全 文 ：园 艺 学 报 ， （ ）： – 2014 41 11 2169 2178 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–06–27；修回日期：2014–09–12
基金项目：国家现代农业产业技术体系建设专项资金项目（CARS-28）
P苹果 GIP基因部分家族成员启动子的克隆与
功能分析
符聪慧，王建平，张 冲，马锋旺，张军科*
（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）
摘 要：根据已发表的苹果基因组序列设计特异引物，克隆了苹果（Malus × domestica Borkh.）品种
‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’中 PGIP 家族基因 PGIP1 和 PGIP2 的启动子片段，序列分析结果表明 PGIP1
与 PGIP2 启动子序列相似度为 71%，‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’的 PGIP1、PGIP2 启动子相似度都达到了
99%。两个品种 PGIP1 启动子中 TATA-box 和 CAAT-box 的数量明显多于 PGIP2，PGIP1 和 PGIP2 启动
子分别存在茉莉酸甲酯和水杨酸响应元件，暗示 PGIP1 和 PGIP2 存在不同的抗病响应途径。构建了启动
子︰︰GUS 融合表达载体，通过对农杆菌介导法转化烟草叶片中的 GUS 活性分析，比较了不同启动子的活
性。结果表明：PGIP1 启动子活性在品种间差异不显著；PGIP2 启动子活性在品种间差异显著，‘秦冠’
是‘太平洋玫瑰’的 2.37 倍，可能与品种抗病性差异有关；同一品种中 PGIP1 启动子活性显著高于 PGIP2。
关键词：苹果；PGIP 基因；启动子；顺式作用元件
中图分类号：S 661.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）11-2169-10

Cloning and Function Analysis of Part of PGIP Gene Family Member
Promoters from Apple
FU Cong-hui，WANG Jian-ping，ZHANG Chong，MA Feng-wang，and ZHANG Jun-ke*
（College of Horticulture，Northwest A & F University，Yangling，Shaanxi 712100，China）
Abstract：Primers were designed according to the published sequence of the apple genome and two
PGIP gene promoters of Malus× domestica Borkh.‘Qinguan’and‘Pacific Rose’were cloned. PGIP1 were
71% homology with PGIP2 gene promoters in both apple cultivar；Both PGIP1 and PGIP2 gene
promoters of‘Qinguan’and‘Pacific Rose’shared a sequence identity of 99%. PGIP1 promoters had more
TATA-box and CAAT-box than that of PGIP2 promoters，and PGIP1 gene promoters contained methyl
jasmonate-responsive elements，while PGIP2 gene promoters owed salicylic acid responsive elements. It’s
speculated that there are different disease response pathways of PGIP1 and PGIP2. PGIP promoter activity
were evaluated by promoter︰︰GUS fusion expression in transgenic tobacco leaves and the results showed
that the PGIP1 promoters activity was not significant between cultivars while PGIP2 promoter of
‘Qinguan’was higher than that of‘Pacific Rose’，and the former’s activity was 2.37 folds of the latter，
which was probably related to the resistance difference. In the same apple cultivar，PGIP1 gene promoters’

* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhangjk@nwsuaf.edu.cn）
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activities were significantly higher than that of PGIP2.
Key words：apple；PGIP gene；promoter；cis-acting element

