全 文 ：园艺学报，2016，43 (1)：89–99.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0584；http：//www. ahs. ac. cn 89
江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染
的分子检测
吴淑华 1，李廷芳 1，赵文浩 1，程兆榜 1，郭青云 4，赵统敏 2，余文贵 2，
朱叶芹 3,*，季英华 1,*
（1 江苏省农业科学院植物保护研究所，江苏省食品质量安全重点实验室—省部共建国家重点实验室培养基地，南京
210014；2 江苏省农业科学院蔬菜研究所，南京 210014；3江苏省植物保护站，南京 210036；4青海省农林科学院植
物保护研究所，西宁 810016）
摘 要：2014 年对江苏地区的番茄黄化曲叶病进行调查时发现，采自南京温室大棚的 17 份表现矮化，
上部叶片上卷、变小、叶缘黄化，下部叶片脉间褪绿、上卷、变厚症状的番茄病株样本中除了感染烟粉
虱传双生病毒外，还有一种长线形病毒，序列分析结果显示烟粉虱传双生病毒为番茄黄化曲叶病毒（Tomato
yellow leaf curl virus，TYLCV），长线形病毒为番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）。同时还对
发病棚室中采集的烟粉虱进行了两种病毒的检测，结果两种病毒在烟粉虱体内都有检测到。
关键词：番茄黄化曲叶病毒；番茄褪绿病毒；复合侵染；分子检测
中图分类号：S 641.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0089-11

Molecular Identification on Mixed Infection of Tomato yellow leaf curl virus
and Tomato chlorosis virus on Tomato in Jiangsu Province
WU Shu-hua1，LI Ting-fang1，ZHAO Wen-hao1，CHENG Zhao-bang1，GUO Qing-yun4，ZHAO
Tong-min2，YU Wen-gui2，ZHU Ye-qin3,*，and JI Ying-hua1,*
（1Institute of Plant Protection，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu
Province – State Key Laboratory Breeding Base，Nanjing 210014，China；2Institute of Vegetable Crops，Jiangsu Academy of
Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China；3Jiangsu Station of Plant Protection，Nanjing 210036，China；4Institute of
Plant Protection，Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Xining 810016，China）
Abstract：In 2014，a routine survey of tomato yellow leaf curl disease in Jiangsu Province was carried
out. Besides whitefly-transmitted geminiviruses，a whitefly-transmitted crinivirus was also detected in 17
tomato samples collected from Nanjing with symptoms of reduced leaf size or leaf curling and yellowing
in the upper leaves and interveinal chlorosis and upward rolling and thickening in the lower leaves.
Sequence analysis showed that the whitefly-transmitted geminivirus was an isolate of Tomato yellow leaf
curl virus（TYLCV）and the whitefly-transmitted crinivirus was an isolate of Tomato chlorosis virus
（ToCV）. The two viruses were also detected in Bemisia tabaci collected from the greenhouses.
Key words：Tomato yellow leaf curl virus；Tomato chlorosis virus；mixed infection；molecular detection

收稿日期：2015–10–30；修回日期：2016–01–08
基金项目：国家公益性行业（农业）专项（201303028）；江苏省农业科技自主创新重点项目[CX（12）1004]；江苏省 333 高层次人才
培养工程科研项目（BRA2013262）；国家自然科学基金项目（31572074）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zyq@jsagri.gov.cn，jiyinghua@jaas.ac.cn）
Wu Shu-hua，Li Ting-fang，Zhao Wen-hao，Cheng Zhao-bang，Guo Qing-yun，Zhao Tong-min，Yu Wen-gui，Zhu Ye-qin，Ji Ying-hua.
Molecular identification on mixed infection of Tomato yellow leaf curl virus and Tomato chlorosis virus on tomato in Jiangsu Province.
