全 文 ：园艺学报，2016，43 (1)：161–167.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0505；http：//www. ahs. ac. cn 161
水仙温度诱导脂质运载蛋白基因NtTIL的克隆
与表达分析
丁安琪 1,*，冯 莹 2,*，朱里莹 1，徐世荣 1，秦 军 1，潘东明 1,**
（1 福建农林大学园艺产品贮运保鲜研究所，福州 350002；2 泉州师范学院资源与环境科学学院，福建泉州 362000）
摘 要：采用 PCR 法，从水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）鳞茎主芽中分离克隆到 1 个温度诱导
脂质运载蛋白基因 NtTIL。该基因含有 567 bp 开放阅读框，编码 188 个氨基酸。该基因属于 lipocalin-2
superfamily 基因家族；推导的氨基酸序列含有 SCR1、SCR2 和 SCR3 3 个植物 lipocalin 的典型结构域，与
小麦、拟南芥等植物的同源性大于 75%；编码的蛋白为稳定酸性亲水蛋白，不含有信号肽，进行 N 末端
朝外由外到内的跨膜运动。qRT-PCR 结果分析表明，水仙生长发育过程中鳞茎膨大期 NtTIL 表达量较低；
休眠期表达量先升高后降低。推测 NtTIL 对水仙鳞茎主芽休眠具有一定调控作用。
关键词：水仙；温度诱导运载蛋白；克隆；表达；夏休眠
中图分类号：S 682.2+1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0161-07

Cloning and Expression Analysis of Temperature-induced Lipocalin in
Narcissus tazetta var. chinensis
DING An-qi1,*，FENG Ying2,*，ZHU Li-ying1，XU Shi-rong1，QIN Jun1，and PAN Dong-ming1,**
（1Institute of Postharvest Science and Technology of Horticultural Products，Fujian Agriculture and Forestry University，
Fuzhou，350002，China；2School of Resource and Environmental Science，Quanzhou Normal University，Quanzhou，
Fujian 362000，China）
Abstract：An encoding temperature-induced lipocalin（TIL）gene NtTIL was separated and cloning
by PCR in Narcissus tazetta var. chinensis. The open reading frame of NtTIL was 567 bp，encoding a
protein of 188 amino acids. Biological software for NtTIL protein analysis showed that：The gene belongs
to lipocalin-2 superfamily gene family；typical domains deduced from amino acid sequence contained
SCR1，SCR2 and SCR3 three of botanical lipocalin. It’s homology greater than wheat，Arabidopsis and
other plants 75%. Sequence analyses revealed that this protein was stable and hydrophilic without signal
peptides； transmembrane movement was from outside to inside in the outward N-terminus， then
transmembrane. And the relative expression of this gene was surveyed by real-time quantitative PCR
during different growth stage. The results showed that its relative expression during different growth stage
was different；the NtTIL expression was low in bulb swelling stage，expression increased and then reduced
in dormancy stage，and expression increased slightly in flower differentiation stage. In conclusion，it

收稿日期：2015–10–31；修回日期：2015–12–11
基金项目：福建省高水平大学建设项目，国家‘十一五’科技支撑计划项目（2007BAD07B00）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：pdm666@126.com）
Ding An-qi，Feng Ying，Zhu Li-ying，Xu Shi-rong，Qin Jun，Pan Dong-ming.
Cloning and expression analysis of temperature-induced lipocalin in Narcissus tazetta var. chinensis.
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suggested that NtTIL could play a role for regulation of bud dormancy in Narcissus tazetta var. chinensis.
Key words：Narcissus tazetta var. chinensis；temperature-induced lipocalin；cloning；expression；
dormancy

