全 文 ：园艺学报，2016，43 (5)：998–1004.
Acta Horticulturae Sinica
998 doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0778；http：//www. ahs. ac. cn
收稿日期：2015–12–21；修回日期：2016–04–26
基金项目：国家自然科学基金项目（31070621）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：xupinsan @sina.com）
百合无症病毒 16 kD 基因的克隆、原核表达及抗
血清制备
冀文婕 1，张郑瑶 2，徐品三 1,*
（1 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116024；2 大连理工大学生命与医药学院，辽宁盘锦 124221）
摘 要：以感染百合无症病毒（LSV）的百合叶片为试材，克隆 LSV16 kD 基因，连接到原核表达载
体 pET-28a（+）上。将获得的重组质粒 pET-28a（+）+16 kD 转化大肠杆菌 BL21（DE3），经 IPTG 诱导
得到了高效表达的 16 kD 蛋白，融合蛋白分子量约为 20 kD。融合蛋白经过镍柱纯化后作为抗原免疫注射
小鼠，制备得到 16 kD 蛋白抗血清。Western blot 分析显示所制备的抗血清与诱导表达的融合蛋白发生特
异性反应；通过 ELISA 检测和 RT-PCR 检测百合样品，证实制备的抗血清与 LSV 侵染的百合叶片发生了
相同的特异性反应。结果表明，目的蛋白表达成功，所制备的抗血清具有特异性，可用于 LSV 的快速检
测、免疫组织化学以及 16 kD 蛋白功能研究。
关键词：百合；百合无症病毒；16 kD；基因克隆；原核表达；抗血清制备
中图分类号：S 682.2；Q 786 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）05-0998-07

Gene Clone，Prokaryotic Expression of Lily symptomless virus 16 kD Gene
and Preparation of Its Polyclonal Antibody
JI Wen-jie1，ZHANG Zheng-yao2，and XU Pin-san1,*
（1 School of Life Science and Biotechnology，Dalian University of Technology，Dalian，Liaoning 116024，China；2School
of Life Science and Medicine，Dalian University of Technology，Panjin，Liaoning 124221，China）
Abstract：Unknown gene（16 kD）was amplified by RT-PCR from Lily leaves infected by Lily
symptomless virus and cloned into prokaryotic expression vector pET-28a（+）. Then the recombinant
plasmid vector ligated with His-tag and carried 16 kD gene was transformed into E. coli strain BL21
（DE3）. Induced with IPTG，the protein was highly expression in E. coli and the molecular weight of the
recombinant protein 16 kD was 20 kD. After purification with Ni2+-NTA affinity chromatography，
polyclonal antibody 16 kD was raised in mouses. Western blot analysis showed that the antiserum reacted
specially with 16 kD protein of LSV；ELISA and RT-PCR also confirmed that the antiserum reacted
specially with lily leaves infected by LSV. Our results indicate that the interest protein expression was
detected， the antiserum reacted specially with 16 kD protein and used for LSV rapid test ，
immunohistochemistry and functional study of 16 kD protein.
Key words：lily；Lily symptomless virus；16 kD；gene clone；prokaryotic expression；antiserum
preparation