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番茄黄化曲叶病毒病是番茄上由杂食性介体烟粉虱[Bemisia tabaci（Gennadius）]传播的双生病
毒（whitefly-transmitted geminiviruses，WTGs）引发的一种毁灭性病害（Harrison & Robinson，1999）。
该类病毒隶属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus），具有孪生颗粒
形态的单链环状 DNA 病毒（Fauquet et al.，2005），其引起的病害最早于 1939 年在以色列被发现
（Cohen & Harpaz，1964）。随着双生病毒在全世界范围内的蔓延，其对番茄的危害也日益加重，现
已扩散到中东、地中海沿岸、非洲、欧洲、美洲、亚洲以及澳大利亚等众多国家和地区（Cohen &
Antignus，1994；Czosnek & Laterrot，1997；Polston et al.，1999；Accotto et al.，2000，2003；Moriones
& Navas-Castillo，2000；Polston et al.，2002；Ueda et al.，2005）。20 世纪 90 年代后，中国番茄上粉
虱传双生病毒在广西、广东、云南、江苏、上海、浙江、安徽、山东、河南、河北、北京、天津、四
川、陕西、吉林、新疆等 10 余个省市发生（阮涛 等，2013；田鹏 等，2013；王祥 等，2014），给
当地的番茄生产造成了巨大的损失。
番茄褪绿病毒病是番茄上另一种由烟粉虱传播的番茄褪绿病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）
引发的严重危害番茄生产的病害。该病毒为长线型病毒科（Closteroviridae）毛形病毒属（Crinivirus）
二分体正义单链 RNA（+ssRNA）病毒（King et al.，2011）。20 世纪 90 年代，ToCV 在美国佛罗里
达州发现危害（Wisler et al.，1998），给当地的番茄生产造成了惨重的损失。目前 ToCV 至少在世界
20 个国家和地区有分布（Bese et al.，2011；Fiallo-Olivé et al.，2011；Navas-Castillo et al.，2011；
Arruabarrena et al.，2014）。在中国，ToCV 最早于 1998 年在台湾就有发生报道（Tsai et al.，2004），
近年来在北京（Zhao et al.，2013，2014b）、南京（Karwitha et al.，2014）和山东（Zhao et al.，2014a）
等地陆续出现 ToCV 发生危害，其中在山东省已造成的危害比较大（刘永光 等，2014）。
2014 年 11 月上旬在江苏省农业科学院试验田示范日光温室大棚进行常规粉虱传双生病毒导致
的番茄病害调查时发现一些棚室番茄黄化曲叶病症状比较严重，表现与以往有所不同, 同时发病棚
内有大量烟粉虱聚集在番茄叶片上。针对这些症状较重的番茄病样，对一些可能的粉虱传病毒进行
了分子检测与鉴定，发现这些病样中不仅含有粉虱传 DNA 病毒（TYLCV），而且还含有一种粉虱传
RNA 病毒（ToCV），同时在介体烟粉虱体内检测到了这两类病毒，暗示了这两种病毒极有可能已经
扩散蔓延，生产上应当密切关注。
1 材料与方法
1.1 材料
17份番茄病样和若干烟粉虱样品于 2014年11月上旬采自江苏南京江苏省农业科学院植物保护研
究所日光温室大棚。健康对照为防虫温室培育的健康番茄叶片，所有样品均保存于–80 ℃冰箱中备用。
RNA 提取试剂、酶、克隆载体及菌株：Trizol Reagent 购自北京康为世纪生物技术有限公司；
反转录试剂盒 PrimerScriptTM RT Master Mix、LA Taq 酶和克隆载体 pMD-18T 购自大连宝生生物公
司（TaKaRa）；Axygen DNA 凝胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；大肠杆菌 DH5α
购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 引物合成
合成烟粉虱传双生病毒简并引物 PA/PB（Deng et al.，1994），扩增双生病毒共同区及外壳蛋白
保守区域，目的片段约 500 bp，用于粉虱传双生病毒引起的番茄黄化曲叶病病原检测。PA：5′-TAA
吴淑华，李廷芳，赵文浩，程兆榜，郭青云，赵统敏，余文贵，朱叶芹，季英华.