脂质运载蛋白（lipocalin）是一类广泛存在于动物、植物、单细胞生物和细菌中的胞外蛋白（Suzuki
et al.，2004），具有非常重要的功能，如调节细胞生长、代谢、结合细胞表面受体、响应环境变化
（Akerstrom et al.，2000；Bishop，2000；Frenette et al.，2002）。植物在生长发育过程中通过自我或
诱导形成的保护系统来抵御环境变化，如高温、低温、干旱、污染等，而植物的脂质运载蛋白参与
这一保护系统调控（Frenette et al.，2005，2008；Uemura et al.，2006；Levesque-Tremblay et al.，2009；
Kjellsen et al.，2010）。植物的脂质运载蛋白主要有 2 种类型：叶绿体脂质运载蛋白（chloroplast
lipocalin，CHL；Levesque-Tremblay et al.，2009）和温度诱导脂质运载蛋白（temperature-induced
lipocalin，TIL；Frenette et al.，2005；Grzyb et al.，2006）。TIL 在植物抵御逆境时具有重要的调节作
用和信号传递作用（Rassart et al.，2000；Brinker et al.，2010）。虽然 TIL 响应高温（Frenette et al.，
2002；Chi et al.，2009），但是 TIL 在高温诱导夏休眠中所起的作用还未见报道。水仙（Narcissus tazetta
var. chinensis）具有特定的夏休眠时期（Feng et al.，2015），经水仙转录组文库筛选获得 TIL 是具有
差异表达的温度响应因子。本研究中分离并克隆了水仙鳞茎 TIL 同源基因 NtTIL，对其进行生物信
息学分析，并利用 qRT-PCR 方法分析水仙不同生长发育阶段 NtTIL 表达量变化，探明 NtTIL 的表达
规律，初步证实 NtTIL 在夏休眠中起一定调节作用，为植物夏休眠发生的相关机制研究提供理论依
据。
1 材料与方法
1.1 材料
材料为福建省漳州市商业种植基地 3 年生水仙鳞茎。2012 年 4 月 14 日—7 月 14 日，每隔 7 d
取样 1 次，将主鳞茎从基地取出后用水冲洗泥土，再用无菌纸擦净表面水分，用干净的刀片切去叶
子和根，剥去主鳞茎鳞片获得主芽。
1.2 总RNA提取与cDNA第 1 链合成
取 0.1 g 水仙鳞茎主芽用液氮研磨后加入含有提取液（0.1 mol · L-1 Tris-HCl，0.02 mol · L-1 EDTA，
1.4 mol · L-1 NaCl，2.0% CTAB）的离心管内；37 ℃摇床充分振荡 15 ~ 20 min，加入 100 ~ 180 µL
无水 C2H5OH，冰上放置 2 min，15 000 × g 离心 5 min，取上清液；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇（25∶
24∶1），4 ℃12 000 r · min-1 离心 10 min，取上清液；加入 0.7 倍体积异丙醇，4 ℃12 000 r · min-1
离心 15 min，弃上清液；加入 100 µL RNase-free H2O、1.0 mL Trizol和 200 µL氯仿，4 ℃12 000 r · min-1
离心 10 min，取上清液；加入 0.7 倍体积异丙醇，4 ℃12 000 r · min-1 离心 10 min，弃上清液；沉淀
用 75% C2H5OH 洗涤 2 次，晾干，用 30 µL RNase-free H2O 溶解沉淀。
以总 RNA 为模板，按照 RevertAidTM First-Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒（Fermentas 公司）
说明书合成 cDNA 第 1 链。
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1.3 基因的克隆与测序
基于水仙转录组测序结果，采用 Oliger 6.0 软件分别设计上、下游引物，用于水仙 NtTIL 开放
阅读框（ORF）的 cDNA 扩增。引物 NtTIL-F：5′-AGAACCGTCCGGCAAACAAAAC-3′；NtTIL-R：
5′-TTGAACATATTTTGGATGGCGTGAT-3′。
以水仙 cDNA 为模板进行 PCR 扩增。反应体系为：1.0 µL cDNA 模板，10 mmol · L-1 上、下游
引物各 0.5 µL，2.5µL 10 × EX-Taq buffer，0.5 µL dNTP Mix（10.0 mmol · L-1），0.15 µL EX-Taq，补
H2O 至总体积为 25 µL。反应条件为：95 ℃预变性 5 min；94 ℃ 30 s，57 30 s℃ ，72 1 min℃ ，35
个循环；72 ℃延伸 10 min。
PCR 产物经 1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后，将目的片段切割并按照 DNA 纯化回收试剂盒（Tiangen）
进行目的片段的回收。PCR 胶回收产物连接到 pMD18-T（TaKaRa）上，转化到感受态大肠杆菌 DH5α，
挑选单克隆进行扩繁后进行 PCR 验证。挑选 PCR 验证正确的阳性克隆送上海博尚生物技术有限公
司测序。
1.4 序列分析与比较
将测序结果利用 DNAMAN 软件并通过 Blast X 和 Blast P 搜索 NCBI 的核苷酸和蛋白质数据库
进行序列相似分析及氨基酸保守结构域预测；用 ProtParam 对蛋白质进行理化性质分析；用 TMpred
Server 和 SignalP 4.1 分别对蛋白序列进行跨膜和信号肽分析。
1.5 组织表达模式分析
以水仙不同时期 RNA 500 ng 为底物，按照 PrimeScriptTM RT reagent Kit（TaKaRa）说明书进行
cDNA 合成。采用 Oliger 6.0 软件，根据获得的 NtTIL 基因设计特异引物 TIL-F（5′-AACCGAGG
AACGGCGAGAAC-3′）和 TIL-R（5′-CAGGAAACAGCGGCAGGAAAG-3′），并引用冯莹等（2015）
的水仙 ACTIN 内参基因特异性引物 ACTIN-F（5′-TGCCCAGAAGTGCTATTCCAG-3′）和 ACTIN-R
（5′-GTTGACCCACCACTAAGAACAATG-3′）。将 cDNA 模板稀释 10 倍后用于 qRT-PCR 扩增。反
应体系为：cDNA 模板 1.0 µL，10 mmol · L-1 上、下游引物各 0.4 µL，2 × SYBR Green Premix Ex TaqTM
（TaKaRa）1.0 µL 补 H2O 至总体积为 20 µL。反应条件为：预变性 94 20 s℃ ；94 ℃变性 10 s，62 ℃
退火 20 s，40 个循环。
各试验设 3 个生物重复，2 次技术重复。数据分析采用 2-∆∆Ct 方法（Schmittgen & Livak，2008），
并对其进行 Duncan’s 新复极差分析差异显著性，检测水平为 P < 0.05。

