全 文 ：园艺学报，2016，43 (5)：957–965.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0831；http：//www. ahs. ac. cn 957
收稿日期：2016–02–01；修回日期：2016–04–29
基金项目：福建省科技重大专项（2012NZ0002）；花卉育种科技创新团队项目（CXTD-2-17）；福建省自然科学基金项目（2014J01113）；
福建农业科学院导师制青年人才创新基金项目（2014QB-17）；福建农业科学院作物研究所青年开放基金项目（2015QN-6）；福建省省属公
益类科研院所专项项目（2015R1026-2）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：huangml618@163.com）
鹤望兰 ζ–胡萝卜素脱氢酶基因 SrZDS 的克隆
及表达分析
樊荣辉，黄敏玲*，钟淮钦，林 兵
（福建省农业科学院作物研究所，福建省农业科学院花卉研究中心，福建省特色花卉工程技术研究中心，福州
350013）
摘 要：采用 RT-PCR 和 RACE 方法从鹤望兰（Strelitzia reginae Banks）黄色花萼中克隆到 1 个 ζ–
胡萝卜素脱氢酶基因（SrZDS）。其 cDNA 全长 2 111 bp（GenBank 收录号：KT428724），具有完整的开放
阅读框，共 1 710 个碱基。与其他物种的氨基酸序列都有一定的同源性，其中与玉米的 ZDS 同源性最高，
达到 86%。系统进化树分析显示，SrZDS 与水仙蛋白亲缘关系较近。荧光定量 PCR 分析表明：SrZDS 在
鹤望兰黄色花萼中高表达，且在花发育的始花期和盛花期表达量最高。应用 UPLC 对其类胡萝卜素含量
进行分析，其总量在黄色花萼中最高，且在盛花期最高，表明 SrZDS 的表达与类胡萝卜素含量成正相关。
关键词：鹤望兰；ζ–胡萝卜素脱氢酶；类胡萝卜素生物合成；基因克隆；UPLC
中图分类号：S 682 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）05-0957-09

Cloning and Analysis of ζ-carotene Desatura in Strelitzia reginae
FAN Rong-hui，HUANG Min-ling*，ZHONG Huai-qin，and LIN Bing
（Institute of Crop Sciences，Fujian Academy of Agricultural Science，Flowers Research Center，Fujian Academy of
Agricultural Science，Fujian Engineering Research Center for Characteristic Floriculture，Fuzhou 350013，China）
Abstract：In the study，the full-length cDNA sequence of ZDS gene（SrZDS）was cloned from yellow
sepals of Strelitzia reginae using RT-PCR and RACE techniques. The cDNA sequence was 2 111 bp and
included a whole open reading frame of 1 710 bp. The amino acid was highly conserved compared with
other ZDS homologues and shared up to 86% homology with ZDS from Zea mays. Phylogenetic analysis
indicated that SrZDS was more related to ZDS from Narcissus tazetta var. chinensis. The fluorescent
quantitative PCR analysis indicated that SrZDS was highly expressed in early flowering period and
blooming period，the transcript level was the highest in yellow sepals. UPLC analysis indicated that
carotenoid contents has the highest levels in yellow sepals，and has the highest levels in blooming period.
These results suggested that the changes in genes expression related to carotenoid contents.
Key words：Strelitzia reginae；ζ-carotene desatura；carotenoid biosynthesis；gene cloning；
UPLC