江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测.
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TATTACGKGWKGVCCSC-3′，PB：5′-TGGACYTTRCAWJJBCCGCACA-3′。合成番茄褪绿病毒特异
引物 TOHsp1F/TOHsp1R（Louro et al.，2000）扩增该病毒 HSP70 热激蛋白保守区域。目的片段约
440 bp，用于粉虱传番茄褪绿病毒引起的番茄褪绿病毒病的病原检测。TOHsp1F：5′-GCTTCCGAAA
CTCCGTCTTG-3′，TOHsp1R：5′-TGTCCAAAGTACCGCCACC-3′。所有引物均委托英潍捷（上海）
贸易有限公司合成。
1.3 番茄病样总DNA提取和PCR扩增
番茄病样总 DNA 提取采用 CTAB 法（Harrison et al.，1997a），–20 ℃保存备用，以健康番茄
叶片总 DNA 作为阴性对照。PCR 反应体系为：在 25 μL 反应体系中，加入 10× buffer 2.5 μL，MgCl2
（25 mmol · L-1）1.5 μL，dNTP（各 2.5 mmol · L-1）2.0 μL，DNA 1.0 μL，PA/PB 引物各 1.0 μL，ddH2O
15.8 μL，LA Taq 酶 0.2 μL。PCR 扩增条件为：95 ℃预变性 5 min，95 ℃变性 45 s，55 ℃退火 45 s，
72 ℃延伸 50 s，35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。扩增结束后，取 5 μL PCR 产物于 1.0%琼脂糖
凝胶电泳中检测扩增产物，并用培清 JS-680D 全自动凝胶成像系统记录结果。
1.4 番茄病样总RNA提取和RT-PCR扩增
番茄总 RNA 的提取：取 0.05 ~ 0.1 g 病叶置于已灭菌的 2 mL 进口离心管中，加液氮迅速充分
研磨成粉状，加入 1 mL Trizol Reagent 混合，室温放置 5 min。加 200 μL 氯仿︰异戊醇（24︰1），手
摇剧烈振荡 15 s，室温放置 2 ~ 3 min 后，4 ℃ 12 000 r · min-1 离心 15 min。取上清液至 1.5 mL 离
心管中，加等体积的冰异丙醇，颠倒混匀，–20 ℃冰箱放置 20 min 以上。4 ℃ 12 000 r · min-1 离
心 10 min 后弃上清液，用 l mL 75%乙醇（0.1% DEPC 水配制）洗沉淀 2 次，每次洗涤后 4 ℃ 5 000
r · min-1 离心 5 min。弃上清液，超净台中风干，将 RNA 溶于 35 μL 0.1% DEPC 水中，检测 RNA 的
含量和质量后，–20 ℃保存备用，同时提取健康番茄叶片总 RNA 作为阴性对照。
cDNA 合成：以提纯总 RNA 为模板，用 PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒反转录合成病毒的
cDNA 第 1 条链。番茄 RT 反应体系：在 10 μL 反转录反应体系中加入 5× PrimeScriptTM RT Master Mix
buffer 2.0 μL，加入含 500 ng 体积的 RNA，用 RNase Free ddH2O 补足到 10 μL。轻轻混合，37 ℃ 15
min，85 ℃ 5 s，反应结束后，将反转录产物置于–20 ℃冰箱中保存备用。PCR 扩增体系 25 μL：
10× 缓冲液 2.5 μL，MgCl2 1.5 μL，dNTP 2.0 μL，cDNA 产物 1.0 μL，TOHsp1F/TOHsp1R 引物各 1.0
μL，ddH2O 15.8 μL，LA Taq 酶 0.2 μL。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性 45 s，53 ℃
退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，35 个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。扩增结束后，取 5.0 μL PCR 产物
于 1.0%琼脂糖凝胶电泳中检测扩增产物，并用培清 JS-680D 全自动凝胶成像系统记录结果。
1.5 烟粉虱总DNA、总RNA提取和PCR、RT-PCR扩增
采用氯仿/异戊醇法提取单头烟粉虱总 DNA（周志湘 等，2007），–20 ℃保存，用于 PCR 扩
增。烟粉虱总 RNA 的提取采用 Trizol 法（李洁 等，2015），略作改动，即用无菌牙签挑取 10 头烟
粉虱于已灭菌的 2 mL 进口离心管中，液氮充分研磨后，加入 1 mL Trizol Reagent 混合，室温放置
10 min，其他步骤相同，提取烟粉虱总 RNA，–20 ℃保存，用于 RT-PCR 扩增。
1.6 PCR产物的克隆和序列测定