2 结果与分析









图 1 水仙 NtTIL 基因 PCR 扩增产物电泳检测
Fig. 1 PCR product of NtTIL in Narcissus tazetta var. chinensis
2.1 基因克隆与结构分析
以水仙鳞茎主芽 cDNA 为模板，NtTIL-F/R
为引物，PCR 扩增：获得 780 bp 的特异条带（图
1），与预测的基因片段大小相符，初步确定为
目的基因片段。
对目的片段测序后获得的序列进行分析表
明，目的基因片段含有 1 个完整的开放阅读框，

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大小为 564 bp，该目的基因编码 188 个氨基酸和一个终止子，命名为 Narcissus tazetta var. chinensis
temperature-induced lipocalin（NtTIL）。这是第 1 个石蒜科植物的 TIL 基因。
2.2 氨基酸序列比较与系统进化树分析
将氨基酸序列与其他植物的氨基酸序列比较（图 2），发现水仙 NtTIL 基因推导的氨基酸序列含
有 3 个植物脂质运载蛋白的特征结构域，分别为 SCR1、SCR2 和 SCR3，其中 SCR1 结构域中含有
2 个保守的氨基酸 G（甘氨酸）和 W（色氨酸）；SCR2 结构域中含有 1 个 TDY（GDY）成分区域；
SCR2 结构域中含有 1 个保守的氨基酸 R（精氨酸）。



图 2 水仙 NtTIL 与其他植物的氨基酸序列比较
Fig. 2 Comparison of the amino acid sequences of NtTIL between in the N. tazetta var. chinensis and in the others

将核苷酸序列和预测的氨基酸序列与 GenBank 中其他植物 TIL 的序列进行同源性比较发现：水
仙 NtTIL 的核苷酸序列与葡萄、小麦、大麦、棉花、高粱、玉米、杨树、桃树等植物 TIL 的具有较
高同源性，达到 70%以上；其氨基酸序列与小麦、拟南芥、棉花、玉米、冰叶日中花等植物的氨基
酸序列同源性大于 75%。


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通过构建 N. tazetta var. chinensis NtTIL；Arabidopsis thaliana AtTIL（BAB10998）；Zea mays
ZmTIL-1（DQ222975）、ZmTIL-2（DQ222979）；Vitis vinifera VvTIL（NM_001281236）；Triticum aestivum
TaTIL-1（AAL75812）、TaTIL-2（DQ222977）；Oryza sativa OsTIL-1（BAG92316）、OsTIL-2（BAG90960）
蛋白系统进化树，分析水仙 NtTIL 蛋白与植物中 TIL 类似蛋白的遗传进化关系，结果表明，水仙
NtTIL 蛋白序列属于脂质运载蛋白，与水稻、玉米等植物 TIL 类似蛋白聚为同一类（图 3）。


图 3 水仙 NtTIL 系统进化树分析
Fig. 3 Phylogenetic analysis of NtTIL in N. tazetta var. chinensis