Fan Rong-hui，Huang Min-ling，Zhong Huai-qin，Lin Bing.
Cloning and analysis of ζ-carotene desatura in Strelitzia reginae.
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鹤望兰（Strelitzia reginae Banks）又称天堂鸟，为旅人蕉科（Strelitziaceae）鹤望兰属（Strelitzia）
多年生观赏植物，原产南非。因其姿态奇特，花期长久，成为高档的切花材料。
类胡萝卜素（caroteniod）是通过异戊二烯途径合成而呈现黄色、橙色或红色的一类化合物（王
玉萍 等，2006；Ohmiya，2011）。研究表明，水仙、文心兰、百合、鸢尾等花卉的橙黄色花主要由
类胡萝卜素生物合成途径控制（Valadon & Mummery，1968；Ootani & Hayashi，1982；Chiou et al.，
2010；Yamagishi et al.，2010）。胡萝卜素脱氢酶（ζ-carotene desatura，ZDS）是植物类胡萝卜素生
物合成过程中去饱和的重要酶之一，催化ζ–胡萝卜素转化成链孢红素，进而转化成番茄红素（李
永平 等，2010）。在黄花龙胆、金盏菊等以类胡萝卜素为主要色素种类的植物中，该基因与八氢番
茄红素合成酶基因（PSY）、八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）等协调作用，在转录水平上调节花中
类胡萝卜素的积累（Kato et al.，2004）。
Tinoi 等（2006）报道，与鹤望兰同属于姜目（Zingiberales）的美人蕉黄色花的主要发色团为类
胡萝卜素，但在鹤望兰中未见相关报道。本研究中克隆了 SrZDS 基因全长，利用 RT-PCR 对 SrZDS
的表达进行了分析，并应用 UPLC 对黄色花萼的类胡萝卜素含量进行测定，为研究 SrZDS 分子调控
机制奠定基础，对揭示 SrZDS 基因在鹤望兰花色形成中的作用具有重要理论意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
以福建省农业科学院花卉研究中心种质资源圃栽培的鹤望兰（Strelitzia reginae Banks）为供试
材料，试验在福建省农业科学院观赏园艺创新团队实验室完成。不同组织（蓝色花瓣、黄色花萼、
叶、茎、根）及各发育时期的花萼（花蕾前期、花蕾中期、花蕾后期、始花期、盛花期、末花期）
均采自 8 年龄的鹤望兰（2015 年 3 月采集），用于表达分析研究。花瓣及各发育时期的花萼均采自
花序中的第 1 朵小花，叶片应用刚萌发的幼嫩叶片，根和茎均采自根茎交接部位，采摘后立即液
氮速冻，–80 ℃条件下保存。
1.2 RNA 提取及 cDNA 合成
取上述存放于–80 ℃冰箱中的样品，按通用植物总 RNA 快速提取试剂盒说明书（百泰克生物
技术有限公司）分别提取总 RNA，用琼脂糖凝胶电泳和分光光度计检测 RNA 的完整性。使用 M-MLV
反转录酶进行逆转录，按照 TaKaRa 公司产品说明书操作。
1.3 SrZDS 基因序列的克隆
根据 GenBank 上发表的百合（Lilium lancifolium）、水仙（Narcissus tazetta）、文心兰（Oncidium
Gower Ramsey）、小麦（Triticum aestivum）、龙胆（Gentiana lutea）的 ZDS 保守氨基酸序列和核
苷酸序列，通过 Primer Premier 5 软件设计简并引物 ZDS-F 和 ZDS-R（表 1），以 cDNA 为模板进
行 PCR 扩增。PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 个循环；
72 ℃ 10 min。PCR 产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的片段并连接到载体 pMD18-T（大
连宝生物工程有限公司），转化大肠杆菌 DH5α（本实验室保存），通过蓝白斑筛选及 PCR 扩增鉴
定阳性克隆后进行测序（上海生工生物工程服务有限公司），得到 SrZDS 中间片段。
以 AP 为引物，用 PrimeScript 逆转录酶（TaKaRa），按逆转录酶说明书合成 cDNA 第一链。应
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用通用引物 AUAP 和特异引物 ZDS-3′进行 3′RACE 扩增。
以 AP 为引物逆转录后，对 cDNA 加尾，然后用 PCR 产物纯化试剂盒纯化（TaKaRa）。以加
尾产物 1 μL 为模板，用包含多聚 dC 尾巴序列的 AAP 引物和 5′RACE 特异引物 ZDS-5′-1 进行第 1
轮扩增。以稀释 10 倍的第 1 轮 PCR 产物 1 μL 为模板，用巢式基因特异引物 AUAP 和 5′RACE 特异
引物 ZDS-5′-2 继续进行第 2 轮扩增。
根据获得的 SrZDS 基因 cDNA 全长，设计 ORF 引物 SrZDS-F 和 SrZDS-R，进行 ZDS cDNA ORF
克隆，验证已获得的序列。