PCR 扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳，由 Axygen DNA 凝胶回收试剂盒分离纯化，回收产物连
接 pMD18-T 载体，热击法转化大肠杆菌 DH5α，挑选阳性克隆，进行序列测定。

Wu Shu-hua，Li Ting-fang，Zhao Wen-hao，Cheng Zhao-bang，Guo Qing-yun，Zhao Tong-min，Yu Wen-gui，Zhu Ye-qin，Ji Ying-hua.
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1.7 序列分析及进化树的构建
序列测定委托南京金斯瑞生物工程技术服务有限公司完成，测序结果利用软件 DNAStar 进行拼
接及序列同源性分析，序列多重比对。聚类分析及进化树构建采用 MEGA6 软件的邻近法
（Neighbor-joining）完成，进化树的可信度使用 1 000 次自导复制验证。
本研究中所涉及的菜豆金色花叶病毒属序列信息见表 1，毛形病毒属序列信息见表 2。

表 1 本试验中所涉及的菜豆金色花叶病毒属病毒序列信息
Table 1 Information of Begomovirus mentioned in this paper
病毒 Virus 序列号 Accession No.
中国木瓜曲叶病毒 Papaya leaf curl China virus，PaLCuCNV EU874386
中国番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl China virus，ToLCCNV AJ558118
广东番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Guangdong virus，ToLCGdV AY602165
广西番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Guangxi virus，ToLCGxV AM236784
海南番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Hainan virus，ToLCHaiV KF150142
台湾番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl Taiwan virus，ToLCTV JQ867093
番茄曲叶病毒 Tomato leaf curl virus，ToLCV S53251
阿萨尔基亚番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Axarquia virus，TYLCAxV AY227892
中国番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV AJ319675
马拉加番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Malaga virus，TYLCMaV AF271234
撒丁岛番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Sardinia virus，TYLCSV X61153
中国上海番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Shanghai [China-Shangai-2005]，TYLCV-Sha AM282874
中国江苏番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Jiangsu [China-Jiangsu-2007]，TYLCV-JS GU111505
伊朗布什尔番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Boushehr [Iran-Genaveh 29-2006]，TYLCV-Bou GU076454
伊朗沙赫尔番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Iran [Iran-Iranshahr-1998]，TYLCV-IR AJ132711
伊朗凯诺番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Kahnooj [Iran-Kahnooj-2007]，TYLCV-Kah EU635776
伊朗科曼番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Kerman [Iran-Hormozgan 32-2006]，TYLCV-Ker GU076442
以色列米尔德番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Mild [Israel-1993]，TYLCV-Mld X76319