冀文婕，张郑瑶，徐品三.
百合无症病毒 16 kD 基因的克隆、原核表达及抗血清制备.
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百合无症病毒（Lily symptomless virus，LSV）为香石竹潜隐病毒属（Carlavirus），是侵染百合
科植物的主要病毒之一。LSV 自 20 世纪 40 年代被发现以来（Brierley & Smith，1944），世界各地
均有大面积的发生的报道（刘成科 等，2005；Kim et al.，2012），成为严重危害百合种球生产和鲜
切花品质的世界性病害。LSV 常与百合斑驳病毒（LMoV）和黄瓜花叶病毒（CMV）复合侵染，导
致植株矮化，叶片和花朵畸形，严重时不开花（Asjes，2000）。据胡新颖等（2014）报道，在长期
无性繁殖的百合鳞茎中，LSV 的检出率可达 90%以上。因此，对 LSV 的科学检测和有效防治势在
必行。
LSV 基因组编码 4 个蛋白，依次为 RNA 依赖的 RNA 聚合酶（RdRp）、3 基因连锁结构（TGB），
外壳蛋白（CP）和未知蛋白 16 kD（明艳林 等，2005）。16 kD 蛋白属于 Carla_C4 蛋白家族的成员，
富含半胱氨酸，该蛋白可能形成锌指结构，可能参与寄主基因的转录和 RNA 复制等相关活动（徐
品三 等，2015）。另外，某些病毒的 16 kD 蛋白还具有基因沉默抑制子的功能（Walid et al.，2008）。
目前对于 LSV 的研究主要还是集中在检测上，通过病毒的外壳蛋白在大肠杆菌中的表达制备抗血清
检测病毒（沈嘉乐 等，2007），实时荧光 RT-PCR 检测等（余澍琼 等，2014），但抗血清检测大多
是通过病毒外壳蛋白制备抗体。本试验中克隆 LSV16 kD 基因，构建原核表达载体，在大肠杆菌中
高效表达目的蛋白，利用纯化的蛋白制备抗血清，鉴定抗血清特异性反应。本研究制备的抗血清不
仅用于检测 LSV，也为今后 LSV16 kD 的亚细胞定位和功能分析奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
试验在大连理工大学生命科学与技术学院和大连医科大学实验动物室进行，于 2015年 9月完成。
用于扩增 LSV16 kD 的百合病株、带有 His 标签的 pET-28a（+）表达载体由本学院植物转化实验室
保有；昆明小鼠（SPF 级）由大连医科大学动物实验中心提供；大肠杆菌 DH5α、DNA 片段回收试
剂盒、感受态制备试剂盒、质粒小量提取试剂盒、改良型 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、镍柱、碱
性磷酸酶标记羊抗鼠 IgG 购自生工生物工程（上海）有限公司；pMDTM18-T 载体、限制性内切酶等
购自宝生物（大连）有限公司。弗氏佐剂购自 Sigma 公司；大肠杆菌 BL21（DE3）感受态细胞购自
天根生化科技（北京）有限公司。引物合成和测序由生工生物工程技术（上海）有限公司完成。
1.2 16 kD 基因克隆和原核表达载体的构建
以感染 LSV 的百合病叶总 RNA 为模板进行 RT-PCR 扩增。根据 NCBI 上已经登录的 LSV-DL
的全基因组序列（GenBank 登录号：HM222522.1），利用 Genetool 软件设计出 16 kD 引物扩增序
列为：LSV 16 kD-F：CGGGATCCATG AGCGTCTGGGGAGTCT（下划线为 BamHⅠ酶切位点）；
16 kD-R：CGGAATTCTTATTTAGGTCTTAGGTAGAACTGGC（下划线为 EcoRⅠ酶切位点）。PCR
扩增产物与 pMDTM18-T 载体连接，转化感受态细胞 DH5α，阳性克隆经酶切鉴定后送华大基因测序。
用 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切目的片段与相同酶切位点的 pET-28 a（+）载体连接，转化大肠杆菌 BL21
（DE3）表达菌株，经双酶切鉴定正确。
1.3 融合蛋白的诱导表达和纯化
挑取单菌落接种于 LB 液体培养基中（100 μg · mL-1，Kan），37 ℃振荡过夜。将过夜培养物按
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1︰50 接种量扩大培养至 OD600 ≈ 0.5 时，取少量菌液作为空白对照，剩余菌液加入 IPTG（1
mmol · L-1），37 ℃诱导 6 h，取 1 mL 菌液 14 000 r · min-1，离心 3 min，沉淀用 100 μLPBS 重悬后，
再加入 1/5 体积上样缓冲液，沸水浴 10 min，SDS-PAGE 鉴定融合蛋白的表达。将表达融合蛋白的
菌液离心收集沉淀，用 PBS 缓冲液重悬，冰浴超声波裂解菌体细胞，4 ℃，12 000 r · min-1 离心 30 min，
取上清液制样，同时沉淀物用裂解缓冲液重悬后制样。
13 000 r · min-1 离心 10 min 收集破碎后的沉淀，并用盐酸胍溶解过夜。将溶解液 12 000 r · min-1
离心 20 min，上清液经 0.45 μm 滤膜除去不溶性物质后，按说明书操作步骤进行组氨酸镍柱亲和层
析。首先排出柱内酒精缓冲液，加入 5 ~ 10 倍树脂体积的 Ni-Denature-Urea buffer 平衡柱子，再加
入溶解的沉淀到柱子中，以 1 mL · min-1 的流速结合柱子。用 5 ~ 10 倍树脂体积的 Ni-Denature-Urea
buffer 来洗脱未与 Ni-NTA 结合的杂蛋白至柱平衡为止；加入 5 ~ 10 倍树脂体积的 Ni-Denature-250
buffer，收集液按说明书步骤采用改良型 Bradford 法测定纯化蛋白浓度并进行 SDS-PAGE 分析。表
达蛋白质谱分析正确后，过滤除菌并置于–20 ℃保存备用。
1.4 抗血清制备及鉴定
取 8 只 6 ~ 8 周龄的雌鼠，体重约 18 ~ 20 g，进行 4 次免疫。其中 6 只免疫纯化 16 kD 蛋白，2
只免疫 PBS 作空白对照。初次免疫取纯化蛋白按 1︰1 比例加入弗氏完全佐剂，振荡器充分乳化后，
采用腹腔注射，每只免疫剂量约 0.5 mL。间隔 2 周进行加强免疫，共 3 次，每次间隔 1 周。加强免
疫选用弗氏不完全佐剂。末次免疫 3 d 后，进行眼静脉丛取血。血清 37 ℃放置 2 h，4 ℃过夜。次日
10 000 r · min-1，离心 10 min，取上清液，置–20 ℃保存备用。间接 ELISA 测定抗血清效价。
以纯化蛋白作为抗原包被酶标板，将抗血清进行一系列倍比稀释后作为一抗，辣根过氧化物酶
标记的羊抗鼠 IgG 为二抗进行 Western blot 分析，蛋白样加入 1/5 体积 2× SDS 上样缓冲液，沸水浴
10 min，取 20 μL 样品在 12%分离胶上进行 SDS-PAGE。将上述蛋白样分别转至 PVDF 膜上，以脱
脂牛奶封闭，TBST 洗涤后，加入 1︰200 制备的抗血清室温振荡 1 h。TBST 洗涤 3 次后，加入 1︰1 000
碱性磷酸酶标记羊抗鼠 IgG，37 ℃孵育 1 h，洗涤后采用 ECL 显色以验证抗血清特异性，进一步用
制备的抗血清对感染 LSV 的百合病样进行 ELISA 检测，同时结合 RT-PCR 检测来验证 16 kD 抗血
清的准确性。
2 结果与分析
2.1 LSV16 kD 片段的扩增
如图 1 所示，RT-PCR 扩增产物约为 423 bp，与 16 kD 基因片段预期大小相符。该片段克隆到
pMDTM18-T 载体上，测序结果与 NCBI 序列一致，表明所得片段确为百合 16 kD 基因，并且开放阅
读框（ORF）及酶切位点均正确。
2.2 原核表达载体的构建
对重组质粒 pET-16 kD 进行 BamHⅠ和 EcoRⅠ双酶切验证，酶切产物与预期 423 bp 片段大小一
致，表明原核表达载体构建成功（图 2），测序结果也证明片段序列正确，可用于后续的表达试验。


