全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（2）：323–332 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–10–08；修回日期：2012–01–03
基金项目：上海农业科学技术成果及高新技术产业化项目（沪农科产字[2004]第 3 号）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lzl@njau.edu.cn）
荷花 NnNHX1 基因耐盐性在转化烟草中的验证
郭会敏，顾春笋，陈发棣，徐迎春，刘兆磊*
（南京农业大学园艺学院，南京 210095）
摘 要：为研究荷花液泡膜型 Na+/H+逆向转运蛋白基因 NnNHX1 的耐盐性，构建了植物表达载体
pCAMBIA1301-220-NnNHX1，并通过农杆菌介导的叶盘转化法将 NnNHX1 基因转入烟草。利用荧光定量
PCR 分析 NnNHX1 在转基因烟草中的表达情况。对转基因烟草进行盐胁迫试验，并测定其在盐胁迫条件下
叶绿素、脯氨酸和丙二醛含量、相对电导率、SOD 和 POD 活性等相关生理指标及后代种子的发芽率。结
果显示，在获得的 7 个转 NnNHX1 基因烟草株系中，T-N1、T-N2 和 T-N10 等 3 个株系 NnNHX1 表达量较
高。盐胁迫下，转基因烟草组培苗和盆栽苗的生长状况都好于对照植株，在叶绿素含量、脯氨酸含量、细
胞质膜的完整性（相对电导率和丙二醛含量）和抗氧化酶（SOD 和 POD）活性等方面都好于对照，并且后
代种子的发芽率也明显高于对照。表明荷花 NnNHX1 基因能够在烟草中正常翻译和表达，NnNHX1 的过量
表达提高了转基因烟草的耐盐性。
关键词：荷花；NnNHX1 基因；转基因；烟草；耐盐性
中图分类号：S 682.32 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）02-0323-10

Salt Tolerance Verification of Lotus NnNHX1 in Transformed Tobacco
GUO Hui-min，GU Chun-sun，CHEN Fa-di，XU Ying-chun，and LIU Zhao-lei*
（College of Horticulture，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）
Abstract：To study the salt tolerance of tobacco plants transformed with lotus vacuolar Na+/H+
antiporter gene NnNHX1，a plant expression vector pCAMBIA1301-220-NnNHX1 was constructed and
then was transformed into wild Nicotiana tabacum by Agrobacterium-mediated leaf disc transformation.
The expression of NnNHX1 in transgenic tobacco was detected by quantitative PCR analysis. Salt stress
test on transgenic tobacco and then the chlorophyll，proline and MDA content，relative conductivity，SOD，
POD and other physiological indexes and the generation rate of transgenic tobacco seed were measured in
salt stress condition. The results showed that among the seven transgenic tobacco strains，the expression of
NnNHX1 in T-N1，T-N2 and T-N10 strains was higher. Under salt stress，the growth conditions of both
tissue culture seedlings and potted seedlings of transgenic tobacco were better than control tobacco. The
chlorophyll and proline content and cell membrane integrity（relative conductivity and MDA）and
antioxidant enzyme（SOD and POD）activity in transgenic tobacco were better than that of control
tobacco，and the transgenic tobacco seed germination was significantly higher than control. Indicated that
lotus NnNHX1 gene could normaly translated and expressed in tobacco，and over expression of NnNHX1

324 园 艺 学 报 39 卷
enhanced salt tolerance of transgenic tobacco.
Key words：lotus；NnNHX1 gene；transgenic；tobacco；salt tolerance