阿曼番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl virus–Oman [Oman-Al-batinah 22-2005]，TYLCV-OM FJ956700
云南番茄黄化曲叶病毒 Tomato yellow leaf curl Yunnan virus，TYLCYnV KC686705

表 2 本试验中所涉及的毛形病毒属序列信息
Table 2 Information of Crinivirus mentioned in this paper
病毒 Virus 序列号 Accession No. 分离物 Isolate 国家 Country
番茄褪绿病毒 Tomato chlorosis virus，ToCV KJ815045 南京 Nanjing 中国 China
AY903448 佛罗里达 Florida 美国 America
DQ136146 AT80/99 西班牙 Spain
KP114533 JJ3 韩国 Korea
KP114528 YG 韩国 Korea
KP114525 IS17 韩国 Korea
KC887999 北京 Beijing 中国 China
KP137099 HS 韩国 Korea
JQ952601 Br2 巴西 Brazil
KP114537 HP 韩国 Korea
KP114536 JN1 韩国 Korea
KC709510 山东寿光 Shouguang，Shandong 中国 China
KP114534 JJ5 韩国 Korea
KP114529 IS29 韩国 Korea
EU284744 Gr-535 希腊 Greece
KP137101 JJ 韩国 Korea
KJ740257 AT80/99-IC 西班牙 Spain
番茄侵染性褪绿病毒 Tomato infectious chlorosis virus，TICV FJ815441 CA 美国 America
蚕豆黄症病毒 Bean yellow disorder virus，BnYDV EU191905 Bn-03 西班牙 Spain
甜菜伪黄化病毒 Beet pseudo yellows virus，BPYV AY330919 Maryland 美国 America
黑莓黄化病毒 Blackberry yellow vein–associated virus，BYVaV AY776335 South Carolina 美国 America
葫芦黄色矮化失调病毒 Cucurbit yellow stunting disorder virus，CYSDV AJ439690 Spain 西班牙 Spain
莴苣褪绿病毒 Lettuce chlorosis virus，LCV FJ380119 California 美国 America
莴苣侵染性黄化病毒 Lettuce infectious yellows virus，LIYV U15441 California/92 美国 America
草莓灰白症相关病毒 Strawberry pallidosis–associated virus，SpaV AY488138 M1 美国 America
甘薯萎黄矮缩病毒 Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV AJ428555 EA/Uganda 乌干达 Uganda
吴淑华，李廷芳，赵文浩，程兆榜，郭青云，赵统敏，余文贵，朱叶芹，季英华.
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2 结果与分析
2.1 田间病株症状
















图 1 病样的田间症状
Fig. 1 Symptoms of the virus-infected tomato
棚中番茄病株表现整株矮缩、坐果很少，
上部叶片黄化，变小，叶缘上卷、增厚皱缩；
下部叶片类似营养失调的缺素症状，叶脉间褪
绿黄化，叶片变厚，叶缘上卷，老叶脉间坏死、
变脆易碎（图 1）。该病症状较之前报道的由
TYLCV 导致的番茄黄化曲叶病症状重，但二
者也很难区分。在调查时发现发病重的棚室里
番茄叶片常常聚集大量的烟粉虱，因此对一些
番茄上常见的粉虱传病毒进行了检测。
2.2 番茄病样中病毒检测
2.2.1 粉虱传双生病毒的分子检测和序列分析
以田间采集的 17 份番茄样品总 DNA 为模
板，利用粉虱传双生病毒的简并引物 PA/PB 进
行 PCR 扩增，所有番茄样品均扩增到 1 条约 500 bp 大小的条带（图 2，A），初步证明番茄病样均
含有粉虱传双生病毒。随机抽选番茄样品 N14t-2、N14t-13 和 N14t-15（图 2，A 中相应的 2、13 和
15）进行目的片段回收、克隆和测序，DNAstar 软件分析结果显示目的片段均由 541 个碱基组成，
分离物间序列同源性高达 99.1%以上，BLAST 分析结果显示克隆序列与番茄黄化曲叶病毒的同源性
最高（> 99%），聚类分析结果也显示，克隆到的 3 个分离物都聚类到 TYLCV 分支中，与之前报道