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2.3 融合蛋白的诱导表达及纯化
将鉴定正确的阳性克隆质粒转化进 BL21（DE3）大肠杆菌，诱导表达蛋白进行 SDS-PAGE 电
泳。结果显示：pET 重组菌的泳道在约 20 kD 处可见 1 条明显的蛋白条带（pET·His 标签蛋白大小
约为 4 kD），与预期蛋白大小 20 kD 基本相符（图 3）。对表达的宿主菌收集进行超声波破碎后，
发现 16 kD 重组蛋白均在沉淀中，主要以包涵体形式存在。经镍柱纯化后进行 SDS-PAGE 检测，成
功得到纯化的蛋白（图 4）。纯化蛋白经 Bradford 法测定，其纯度达到了制备抗血清的要求，用作
后续试验。








2.4 16 kD 抗血清的制备及鉴定
将纯化后的融合蛋白用 KCl 染色法将目的条带切下并研磨成粉末，作为抗原免疫昆明小鼠，获
图 1 百合无症病毒 16 kD RT-PCR 扩增产物
Fig. 1 RT-PCR products of LSV16 kD

图 2 重组质粒 pET-16 kD 双酶切验证
Fig. 2 Plasmid pET-16 kD by enzyme digestion
图 3 LSV16 kD 基因原核表达的 SDS-PAGE
M：蛋白质分子量标准；1：未诱导 16 kD 蛋白；
2：诱导 16 kD 蛋白。
Fig. 3 SDS-PAGE analysis of LSV16 kD gene
expression in E. coli
M：Protein molecular weight marker；1：Protein of non-induced
E. coli transformed with pET28-16 kD；2：Protein of induced
E. coli transformed with pET28-16 kD.
图 4 LSV16 kD 融合蛋白纯化的 SDS-PAGE
M：蛋白质分子量标准；1：16 kD 蛋白上清液；
2：16 kD 蛋白沉淀。
Fig. 4 SDS-PAGE analysis of LSV16 kD purified fusion protein
M：Protein molecular weight marker；1：Lysis supernatant of induced
E. coli transformed with pET28-16 kD；2：Bacterial body
of 16 kD fusion protein.
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图 5 LSV16 kD 蛋白抗血清 Western-blot 分析
M：蛋白质分子量标准；1：阴性血清与融合蛋白 16 kD；
2：16 kD 抗血清与未诱导的 16 kD；
3：16 kD 抗血清与融合蛋白 16 kD。
Fig. 5 Western-blot analysis of the antiserum
M：Protein molecular weight marker；1：Negative serum and fusion
protein 16 kD；2：16 kD antiserum and un-induced 16 kD；
3：16 kD antiserum and fusion 16 kD.