盐胁迫严重扰乱植物细胞内的离子平衡，致使细胞膜功能受损和代谢活动减弱（Niu et al.，1995；
Hasegawa et al.，2000；Xiong & Zhu，2002）。植物经过长期的适应和进化逐渐形成了一系列的调节
机制应付外界的盐胁迫（Zhang et al.，2008），如通过 Na+/H+逆向转运蛋白基因 NHX1 调控将过多的
Na+区隔化于液泡中（Blumwald et al.，2000；周玲玲 等，2009）。因此，对 NHX1 基因的耐盐特性
进行深入的研究有着重要的意义。Apse 等（1999）在拟南芥中过量表达拟南芥 AtNHX1 基因可以使
转基因植株在 200 mmol·L-1 NaCl 的胁迫下正常生长；Zhang 等（2001）在油菜中转入 AtNHX1 基因，
发现其不但可以在高盐环境中正常生长，开花，结果，且产量和品质不受影响；将耐盐植物北滨藜
的 AgNHX1 基因转入水稻经过量表达其耐盐性是对照植株的 8 倍（Ohta et al.，2002）；在烟草中过
量表达油菜 BnNHX1 基因（Wang et al.，2004）、大麦 HbNHX1 基因（Lü et al.，2005）和獐茅 AlNHX1
基因（张高华 等，2008）等都可以显著提高转基因植株的耐盐性。荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）
为水生观赏植物，多生长于淡水湖泊区，耐盐性较差，但生长于温带沿海地带的‘冬荷’却有较强
的耐盐性，并且可以在一定程度上淡化海水（王其超和张行言，2005）。目前对‘冬荷’的研究较少，
尤其是耐盐特性更是缺乏研究。本研究中构建‘冬荷’NnNHX1 基因的植物表达载体，并通过农杆
菌介导的叶盘转化法获得转 NnNHX1 基因烟草植株，根据盐胁迫下转基因烟草的表型变化、叶绿素、
脯氨酸和丙二醛的含量、相对电导率、SOD 和 POD 的活性以及后代种子的发芽率等对转基因烟草
的耐盐性进行分析，为进一步研究 NnNHX1 基因功能提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
本试验于 2009 年 6 月至 2011 年 5 月在南京农业大学花卉遗传与育种实验室完成。供试荷花品
种‘冬荷’（Nelumbo nucifera Gaertn.‘Donghe’）取自南京艺莲苑花卉有限公司，烟草无菌苗由
本实验室保存。
植物双元表达载体 pCAMBIA1301-220 由南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室惠
赠并经本实验室改造，农杆菌 EHA105 感受态为本实验室制备并保存。
1.2 植物表达载体的构建
提取‘冬荷’总 RNA 并经反转录合成 cDNA，根据 NnNHX1 基因（登录号：AB501188）序列
设计 ORF 引物 EF-F 和 EF-R（分别含有限制性内切酶 SalⅠ和 KpnⅠ的酶切位点），经 PCR 扩增后
得到 NnNHX1 基因的 ORF 片段，将目的片段连接 T 载体并提取质粒。分别对 T-NnNHX1 质粒和植
物表达载体 pCAMBIA1301-220 质粒用 SalⅠ和 KpnⅠ进行双酶切，回收目的片段并用 T4 连接酶进
行连接。将连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，并经 LB/Kan 培养基筛选、检测后获得
pCAMBIA1301-220-NnNHX1 表达载体。
1.3 农杆菌介导的烟草转化
将经过预培养 3 d 的烟草无菌苗叶片于农杆菌 EHA105 菌液中浸泡 5 ~ 8 min，取出并吸去多余
菌液后接种于共培养培养基（MS + 6-BA 2.0 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1，pH 5.8），25 ℃培养 2 ~ 3 d；
然后转入筛选培养基（MS + 6-BA 2.0 mg · L-1 + NAA 0.1 mg · L-1 + Hyg 30 mg · L-1 + Cb 500 mg · L-1，
2 期 郭会敏等：荷花 NnNHX1 基因耐盐性在转化烟草中的验证 325

