降温速度
为 s qx ∗ t qs ε #°¬±pt ∀这可能是在此降温速度下 o银杏愈伤细胞达到了良好脱水状态 o既避免了快速
降温时细胞来不及脱水而形成细胞内冰晶 o又防止了由于降温速度过小导致细胞内溶质浓度过高 !时间
过长引起的/溶液效应0 ∀
vv 第 v期 徐刚标等 }银杏愈伤组织超低温保存的研究
v 讨论
许多植物组织和细胞超低温保存过程中 o常常需要加入冰冻保护剂 ∀作为冰冻保护剂应具有高溶
解度及对细胞低毒性 o化冻后易从组织 !细胞中清洗掉 o其中二甲基亚砜和糖醇类物质是首选保护剂k殷
晓辉等 ot||y ~∞µ¬¦¤ot||wl ∀本项研究证实了前人的研究结论 ∀同时还表明 o复合冰冻保护剂比单一的
冰冻保护剂对银杏愈伤组织 !细胞毒性小 o在冰冻保存过程中对细胞的保护效果好 ∀这可能是 o二甲基
亚砜属于渗透性保护剂 o而糖醇类物质属非渗透性保护剂 o它们具有相同的保护效应而各自产生的毒性
机理不同 ∀因此 o混合使用时 o保护效应增加而毒性反而降低 o甚至相互抵消 ∀
银杏愈伤组织超低温试验之前 o在高渗透压的培养基上预培养处理显得较为重要 o但不同高渗化合
物对银杏愈伤组织抗寒能力的提高程度不一样 o其中 o以在含有山梨醇 !甘露醇的 ≥培养基上预培养
的愈伤组织超低温保存效果最好 ∀这和某些培养物超低温保存预培养要求基本一致k‘²µª¤¤µ§ ετ αλqo
t||v ~• ¬¨±«²∏§ ετ αλqot||x ~≠¤°¤§¤ ετ αλqot||v ~∂¬¯¯ ¤¯²¥²¶ ετ αλqot||xl ∀
一些研究认为k路铁刚等 ot||x ~孙龙华等 ot||s ~殷晓辉等 ot||y ~郑光植等 ot|{vl o慢冻材料降温至
某一温度停留一段时间是必要的 ∀本次研究实验也表明 op ts ε 和 p vx ε 处停留一段时间明显地提高
冰存后银杏愈伤组织的相对存活率 ∀这可能是 o中间停留有利于细胞外冰晶形成和生长 o使细胞达到保
护性脱水 o以防止细胞在下一步降温过程中因细胞内水来不及排出而结冰 o从而导致细胞膜结构不可逆
性损伤 ∀
相对而言 o本次研究实验中银杏愈伤组织保存后的存活率比有关报导的结果要低一些 ∀我们认为
有两方面原因 }一是由材料本身的生理 !遗传特征决定 ~二是与银杏愈伤组织细胞类型不一致有关 ∀光
学显微镜下可观察到银杏愈伤组织细胞有球形 !长圆形和长条形等几种类型 o不同类型细胞的大小及内
含物 !液泡都不一样 o因此 o抗冻能力及所需的最适宜降温速度可能也不一样 o保存后的材料可能仅是其
中部分液泡小的细胞存活 ∀
参 考 文 献
郭善基主编 q中国果树志#银杏卷 q北京 }中国林业出版社 ot||v otss ∗ tsu
路铁刚 o王安兴 o孙敬三 q红豆草组织培养物的超低温保存及恢复后的某些特性 q北京 }植物学集刊 ot||x oz }tx{ ∗ tyv
孙龙华 o简令成 q红豆草悬浮细胞的超低温保存及其超微结构观察 q植物学报 ot||s ovukvl }uyu ∗ uyz
徐刚标 o何 方 o陈良昌 q银杏愈伤组织诱导与继代培养的研究 q中南林学院学报 ot||| ot|kvl }vu ∗ vy
徐刚标 q植物种质离体保存研究 q中南林学院学报 ousss ouskwl }{t ∗ {z
殷晓辉 o郑从义 q野生稻愈伤组织的超低温长期保存和冻后再生植株形成 q武汉植物学研究 ot||y otwkvl }uwz ∗ uxu
郑光植 o何静波 o王世林 q三分三愈伤组织及其悬浮培养细胞的冰冻贮藏 q植物学报 ot|{v ouxkuyl }xtu ∗ xt{
∞µ¬¦¤ ∞ …¨ ∏¶²±q≤µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±o¬± °¯ ¤±·≤¨¯¯ ≤∏¯·∏µ¨ o¤°µ¤¦·¬¦¤¯ „³³µ²¤¦«k⁄¬¬²± Žq¤±§ • q„ qŠ½¤½¤¯ ¶¨ §¨¶u±§l q’¬©²µ§}’¬©²µ§˜±¬√¨ µ¶¬·¼ °µ¨¶¶q
t||w otwz ∗ tyy
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t||y otxk|l }ztu ∗ ztz
‘²µª¤¤µ§qo…¤¯§∏µ¶¶²± ∂ ≥ ¤±§Žµ²ª¶·µ∏³° qŠ¨ ±²·¼³¬¦§¬©©¨µ¨±¦¨¶¬±·«¨ ¤¥¬¯¬·¼ ²© °¨¥µ¼²ª¨ ±¬¦ Αβιεσ νορδµαννιανα ¦∏¯·∏µ¨¶¬± ¶∏µ√¬√¨ ¦µ¼²³µ¨ p ¶¨µ√¤2
·¬²±q≥¬¯√¤¨ ) Š¨ ±¨ ·qt||v owukul }|v ∗ |z
• ¬¨±«²∏§° ετ αλq∂¬·µ©¬¦¤·¬²±¤±§«¨¤·) ¶«²¦®·µ¨¤·° ±¨·¬°³µ²√¨ ¦µ¼²³µ¨¶¨µ√¤·¬²±²©·²¥¤¦¦²¦¨¯¯ ¶∏¶³¨ ±¶¬²±¶¦²°³¤µ¨§·²·º²p ¶·¨³©µ¨ ½¨¬±ªq°¯¤±·≤¨¯¯o
׬¶¶∏¨ ¤±§ ’µª¤± ≤∏¯·∏µ¨ qt||x owukvl }uyt ∗ uyz
∂¬¯¯ ¤¯²¥²¶∂  ¤±§∞±ª¨¯°¤± ƒ qΕξ σιτυ ¦²±¶¨µ√¤·¬²± ²©³¯¤±·ª¨µ°³¯¶° ∏¶¬±ª¥¬²·¨¦«±²¯²ª¼ q…¬²·¨¦«²¯ qt||x ottkwl }vzx ∗ v{u
≠¤°¤§¤ × ετ αλq°¯ ¤±·µ¨ª¨ ±¨ µ¤·¬²±²©° µ¨¬¶·¨°¤·¬¦¦¤¯ ∏¯¶²©º«¬·¨ ¦¯²√¨ µk Τριλλιυµ ρεπενσqΛql ¦²²¯ §¨·² p t|y §¨ªµ¨¨≤ ¥¼ √¬·µ¬©¬¦¤·¬²±q∞∏³«¼¬¦¤qt||v o
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wv 林 业 科 学 vz卷