表 1 鹤望兰 SrZDS 基因克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to isolate and analyze the expression of SrZDS gene in Strelitzia reginae
作用
Function
引物名称
Primer name
引物序列
Primer sequence
逆转录引物 Reverse transcription primer AP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（T）17-3′
AAP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC（G）8-3′ 锚定引物 Anchored primer
AUAP 5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3′
ZDS-F 5′-TATGATAAAGC（A/G）AG（G/A）AATGC-3′ 扩增保守片段 For the conserved fragment
ZDS-R 5′-CCTTCCAT（A/G）CTGTC（T/A）ATGTA-3′
ZDS-3′-1 5′-GTACAACGGCTGGGTTACAGAGC-3′ 3′RACE
ZDS-3′-2 5′-TGGAGAGATCAAGGCAACTGAGA-3′
ZDS-5′-1 5′-ACATCAGGAGAGCCCTTCAACA-3′ 5′RACE
ZDS-5′-2 5′-GCAACAGGATCCCACATTCTCT-3′
SrZDS-F 5′-ATGGCTTCCGCTTGTATTCCTG-3′ ORF 扩增 For the cDNA of ORF
SrZDS-R 5′-TCAAACAAGGCTGAATTCTTCG-3′
P1 5′-TGCCCTTGGATTTATTGACT-3′ 检测 SrZDS 的表达 For the expression of SrZDS
P2 5′-TCGCCATCTGGTGATTTCTC-3′
18S-F 5′-CTGAGAAACGGCTACCACAT-3′ 扩增内标 For the internal control
18S-R 5′-ACCCAAGGTCCAACTACGAG-3′
1.4 生物信息学分析
用 NCBI 的 ORF Finder，对 SrZDS 的 cDNA 序列开放阅读框进行查找；利用 NCBI 网站的 BLAST
程序搜索相似性序列。通过 BioXM 预测该蛋白质的分子量和等电点。使用 ClustalX 1.81 软件进行
多重序列比对；采用 MEGA 4.0 构建系统进化树。采用 SOMPA（http：//www.expasy.org/tools）和
SWISS-MODEL 在线软件（http：//swissmodel. expasy.org/interactive）分别对 SrZDS 基因编码的蛋白
进行二级结构分析与 3D 结构建模。
1.5 实时荧光定量分析
根据 SrZDS 全长序列，设计一对引物 P1 和 P2（表 1），其扩增长度为 225 bp，以鹤望兰表达相
对稳定的 18S rRNA（GenBank accession number AF069229.1）为内参，设计引物 18S-F 和 18S-R，
扩增长度为 250 bp。
按照 Power SYBR Green PCR Master Mix（美国，ABI）说明书在 ABI7500 实时定量 PCR 仪上
进行 PCR 反应。反应体系为：12.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix，1 μL cDNA，正、反向
引物各 0.5 μL（10 μmol · L-1），补蒸馏水至总体积 25 μL。反应程序为：95 ℃预变性 10 min；95 ℃
变性 15 s，56 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，共 40 个循环。反应结束后分析荧光值变化曲线和融
解曲线。
每个反应 3 个重复，采用 ABI7500 分析软件中 Comparative CT（∆∆CT）法分析试验结果。
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1.6 类胡萝卜素提取及含量测定
取 1 g 样品用 50 mL 丙酮︰石油醚（1︰1）浸提剂于 50 ℃，避光浸提 3 h，至残渣发白。用旋转
蒸发仪 40 ℃将浸提液蒸干，用 20 mL 的石油醚（含 0.1%BHT）溶解，加入 20 mL 10% KOH–甲醇
溶液，若有乳化现象，加入 10%NaCl 去乳化。收集上层石油醚相，转至分液漏斗，用双蒸水反复洗
涤石油醚相，至水相为中性，加入 10 g 无水硫酸钠，过滤，经旋转蒸发仪 40 ℃蒸干，用丙酮（含
0.1% BHT）定容至 2 mL。
类胡萝卜素的分离和鉴定采用 ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱（2.1 mm × 50 mm，1.7 μm）
（WATERS，美国），以乙腈︰甲醇 = 9︰1 为流动相，在 450 nm 下测定。
2 结果与分析
2.1 SrZDS 全长 cDNA 克隆及序列分析
根据 ZDS 蛋白保守序列设计一对简并引物 ZDS-F 和 ZDS-R，以鹤望兰黄色花萼 cDNA 为模板
进行 PCR 扩增，得到一条约 1 000 bp 左右的条带（图 1），经回收测序为 1 025 bp。序列经 BLASTp
分析表明，该片段与多种植物的 ZDS 基因具有很高的同源性，初步认定它是鹤望兰 ZDS 基因的片
段。
通过 3′RACE 和 5′RACE 分别得到长度为 711 bp 的 3′末端和 954 bp 的 5′末端（图 1），与中间序
列分别有 403 bp 和 176 bp 的重叠区段，经 BLAST 检索认为它是鹤望兰 ZDS 的 3′端和 5′端序列。
将3′RACE序列、中间序列和5′RACE获得的序列进行比对拼接得到1条长度为2 111 bp的cDNA
全长序列，包含完整的开放阅读框（ORF）1 710 bp，预测的理论等电点为 4.77，分子量为 141.76 kD，
登录号为 KT428724。