图 1 荷花 NnNHX1 基因 ORF 片段 PCR 结果
M：DNA ladder marker；1：目的片段。
Fig. 1 The PCR amplification of NnNHX1 gene
M：DNA ladder marker；1：PCR product.
pH 5.8），于 25 ℃下光照培养，1 个月后继代培养 1 次，直至分化出抗性芽；待抗性芽长至 3 ~ 5 cm
时，剪下并转入生根培养基（1/2MS + IBA 0.1 mg · L-1 + Hyg 30 mg · L-1 + Cb 200 mg · L-1，pH 5.8）
中诱导生根。
1.4 转基因烟草的鉴定
选取正常绿色的烟草抗性植株分别提取基因组 DNA 和总 RNA，并将总 RNA 经反转录合成
cDNA。分别以基因组 DNA 和 cDNA 为模板，以潮霉素特异引物 Hyg-F、Hyg-R 和 NnNHX1 基因特
异引物 EF-F、EF-R 进行 PCR 检测。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 5 min；94 ℃变性 1 min，55 ℃
退火 1 min，72 ℃延伸 1 min，35 个循环；然后 72 ℃延伸 10 min。
1.5 NnNHX1 在转基因烟草中的表达
分别提取转基因株系和对照株系烟草的总 RNA 并反转录后合成 cDNA。以烟草肌动蛋白基因
actin 的引物 Actin-F、Actin-R 为内参引物，以 NnNHX1 基因的非保守区引物 qRT-F1、qRT-R1 及保
守区引物 qRT-F2、qRT-R2 为特异引物进行 qRT-PCR。反应程序为：95 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 15
s、72 ℃ 45 s，40 个循环；然后 72 ℃ 10 min。设定一阈值并得到各个反应的 CT 值，根据 2-ΔΔCT 法
（Livak & Schmittgen，2001）得出转基因烟草中 NnNHX1 基因与总 NHX1 基因的相对表达量。

表 1 试验中用到的引物
Table 1 Primers used in this experiment
名称
Name
序列（5′→3′）
Sequence
名称
Name
序列（5′→3′）
Sequence
EF-F ACGCGTCGACATGGCTTTAGGTTCTGTT EF-R CGGGGTACCCCATGGATGTACACTCCG
Hyg-F CGTCTGTCGAGAAGTTTC Hyg-R TACTTCTACACAGCCATC
actin-F GTGACAATGGAACTGGAATGG actin-R AGACGGAGGATAGCGTGAGG
qRT-F1 TGCTGCTGCTCTCTCTCTCT qRT-R1 CGAACCCAAATTCGAATCAA
qRT-F2 GGGAGTGGTTACTGGTCTGC qRT-R2 ATGACAATGTCGCAAAAGCA
1.6 转基因烟草耐盐性分析
将株高约为 2 cm 的转基因烟草组培苗与对照苗分别转至 NaCl 浓度为 0、100 和 200 mmol · L-1
的 MS 培养基上培养 3 周，进行耐盐性观察。另将转基因株系和对照烟草组培苗移栽于温室基质中
自然生长 1 个月，然后分别用含 0、100 和 200 mmol · L-1 NaCl 的营养液进行盐胁迫处理 7 d，观察
其表型变化（每处理设 3 次重复，每重复 3 株苗），并测定叶片中叶绿素、脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）
含量、相对电导率（REC）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性等生理指标。收
集转NnNHX1基因烟草T1代种子并将其和对照烟草的种子分别播种于含0、100、150和200 mmol · L-1
NaCl 的培养皿中，于光照培养箱中进行培养，2 周后观察并统计种子的发芽情况。每处理重复 3 次，
每个培养皿中播 20 粒种子。
2 结果与分析
2.1 荷花 NnNHX1 基因表达载体的构建
通过 PCR 扩增获得 5′端和 3′端分别含有
SalⅠ和 KpnⅠ酶切位点的荷花 NnNHX1 基因
ORF 全长约 1 600 bp 的片段（图 1），连接 T 载
326 园 艺 学 报 39 卷
图 4 转基因烟草中 NHX1 基因的表达情况
Fig. 4 The expression of NHX1 of transgenic tobacco plants
体后对重组子克隆进行测序，结果表明，克隆片段的序列与 NnNHX1 基因 ORF 序列完全一致。将目的
基因片段和表达载体片段连接并转化后进行 PCR 和酶切检测，结果表明 NnNHX1 基因已正确插入到
表达载体中，荷花 NnNHX1 基因的表达载体 pCAMBIA1301-220-NnNHX1 构建成功（图 2）。

图 2 pCAMBIA1301-220-NnNHX1 表达载体示意图
Fig. 2 Construction of plant expression vector pCAMBIA1301-220-NnNHX1