的江苏分离物（XH2）有较近的亲缘关系（图 3），暗示了番茄样品中检测到的粉虱传病毒为 TYLCV。
2.2.2 粉虱传长线形病毒的分子检测和序列分析
以田间采集的17份番茄样品总RNA为模板进行RT-PCR扩增，结果显示：引物TOHsp1F/TOHsp1R
从所有番茄样品中均扩增到 1 条约 440 bp 大小的条带（图 2，B）。同样抽选番茄样品 N14t-2、N14t-13
和 N14t-15（与粉虱传双生病毒抽样一致）进行目的条带回收、克隆和序列测序，DNAstar 软件分析
结果显示目的片段均由 439 个碱基组成，分离物间序列同源性高达 99.3%以上，BLAST 分析结果显
示克隆序列与番茄褪绿病毒的同源性最高（> 99%），对其进行聚类分析结果也显示，克隆到的 3 个
分离物都聚类到 ToCV 的分支中（图 4），暗示了番茄样品中检测到的粉虱传 RNA 病毒为 ToCV。
图 2 番茄样品中粉虱传双生病毒的 PCR 检测（A）和长线形病毒的 RT-PCR 检测（B）
M3：Marker；CK：阴性对照；1 ~ 17：番茄病样（N14t-1 ~ N14t-17）。
Fig. 2 PCR detection of virus by whitefly-transmitted Geminiviruses（A）and RT-PCR detection of Crinivirus（B）in diseased tomato plants
M3：Marker；CK：Negative control；1–17：Tomato samples（N14t-1–N14t-17）.

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图 3 根据病毒核苷酸序列一致性重建的双生病毒系统进化树
各支上的数字是 1 000 次 bootstrap 自导复制的置信度。▲：从番茄样品中扩增的序列；●：从烟粉虱中扩增的序列。
Fig. 3 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Geminiviruses
The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively.
▲：Sequence amplified from tomato；●：Sequence amplified from whitefly.


图 4 根据病毒核苷酸序列一致性重建的毛形病毒系统进化树
各支上的数字是 1 000 次 bootstrap 自导复制的置信度。▲：从番茄样品中扩增的序列；●：从烟粉虱中扩增的序列。
Fig. 4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences identities of Crinivirus
The length and bootstrap confidence values of each branch are indicated above and below the branch respectively.
▲：Sequence amplified from tomato；●：Sequence amplified from whitefly.
吴淑华，李廷芳，赵文浩，程兆榜，郭青云，赵统敏，余文贵，朱叶芹，季英华.
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2.3 烟粉虱中病毒检测
2.3.1 双生病毒的分子检测和序列分析
从田间发病棚室采集的烟粉虱群体中随机抽样 40 头，氯仿/异戊醇法提取单头烟粉虱的总 DNA
做模板，利用粉虱传双生病毒简并引物 PA/PB 对烟粉虱体内双生病毒进行 PCR 检测，部分样品的
检测结果显示有 12 头烟粉虱样品扩增到 1 条约 500 bp 大小的条带（图 5），随机抽选烟粉虱样品
N14wD-5、N14wD-7 和 N14wD-15（图 5 中相应的 5、7 和 15）的 PCR 产物目的片段进行回收、克
隆和测序，DNAstar 软件分析结果表明目的片段均由 541 个碱基组成，分离物间序列同源性高达
98.3%以上，BLAST 分析结果显示克隆序列与番茄黄化曲叶病毒的同源性最高（> 99%），对其进行
聚类分析结果也显示，克隆到的 3 个分离物都聚类到 TYLCV 的分支中，与之前报道的江苏分离物
（XH2）有较近的亲缘关系（图 3），暗示了烟粉虱样品中检测到的粉虱传病毒为 TYLCV。


图 5 烟粉虱体内双生病毒的 PCR 检测（单头）
M3：Marker；CK：阴性对照；1 ~ 15：烟粉虱样品（N14wD-1 ~ N14wD-15）。
Fig. 5 PCR detection of Geminiviruses in whitefly（1 whitelfy/sample）
M3：Marker；CK：Negative control；1–15：Whitefly samples（N14wD-1–N14wD-15）.