图 1 鹤望兰 SrZDS 基因的克隆
Fig. 1 Isolation of SrZDS gene in Strelitzia reginae

SOMPA 软件分析 SrZDS 蛋白的二级结构显示，此蛋白有 α 螺旋（alpha helix，占 35.50%）、
β 转角（beta turn，占 13.53%）、不规则卷曲（random coil，占 29.53%）和延伸链结构（extended strand，
占 21.44%）。

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2.2 SrZDS 编码氨基酸的同源性分析
将 SrZDS 编码的氨基酸序列与 GenBank 上其他植物 ZDS 同源蛋白进行序列比对，结果（图 2）
显示，SrZDS 与其他 ZDS 氨基酸序列具有较高同源性，并有多个保守区域。该序列与玉米
（DAA59952）、水稻（BAC79799）、水仙（AFH53817）、小麦（AEI26314）等序列的同源性分别
达 86%、86%、85%和 83%，并具有吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶结构域（pyridine nucleotide-disulphide
oxidoreductase domain）。


图 2 鹤望兰 SrZDS 氨基酸同源性分析
Zm：玉米；Nt：水仙；Os：水稻；Sr：鹤望兰；Ta：小麦。
Box I 是吡啶二硫酸核苷酸氧化还原酶结构域。
Fig. 2 Homology analysis of SrZDS in Strelitzia reginae
Zm：Zea mays；Nt：Narcissus tazetta var. chinensis；Os：Oryza sativa Japonica Group；Sr：Strelitzia reginae；Ta：Triticum aestivum.
Box I indicates the pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductase domain.

为了分析 SrZDS 与其他 ZDS 同源蛋白的系统进化关系，将其与其他 21 种植物 ZDS 同源蛋白进
行多重序列比对，并用 MEGA 4.0 构建了系统发育树。结果（图 3）显示 SrZDS 与水仙 ZDS 的亲缘
关系最近，其次与百合 ZDS 亲缘关系较近。


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图 3 鹤望兰 SrZDS 与其他植物 21 个 ZDS 蛋白的系统进化分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of ZDS in strelitzia reginae with 21 other plant ZDSs