2.2 转荷花 NnNHX1 基因烟草的获得和鉴定
通过农杆菌介导的叶盘转化法将 NnNHX1 基因转化烟草，经潮霉素和羧苄青霉素筛选培养后获
得 14 株抗性苗。潮霉素基因引物进行 PCR 检测显示，在 14 株抗性苗中有 7 株能够扩增出约 900 bp
的特异条带（图 3，A）；进一步用荷花 NnNHX1 基因 ORF 全长序列引物进行 PCR 检测，在 14 株抗
性苗中有 7 株抗性苗可以扩增出目的基因片段，且株系与潮霉素基因检测结果一致（图 3，B），因
此确定此 7 株抗性苗为转基因株系，并分别标注为 T-N1 ~ T-N5、T-N9 和 T-N10，而其他抗性苗推
测应为假阳性苗。
图 3 抗性苗潮霉素基因引物（A）和 NnNHX1 基因引物（B）PCR 检测
M：DNA ladder marker；CK+：阳性对照；CK–：阴性对照；1 ~ 14：抗性植株。
Fig. 3 PCR analysis of resistant tobacco plants by primers of Hyg（A）and NnNHX1（B）
M：DNA ladder marker；CK+：Positive control；CK–：Negative control；
1–14：Resistant plants.
2.3 转荷花 NnNHX1 基因烟草中 NHX1 基因
的表达情况
荧光定量 PCR 分析显示（图 4），正常的
生长条件下 NHX1 基因在对照植株和转基因烟
草株中都有表达，但特异性的荷花 NnNHX1 基
因只在转基因植株中能够检测到，说明荷花
NnNHX1 基因已成功导入并融合到烟草基因组
中；但同时可以看出，在不同转基因株系中荷
花 NnNHX1 基因的表达量差异较大，其中
2 期 郭会敏等：荷花 NnNHX1 基因耐盐性在转化烟草中的验证 327

T-N1、T-N2 和 T-N10 株系 NnNHX1 基因的表达水平相对较高，分别为总 NHX1 的 26.5%、28.8%和
32.9%。
2.4 转荷花 NnNHX1 基因烟草的耐盐性检测
在无盐胁迫时对照植株和转基因株系的组培苗都能够很好地生长，茎叶健壮，根系发达（图 5，
A、D）；NaCl 浓度为 100 mmol · L-1 时，对照植株和转基因植株的生长都有所减缓，但转基因植株
地上部和地下部的生长量都大于对照植株（图 5，B、E）；NaCl 浓度为 200 mmol · L-1 时，对照植株
几乎无法生根，地上的茎叶完全黄化，濒临死亡；而转基因植株虽然生长更为缓慢，但根、茎、叶
仍能较为正常地发育（图 5，C、F）。对盆栽苗进行盐胁迫处理表明，转基因烟草在 0、100 和 200
mmol · L-1 时生长状况良好，茎叶舒展且绿色正常，无明显受损；而对照植株在 100 mmol · L-1 NaCl
胁迫下其基部叶片出现轻微的萎蔫，当盐胁迫浓度增至 200 mmol · L-1 时基部叶片严重下垂，萎蔫更
为严重（图 5，G ~ I）。

图 5 转基因烟草组培苗（A ~ F）和盆栽苗（G ~ I）耐盐性检测
左：对照植株；右：转基因植株（T-N10）。
Fig. 5 The salt-tolerance analysis of transgenic tobacco（tissue culture and potted seedlings）
Left：Control plant；Right：Transgenic plant（T-N10）.