2.3.2 长线形病毒的分子检测和序列分析
由于单头烟粉虱 RNA 提取存在困难，选择从田间发病棚室采集的烟粉虱群体里随机选取 10 头
烟粉虱作为一份样本，共取 15 份样本分别提取总 RNA，进行 RT-PCR 扩增，电泳检测结果显示：
用特异引物 TOHsp1F/TOHsp1R 均能从 15 份样品中扩增到一条约 440 bp 大小的条带（图 6）。随机
抽选样品 N14wR-2、N14wR-9 和 N14wR-14（图 6 中相应的 2、9 和 14）的 PCR 产物目的片段进行
回收、克隆和测序，DNAstar 软件分析结果表明目的片段均由 439 个碱基组成，分离物间序列同源
性高达 99.5%以上，BLAST 分析结果显示克隆序列与番茄褪绿病毒的同源性最高（> 99%），对其进
行聚类分析结果也显示，克隆到的 3 个分离物都聚类到 ToCV 的分支中（图 4），暗示了烟粉虱样品
中检测到的粉虱传 RNA 病毒为 ToCV。

图 6 烟粉虱体内番茄褪绿病毒的 RT-PCR 检测（10 头/样）
M3：Marker；CK：阴性对照；1 ~ 15：烟粉虱样品（N14wR-1 ~ N14wR-15）。
Fig. 6 RT-PCR detection of ToCV in whitefly（10 whiteflies/sample）
M3：Marker；CK：Negative control；1–15：Whitefly samples（N14wR-1–N14wR-15）.
3 讨论
鉴于番茄黄化曲叶病毒病的危害，本实验室自 2007 年来一直关注该病的发生及病原种群动态。
虽然中国番茄黄化曲叶病的病原有多种（主要是粉虱传双生病毒，如番茄黄化曲叶病毒、中国番木

Wu Shu-hua，Li Ting-fang，Zhao Wen-hao，Cheng Zhao-bang，Guo Qing-yun，Zhao Tong-min，Yu Wen-gui，Zhu Ye-qin，Ji Ying-hua.
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瓜曲叶病毒、中国台湾番茄曲叶病毒等），而在江苏，导致番茄黄化曲叶病毒的粉虱传双生病毒则主
要是番茄黄化曲叶病毒，之前未见到其他病毒侵染番茄导致番茄黄化曲叶病的报道（季英华 等，
2008）。本研究的结果表明，2014 年底从江苏省农业科学院植物保护研究所温室大棚采集自然发病
的番茄黄化曲叶病样中检测到粉虱传病毒有两种：TYLCV 和 ToCV，该结果暗示了南京地区发生的
这种新的番茄黄化曲叶病可能是由两种病毒复合侵染导致，而 TYLCV 和 ToCV 复合侵染番茄危害
在江苏尚属首次报道。
ToCV 是一种烟粉虱传 RNA 病毒，近年来该病毒在中国山东、河北、北京和天津等省市发生，
尤其在山东呈爆发之势，已给当地番茄生产造成严重危害，经济损失惨重（刘永光 等，2014；周涛
等，2014）。江苏于 2014 年出现 ToCV（本氏烟）报道（Karwitha et al.，2014），生产上尚未见到该
病危害报道。国外研究显示 ToCV 可以与多种植物病毒发生复合侵染，如 Tomato spotted wilt virus
（TSWV）、Tomato torrado virus（ToTV）、Pepino mosaic virus（PMV）等（Garcia-Cano et al.，2006；
Davino et al.，2008；Alfaro-Fernandez et al.，2010）。2006—2007 年，Martinez-Zubiaur 等（2008）
在对古巴当地番茄黄化曲叶病调查时也发现存在 ToCV 和 TYLCV 复合侵染。本研究中对江苏南
京采集的番茄病样检测结果也证实这两种病毒可以复合侵染番茄，同时烟粉虱群体中也可以检测到