2.3 SrZDS 的表达分析
以鹤望兰 18S rRNA 为内参，用荧光定量 PCR 技术检测 SrZDS 在鹤望兰花发育阶段及不同组织
中的表达。结果表明，SrZDS 在鹤望兰始花期表达量逐渐增加，到盛花期达到最高（图 4）。在不同
组织中表达分析结果表明，SrZDS 在黄色花萼中表达量最高，其次是叶片，在根、茎、蓝色花瓣中
的表达量均较低（图 5）。
图 4 鹤望兰花发育过程中 SrZDS 的表达 图 5 SrZDS 在鹤望兰不同组织中的表达
Fig. 4 Expression of SrZDS in different growth periods of Fig. 5 Expression of SrZDS in different tissue
flowering from Strelitzia reginae of Strelitzia reginae
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2.4 类胡萝卜素含量分析
应用高效液相色谱（UPLC），对鹤望兰不同花发育时期及不同组织进行类胡萝卜素含量测定，
结果显示，β–胡萝卜素是鹤望兰黄色花萼类胡萝卜素途径的主要色素物质，其次是 β–隐黄质和叶
黄素（图 6）。随着花的发育类胡萝卜素总量逐渐升高，盛花期达到最高（1 151.95 µg · g-1 FW），
末花期含量下降（648.16 µg · g-1 FW），花蕾前期含量最低（2.59 µg · g-1 FW）。 在不同组织中，
黄色花萼的类胡萝卜素总含量最高（1 200.53 µg · g-1 FW），其次是叶片（463.07 µg · g-1 FW），蓝
色花瓣中含量最低（0.18 µg · g-1 FW），只含有少量的 α–胡萝卜素和 β–胡萝卜素（表 2）。

表 2 鹤望兰不同花发育时期及不同组织中类胡萝卜素含量
Table 2 Carotenoid contents in different growth periods of flowering and ZDS in different tissue from Strelitzia reginae
类胡萝卜素含量/（µg · g-1 FW） Carotenoid content 不同时期及组织
Different growth period and tissue 叶黄素
Lutein
β–隐黄质
β-cryptoxanthin
β–胡萝卜素
β-carotene
α–胡萝卜素
α-carotene
类胡萝卜素总量
Total
时期 花蕾前期 Early bud period 2.30 ± 0.62 a 0.31 ± 0.10 a 0.25 ± 0.12 a 未检测到 Not detected 2.59 ± 0.83 a
Period 花蕾中期 Mid-bud period 1.43 ± 0.12 b 4.86 ± 0.31 b 23.99 ± 2.13 b 未检测到 Not detected 30.28 ± 2.23 b
花蕾后期 Late-bud period 1.51 ± 0.14 b 10.56 ± 0.89 b 77.93 ± 5.16 c 未检测到 Not detected 90.00 ± 6.09 c
始花期 Early flowering period 2.53 ± 0.25 a 131.62 ± 16.67 c 496.67 ± 67.85 d 未检测到 Not detected 630.82 ± 70.01 d
盛花期 Blooming period 3.87 ± 0.38 c 322.28 ± 31.53 d 825.80 ± 95.43 e 未检测到 Not detected 1 151.95 ± 123.76 e
末花期 Late flowering period 4.36 ± 0.45 c 179.76 ± 32.12 c 464.04 ± 34.67 d 未检测到 Not detected 648.16 ± 61.62 d
组织 黄色花萼 Yellow sepals 3.95 ± 0.35 a 342.31 ± 21.71 a 854.27 ± 85.36 a 未检测到 Not detected 1 200.53 ± 108.57 a
Tissue 蓝色花瓣 Blue petals 未检测到
Not detected
未检测到
Not detected
0.11 ± 0.10 b 0.07 ± 0.04 a 0.18 ± 0.13 b
根 Root 1.41 ± 0.38 b 1.11 ± 0.15 b 0.33 ± 0.22 b 未检测到 Not detected 2.85 ± 0.56 c
茎 Stem 1.46 ± 0.54 b 1.32 ± 0.34 b 25.97 ± 5.64 c 29.96 ± 5.16 b 58.71 ± 8.47 d
叶片 Leaf 5.15 ± 0.68 c 1.47 ± 0.21 b 265.37 ±31.67d 191.08 ± 35.72 c 463.07 ± 63.28 e