2.3 NtTIL编码蛋白理化性质与结构特征分析
基本理化性质的预测分析结果表明，该蛋白分子量为 21 777.8 D，原子组成 C999H1503N253O283S6；
理论等电点 pI 5.78，负电荷的氨基酸残基数（Asp + Glu）为 26，正电荷的氨基酸残基数（Arg + Lys）
为 24；消光系数为 2.336；脂肪系数为 70.53；总平均疏水性为–0.617；不稳定系数为 39.48。这些
均说明该蛋白为稳定的呈酸性的亲水蛋白。该蛋白共有 20 种氨基酸组成，编码的蛋白以脯氨酸和赖
氨酸含量最高，都达到 8.5%；其次是亮氨酸（8.0%），而半胱氨酸的含量最少，仅为 1.1%。
信号肽预测分析结果表明，该蛋白不含信号肽。
跨膜结构预测分析结果表明：其含有 2 个跨膜螺旋，其中一个是由 21 个氨基酸组成的、位于
89 ~ 109、方向由内到外的跨膜结构，其分值为 561；另一个是由 23 个氨基酸组成、位于 87 ~ 109、
方向由外到内的跨膜结构，其分值为 896。依据跨膜结构分值推测该蛋白跨膜模型倾向于 N 末端朝
外的由外到内进行跨膜。
2.4 水仙不同生长时期中NtTIL的表达量分析
水仙进入生长发育过程分为鳞茎膨大期、休眠期和花芽分化期 3 个时期（Feng et al.，2015），
qRT-PCR 结果表明：NtTIL 在这 3 个时期的表达量具有差异，鳞茎主芽处于鳞茎膨大期时 NtTIL 表
达量较高（4 月 14 日至 4 月 28 日）；由鳞茎膨大期进入休眠期时，NtTIL 的表达量突然下降，4 月
28 日表达量显著高于 5 月 5 日的表达量；休眠前期（5 月 5 日至 6 月 9 日）NTIL 表达量逐渐增加，
并于 6 月 9 日达到最高，与其他时间段的表达量存在显著差异；休眠后期（6 月 9 日至 7 月 7 日）
NTIL 表达量逐渐降低；花芽分化期，NtTIL 表达量略升高。基于 5 月 5 日为休眠开始，其表达量降
低；7 月 7 日为休眠解除同时花芽开始分化，推测 NtTIL 在水仙鳞茎芽的休眠具有一定的调控作用
（图 4）。

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图 4 水仙不同生长时期 NtTIL 表达量变化
Fig. 4 NtTIL expression of different growth stage in N. tazzetta var. chinensis
3 讨论
植物脂质运载蛋白同 3 类脂质运载蛋白 mammalian apolipoprotein D、bacterial lipocalin（Blc）
和 insect Lazarillo，具有非常高的同源性，主要是氨基酸序列含有脂质运载蛋白典型的 3 个 SCR 保
守结构域（Frenette et al.，2002，2005；Campanacci et al.，2006）。水仙 NtTIL 的氨基酸序列分析表
明该基因序列含有 3 个 SCR 保守结构域，因此，克隆得到的水仙 NtTIL 基因属于植物脂质运载蛋白，
属于 lipocalin-2 superfamily 家族。这是石蒜科首次获得的脂质运载蛋白。
水仙 NtTIL 蛋白为稳定的呈酸性的亲水蛋白，且是不含信号肽的膜蛋白，与小麦（Frenette et al.，
2002）、拟南芥、玉米、水稻和葡萄（Frenette et al.，2005）5 种植物 TIL 蛋白属于类似蛋白。He 等
（2015）研究发现野苜蓿 TIL 与细胞膜有关联，它扮演一个保护质膜的角色，作为质膜上的一种蛋
白，能够对高温环境产生响应，这与本研究的跨膜预测结果一致。该蛋白的脂肪系数与拟南芥、玉
米等相近，但明显低于葡萄 TIL 蛋白的脂肪系数，这可能是由于植物之间生理特性导致的。
TIL 响应高温或低温（Kawamura & Uemura，2003；Kjellsen et al.，2010；He et al.，2015），在
低温或高温胁迫处理时，小麦和拟南芥的 TIL 表达量提高（Frenette et al.，2005），小麦 TaTIL 基因
在叶片中呈特异性表达（Schleiff et al.，2001）。这可能是由于高温或低温条件下，TIL 基因提高表
达，从而保护质膜不受损伤，维持细胞膜稳定和渗透调节作用（Frenette et al.，2002；Abo-Ogiala et
al.，2014）。水仙是夏休眠植物，高温诱导并解除水仙休眠（Li et al.，2012；Feng et al.，2015）。本
研究中发现，水仙休眠前期 NtTIL 的表达量逐渐增加，休眠后期温度升高其表达量下降。这可能是
由于水仙生理特性决定的，NtTIL 可能转导细胞外内温度信号或者与细胞表面受体结合共同转导温
度信号，从而参与夏休眠调控。关于水仙 NtTIL 如何传递信号或者与细胞表面的何种配体结合共同
调控水仙休眠还需要进一步验证。

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