盐胁迫后对照和转基因植株体内的总叶绿素含量较无盐胁迫植株的低，但与对照株相比，200
mmol · L-1 胁迫下转基因植株叶绿素含量仍相对较高（图 6，A）。无盐胁迫时植株脯氨酸的含量差异
不大，盐处理之后都有所上升，转基因植株明显高于对照植株（图 6，B）。正常生长条件下，对照
和转基因植株 MDA 含量及相对电导率都大致相同，无明显差异，随着盐胁迫浓度变大，两个指标
328 园 艺 学 报 39 卷
都显著增加，但各转基因株系都显著低于对照植株，说明膜损伤程度较轻（图 6，C、D）。在盐胁
迫处理后，各烟草植株体内 SOD 的活性都明显上升，且转基因植株明显高于对照植株（图 6，E）。
同样，POD 活性在盐胁迫后也显著增强，转基因植株明显高于对照植株，如在 200 mmol · L-1 时转
基因株系是无胁迫时的 2.01 倍，而对照植株则是正常生长条件下的 1.49 倍（图 6，F）。

图 6 转基因烟草盆栽苗生理指标测定
Fig. 6 Physiological determination of transgenic tobacco plants（potted seedlings）
P < 0.05.

在盐胁迫下各烟草植株种子的萌发受到明显的影响，发芽率随着盐胁迫程度的加重而降低；但
与对照相比，各转基因植株的种子发芽率较高，尤其是高浓度胁迫时更为明显，如150 mmol · L-1 NaCl
条件下，转基因株系 T-N1、T-N2 和 T-N10 的发芽率分别为 48.3%、46.7%和 46.7%，而对照发芽率
只有 20%（图 7）。

2 期 郭会敏等：荷花 NnNHX1 基因耐盐性在转化烟草中的验证 329


图 7 NaCl 胁迫下烟草种子发芽率
Fig. 7 The germination rate of tobacco seeds under NaCl stress
3 讨论
液泡膜型 Na+/H+逆向转运蛋白基因 NHX1 在植物抵抗盐害方面有着举足轻重的作用（Apse et
al.，1999；Zhang & Blumward，2001；Zhang et al.，2001；Ohta et al.，2002；Xue et al.，2004；Yin
et al.，2004；Chen et al.，2007），本试验中对 NnNHX1 基因表达量较高的 3 个转基因烟草株系进行
了研究，结果与其他 NHX1 基因如獐茅 AlNHX1、苜蓿 xmNHX1 等在烟草中过量表达的作用基本一
致（Wang et al.，2004；Lü et al.，2005；王景艳，2006；张高华 等，2008）。
盐胁迫可引发植物细胞内叶绿素的降解，使光合活动受到影响（Parida & Das，2005；左志锐 等，
2006），对植物的生长和发育造成严重损害（Jiang et al.，1994），因此，保持较高的叶绿素含量是植
物耐盐的重要指标和机理之一（Smillie & Nott，1982）。本研究中发现各转基因烟草叶绿素含量虽有
下降但仍明显高于对照，表明转基因烟草在盐胁迫下仍能保持较高的光合效率。盐胁迫下植物体内
有机渗透调节物质脯氨酸的生物合成被明显激活（Friedman & Altman，1989），虽然有研究认为脯
氨酸的积累是植物遭受盐胁迫伤害之后的结果（吕芝香和王正刚，1993），但通常认为盐胁迫后脯氨
酸的大量积累是植物细胞适应逆境的行为和结果，这与本研究中各植株体内脯氨酸的变化趋势吻合。
植物的细胞膜系统在盐胁迫下会受损，膜的结构和完整性会被破坏，通透性增大，导致物质渗
漏和交换失衡（余叔文和汤章城，1998），所以，膜脂过氧化的主要产物之一丙二醛（MDA）的含
量和细胞内电解质的相对外渗率可以衡量植物在盐胁迫下受伤害的程度（余叔文和汤章城，1998；
刘爱荣 等，2006）。有研究表明盐胁迫下植物体内 MDA 的含量会逐渐增加（袁琳 等，2005），且
相对电导率也会变大（李合生 等，2000），但耐盐性越强的植物其数值变化越小。本试验中这两个
指标在各烟草植株中都有不同程度的升高，但总体结果仍与王景艳（2006）、张高华等（2008）相似，
盐胁迫下各转基因株系在保持细胞膜的完整性方面明显好于对照植株。
植物体内 SOD、POD 等酶促脱氧机制会在遭受盐胁迫后启动，通过清除体内积累的活性氧来保
持膜正常的结构和功能（Mittler，2002），如SOD可以催化超氧化物阴离子生成H2O2和O2（Scandalios，
1993），POD 可以进一步将植物体内的 H2O2 清除，有利于减轻 H2O2 的积累而对细胞造成的氧化损
伤（Bor et al.，2003），且保持抗氧化酶的高活性是增强植物耐盐性的重要途径之一（Hernandez et al.，
2000；韩冰 等，2010），所以，SOD 和 POD 等酶活性的大小也常作为植物耐盐性的重要指标。本
研究中，各烟草植株的 SOD 和 POD 活性在盐胁迫后都明显上升，且转基因株系两种酶的活性都高
于对照植株；此外，在高浓度（200 mmol · L-1）时对照植株体内的 SOD 活性开始出现下降的趋势，
330 园 艺 学 报 39 卷
而转基因植株的 SOD 活性仍保持上升的势头，这一现象可能与 H2O2 积累过量反馈抑制 SOD 有关
（Halliwell & Gutteridge，1984；Niyogi，1999）。
盐胁迫会破坏种子内细胞膜的结构和功能，致使代谢紊乱，活力下降甚至不能萌发（贺军民 等，
2000）。本试验中各转基因烟草种子的发芽率明显高于对照植株，这与曾光（2010）转苜蓿 xmNHX
基因烟草的数据基本一致。虽然本试验中未对盐胁迫影响种子发芽的原因进行研究，但根据已知的
相关理论和观点（Levitt，1980；阎顺国 等，1994；杨秀玲 等，2004）排除可能的干扰因素后可以
肯定的是过量表达 NnNHX1 基因提高了转基因烟草的耐盐性。