图 6 鹤望兰类胡萝卜素含量的 UPLC 分析
A：类胡萝卜素标准样色谱图；B：鹤望兰黄色花萼中类胡萝卜素提取物色谱图。
Fig. 6 Analysis of carotenoid component and content of Strelitzia reginae with UPLC
A：The UPLC chromatogram of carotenoids standards；
B：The UPLC chromatogram of carotenoids extracted from yellow petals in Strelitzia reginae.
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3 讨论
本试验中采用 RACE 方法，获得鹤望兰 ZDS 基因全长序列，共 2 111 bp，开放阅读框 1 710 bp。
多重比对结果表明，SrZDS 编码的氨基酸与玉米（DAA59952）、水稻（BAC79799）、水仙（AFH53817）
的 ZDS 蛋白均具有较高同源性，分别达 86%、86%和 85%。分子系统进化分析显示，SrZDS 同其他
植物的 ZDS 具有较高的同源性，其中与水仙聚为一支，亲缘关系最近。
ZDS 参与线状类胡萝卜素生物合成，是类胡萝卜素合成途径中的限速酶之一。开花期龙胆的
ZDS 基因只在花和叶片中表达，且全开的花中表达量最高（Zhu et al.，2002），因此它的转录控制
着龙胆花中类胡萝卜素的积累。中国水仙中的 ZDS1 基因的表达模式与龙胆 ZDS 的基本一致（陈段
芬 等，2009）。文心兰的 ZDS 基因在花发育的整个过程都有表达，在盛花期表达量最高（Chiou et
al.，2010）。本试验通过荧光定量 RT-PCR 的方法对 SrZDS 在鹤望兰不同组织表达情况进行分析发
现，鹤望兰 SrZDS 在黄色花萼中表达量最高，在蓝色花瓣和根中表达量很低，推测 SrZDS 的表达与
黄色花的形成有关，蓝色花的形成受其它途径控制。对鹤望兰花发育过程中的表达情况进行分析发
现，SrZDS 在始花期表达增加，到盛花期表达量最高，末花期减弱，说明 SrZDS 在鹤望兰黄色花萼
发育过程中起着重要作用。
ZDS 基因是类胡萝卜素生物合成途径中的上游基因，它催化 ζ–胡萝卜素转化成链孢红素，进
而转化成番茄红素，然后再分化成两条途径，进而形成 α–胡萝卜素、叶黄素和 β–胡萝卜素、β–
隐黄质等发色团。研究表明，上游基因的表达对类胡萝卜素的积累起重要作用。在红萝卜中，ZDS
基因的高表达与番茄红素的含量成正相关（Clotault et al.，2008）。在柑橘中，PDS 的表达直接控
制 β–胡萝卜素的积累（Fanciullino et al.，2008）。鹤望兰 SrZDS 及 SrPDS 在花发育不同时期及不
同组织中的表达与类胡萝卜素的积累成正相关（黄敏玲和樊荣辉，2013），说明在鹤望兰中，SrZDS
及 SrPDS 的表达对类胡萝卜素的积累起重要作用。在文心兰中，黄色花的形成受类胡萝卜素途径控
制，红色花的形成受类黄酮途径控制（Chiou & Yeh，2008；Chiou et al.，2010）。结果表明，在鹤
望兰中可能有相同的表达模式，这种表达模式的形成，可能与上游调控基因有关。
植物类胡萝卜素是许多花和果实中的主要色素，对园艺植物的观赏性起着重要的作用。目前已
从文心兰（Chiou et al.，2010），草莓（李永平 等，2010）、番木瓜（高新征 等，2009）、小麦
（丛玲 等，2009）和中国水仙（陈段芬 等，2009）等中分离出 ZDS。本试验成功地分离了鹤望兰
SrZDS 基因，并对其组织表达特异性进行了分析，为进一步研究 SrZDS 的功能及其在鹤望兰黄色花
形成中的作用及调控机制奠定了基础。

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