得抗血清，通过 ELISA 测定效价达到 1︰10 000
以上。
以表达的融合蛋白 16 kD 为抗原，以抗血清
为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体为二
抗，进行 Western blot 分析，表明制备的抗体能
够特异识别诱导表达的 16 kD 目的蛋白（图 5）。
2.5 百合无症病毒 Western blot 检测
以侵染百合无症病毒的百合为抗原，以制备
得到的抗血清为一抗，辣根过氧化物酶标记的羊
抗鼠抗体为二抗，对本实验室采集的 6 株百合病
样叶片进行 ELISA 分析，结果（图 6）表明，
侵染百合无症病毒的样品出现黄色显色反应，健
康百合叶片样品以及空白对照无显色反应。上述
结果说明制备的抗血清能够识别 16 kD 蛋白，可
用于百合无症病毒检测。


图 6 侵染 LSV 百合病叶的 ELISA 检测
1 ~ 6：LSV 百合病叶；7：纯化的 LSV16 kD 融合蛋白；8：健康百合叶；9：包被缓冲液阴性对照。
Fig. 6 ELISA detection of LSV in lily
1–6：LSV lily samples；7：LSV16 kD fusion protein purified；8：Healthy leaves of lily；
9：Coating buffer control.

RT-PCR 检测也获得相同结果（图 7），说明制备的 LSV16 kD 抗血清准确性可靠。


图 7 侵染 LSV 百合病叶的 RT-PCR 检测
M：DL2000 DNA 分子标准；1 ~ 6：LSV 百合病叶；7：LSV16 kD 阳性样品对照；8：健康百合叶阴性对照。
Fig. 7 RT-PCR detection of LSV in lily
M：DL2000 DNA marker；1–6：LSV lily samples；7：LSV16 kD；
8：Healthy leaves of lily.
冀文婕，张郑瑶，徐品三.
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3 讨论
随着分子生物学技术的发展，利用大肠杆菌表达外源蛋白来大量获得目的基因蛋白已成为一项
最经济有效的实验技术（李燕，2005）。将其在原核细胞中进行大量表达后，进行免疫原性、空间
结构等方面的研究，是目前比较常用的一种研究方法（肖艳 等，2014）。大量研究证明，百合无症
病毒是危害百合种植业发展的主要瓶颈，建立一种快速可靠的检测技术对于控制该病毒的传播和蔓
延尤为重要。血清学方法具有灵敏、快速、适合大量样品检测等特点，在植物病毒检测中得到广泛
应用（李娜，2015）。一般抗血清制备，多为制备外壳蛋白抗体（沈嘉乐 等，2007；赵芹 等，2012）。
本研究中通过克隆 16 kD 基因、原核表达以及纯化融合蛋白，成功制备了百合无症病毒 16 kD 抗血
清，尚属首次。该结果不仅应用于百合无症病毒的检测，而且为本实验室后续的 16 kD 蛋白沉默抑
制子功能研究、细胞学定位以及利用酵母双杂交技术研究 16 kD 蛋白的互作奠定了基础。本研究检
测结果发现，该抗血清检测病毒的灵敏度略低于 LSV CP 的抗血清，可能是由于 CP 作为病毒粒子
组装的主要部分，在植物体内的积累量高于 16 kD 蛋白的表达量。因此，如果单纯以生产上检测病
毒为目的，应以外壳蛋白制备抗血清。通过抗血清和 RT-PCR 检测百合植株发现，被检测的 6 株样
品中均检测出病毒，说明制备的 16 kD 抗血清特异性强，准确性高，可以用作后续的研究。从而证
明了利用大肠杆菌表达外源蛋白来制备抗体是一种既简便又经济有效的方法。本研究中利用
pET-28a（+）载体表达的 16 kD 融合蛋白产物均存在于沉淀中，推测是因为带 His 标签的载体容易
形成包涵体。
至今为止，对于百合无症病毒的研究主要集中在病原学，病毒检测以及该病毒编码蛋白生物信
息学研究等内容（Choi & Ryu，2003；Xu et al.，2011；徐品三 等，2013）。随着生物技术的不断深
入，植物病毒蛋白功能研究已经成为人们关注的热点，但是百合无症病毒编码的各种蛋白功能的研
究尚处于空白。16 kD 基因在 LSV 全基因组中所处的位置、结构和大小均具有特殊性，作者推测该
基因在病毒侵染寄主、体内复制以及转运过程中会起到关键作用。本研究对百合无症病毒未知蛋白
16 kD 进行克隆表达与抗血清制备，旨在为今后 16 kD 基因的功能研究奠定基础，同时也为探索百
合无症病毒致病机理开辟新的思路。

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