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332 园 艺 学 报 39 卷
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中国园艺学会 2012 年学术年会暨
庆祝《园艺学报》创刊 50 周年—园艺学进展论坛
征文通知
“中国园艺学会 2012 年学术年会暨庆祝《园艺学报》创刊 50 周年—园艺学进展论坛”将于 2012 年 10 月在西
安举行，即日起征集：①研究论文摘要，②有关园艺学进展的综述文章。经审查合格的摘要和综述将分别收入“中
国园艺学会 2012 年学术年会论文摘要集”和“庆祝《园艺学报》创刊 50 周年—园艺学进展论坛专辑”，并于会前以
《园艺学报》增刊形式分别出版。
征文内容：有关果树、蔬菜、西瓜甜瓜、观赏园艺植物及其它园艺植物的种质资源、遗传育种、生物技术、栽
培技术与生理、采后技术与生理等方面未曾发表过的研究论文摘要和文献综述。
投稿要求：请于 2012 年 6 月 15 日前将稿件（在题目前注明“论文摘要集”或“园艺学进展专辑”字样）一式
两份寄送到：北京中关村南大街 12 号《园艺学报》编辑部（邮编 100081），并发送电子文件至：ivfyyxb@mail.caas.net.cn，
同时请交纳审理费 300 元（汇款地址：北京中关村南大街 12 号中国农业业科学院蔬菜花卉所，邮编 100081，收款
人：《园艺学报》编辑部）。对于录用的稿件，将及时通知作者，未录用的稿件恕不退稿。联系电话：010-62192388。
写作要求：
“园艺学进展论坛专辑”的稿件篇幅不限，写作格式请参照《园艺学报》的文献综述类文章。
“论文摘要集”的稿件每篇限 A4 纸 1 页（单倍行距），不写英文和参考文献，不用图表，写作格式如下：
摘要题目□□□□□□□（黑体，2 号字）
作者姓名□□□，□□□，□□□（仿宋，4 号字）
（作者单位□□□□□□□□□□□，城市名□□ 邮编□□□□□□）（宋体，小 5 号字）
目的与意义□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
□□□□□□□□□□□□□□□□□□（宋体，5 号字）
材料与方法□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
□□□□□□□□□□□□□□□□□□（宋体，5 号字）
结果与分析□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□□
□□□□□□□□□□□□□□□□□□（宋体，5 号字）
关键词：
中图分类号：（由编辑部填写） 文献标识码：A 文章编号：0513-353X
基金项目：
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中国园艺学会 2012 年 2 月 15