这两种病毒，暗示了这两种病毒可以同时存在烟粉虱群体中，并随烟粉虱迁飞广泛地传播扩散，造
成更大范围的危害，因此生产上应当密切关注这种病毒复合侵染导致的番茄黄化曲叶病。
很多研究显示多种病毒的复合侵染往往具有协生作用，有助于其突破寄主的抗性，导致新的病
害发生和流行（Rochow & Ross，1955；Vance，1991；Harrison et al.，1997b），2006 年 Garcia-Cano
等（2006）在对 ToCV 和 TSWV 研究时发现，二者存在协生作用：当 ToCV 与 TSWV 同时侵染含
有 Sw-5 的抗 TSWV 番茄时，ToCV 的侵染会导致寄主番茄对 TSWV 抗性丧失。近年来随着番茄黄
化曲叶病在我国大面积发生危害，抗番茄黄化曲叶病的番茄品种也在大面积推广应用，并在病害的
防控上取得了较好的效果（赵统敏 等，2011；晋萍 等，2013），但是 TYLCV 的抗性品种对 ToCV
的抗性表现目前尚不明确，而 ToCV 与 TYLCV 的复合侵染是否也可能存在协生作用？这种协生作
用是否有可能助力 TYLCV 突破寄主的抗性？虽然目前尚未见到相关报道，但番茄褪绿病毒的发生
对当前推广应用的抗 TYLCV 番茄品种确是一个潜在的威胁，值得深入研究。
除番茄外，ToCV 至少还可以侵染 30 种寄主植物，包括多种蔬菜、园艺作物及杂草，其中包括
辣椒（Lozano et al.，2004；Vargas et al.，2011；Fortes et al.，2012；Vargas-Asencio et al.，2013）、
马铃薯（Fortes & Navas-Castillo，2012；Freitas et al.，2012）、烟草（Fiallo-Olivé et al.，2014）等
多种重要的作物，因此生产上除了关注该病在番茄上的危害外，在其他作物上的危害也值得密切关
注。
与 ToCV 同属的番茄侵染性褪绿病毒（Tomato infectious chlorosis virus，TICV）也能引起番茄褪
绿病毒病，而且这两种病毒在番茄上引起的症状非常相似且难以区分，需要通过鉴别寄主甄别
（Wintermantel & Wisler，2006；Hanssen et al.，2010），目前中国还没有 TICV 发现的报道（周涛 等，
2014），为此通过 RT-PCR 的方法对番茄病样也进行了 TICV 的检测，结果显示没有扩增到预期目的
片段，表明本研究采集的番茄病样没有 TICV 的侵染。
烟粉虱属杂食性昆虫，目前其寄主已发现 600 种以上（Secker et al.，1998）。在烟粉虱的主要寄
主中，能周年寄生在藿香蓟（Ageratum conyzoides）、赛葵（Malvastrum tricuspidatum）、留兰香（Mentha
viridis）和茄子（Solanum melongena）等寄主植物上，这些植物对烟粉虱的越冬、种群的建立及传
播起着重要作用（Attique et al.，2003）。烟粉虱危害作物 3 种主要方式之一是传播植物病毒，诱发
吴淑华，李廷芳，赵文浩，程兆榜，郭青云，赵统敏，余文贵，朱叶芹，季英华.
江苏省番茄黄化曲叶病毒和褪绿病毒复合侵染的分子检测.
园艺学报，2016，43 (1)：89–99. 97
植物发生病毒病，其造成的危害是最为严重的（冯兰香 等，2001）。随着田间生态环境的变化、栽
培品种不断更新和栽培制度的改变特别是设施农业的发展壮大，使烟粉虱介体昆虫越冬更易，其携
带的植物病毒种类也增多，这可能是造成病毒对作物复合侵染发生的主要原因，因此防治烟粉虱十
分重要，是降低番茄病毒病危害的关键措施之一。

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