多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（Polygalacturonase inhibiting proteins，PGIP）作为植物中普遍存在
的抗病蛋白，能与植物病原真菌分泌的内切多聚半乳糖醛酸酶（PG）特异性结合，抑制病原 PG 酶
的水解活性，减少植物细胞壁裂解，维护细胞壁的完整性，使病原真菌因营养不足导致生活力和繁
殖力下降（高国庆 等，2005；Maulik et al.，2009）。同时寡聚半乳糖醛酸的积累，诱导植物其它抗
病基因的表达，增强了植物的抗病性（高国庆 等，2005；王晓利 等，2008；熊帅 等，2010）。苹
果中可能存在两个以上的 PGIP 基因拷贝（Velasco et al.，2010）。Oelofse 等（2006）研究指出‘澳
洲青苹’基因组中存在两个 PGIP 基因克隆。同属同种植物的 PGIP 基因序列相似性较高，编码的蛋
白质产物序列几乎没有变化。‘嘎啦’与‘富士’苹果 PGIP 基因序列同一性高达 99%以上，编码的
蛋白质序列仅有一个氨基酸差异，且这个氨基酸突变位于 LRR 保守序列和两端的半胱氨基酸保守氨
基酸之外（石玉 等，2010；熊帅 等，2010）。因此，PGIP 基因序列差异不足以阐释 PGIP 家族成
员间的表达差异，也不足以解释不同品种间 PGIP 活性的差异。
启动子是最重要的一种转录调节因子，是控制基因表达开启的核心，克隆基因启动子序列并对
其中的序列特征进行分析，是了解基因转录调控表达模式及其调控机制的关键。目前许多研究者从
不同植物中克隆分离 PGIP 基因（D’Ovidio et al.，2006；Di et al.，2009；Hu et al.，2012；贾庆利 等，
2012），但是关于 PGIP 启动子的研究较少，仅有关于菜豆（Devoto et al.，1998）、葡萄（Joubert et al.，
2013）、中国李（李广平 等，2009）、梅（李广平 等，2010）、桃（王秀云 等，2011，2012）等 PGIP
基因启动子的报道。Mota 等（2000）克隆了两个苹果 PGIP 基因启动子，但并没有对这两个启动子
进行具体的序列比较和功能差异分析。
本研究中克隆了苹果中 PGIP 基因家族不同成员的启动子序列，进行顺式作用元件预测分析，
构建植物融合表达载体，瞬时转化烟草进行启动子活性验证，进而初步探明 PGIP 基因不同成员的
启动子序列和活性差异，揭示 PGIP 基因的转录调控模式，探讨 PGIP 基因表达调控与抗病性的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
试验于 2013 年 7 月至 2014 年 3 月在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室完
成。采集定植于西北农林科技大学园艺试验场的苹果（Malus × domestica Borkh.）品种‘秦冠’和
‘太平洋玫瑰’的叶片用于 PGIP 基因启动子的克隆。大量前期研究证实‘秦冠’对褐斑病（病原
菌 Marssonina coronaria）的抗性显著高于‘太平洋玫瑰’。
将烟草（Nicotiana tabacum L.）‘NC89’种子消毒后于 MS 培养基中在光照 16 h/黑暗 8 h，20 ℃
条件下培养 6 ~ 7 周，用于农杆菌介导的瞬时转化分析。
工程菌 E. coli Top10 和根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105 由本实验室保存。植
物瞬时表达载体 pC0390-GUS 和 pC35S-GUS 由旱区作物逆境生物学国家重点实验室第一工作室提
供（Xu et al.，2010）。胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒和 DNA 聚合酶购自天根生化科技有限公司。
T/A 克隆载体 pMD19-T vector、DNA Ligation Kit Ver.2.1、限制性内切酶、反转录试剂盒 PrimeScriptTM
RT reagent Kit 和荧光定量试剂盒 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ均购自大连宝生物工程有限公司。Pfu
DNA 聚合酶购自 Thermo Fisher Scientific 公司。
11 期 符聪慧等：苹果 PGIP 基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析 2171
1.2 方法
1.2.1 PGIP启动子克隆 参考汤文开等（2007）的改良 CTAB 法提取苹果叶片基因组 DNA。根据
苹果基因组序列（Genome Database for Rosaceae，GDR）得到 6 个苹果 PGIP 基因序列，通过与 NCBI
中 EST 数据库进行 BLAST 比对，其中仅 PGIP 基因 MDP0000728753 和 MDP0000728755（分别标
记为 PGIP1 和 PGIP2）存在相应的表达序列标签，说明仅此两个基因能够正常转录表达，因此采用
嵌套 PCR 法（nested PCR，nPCR）克隆这两个基因编码区上游 2 000 bp 左右的 DNA 序列，用于 PGIP
基因启动子的研究。利用 Primer 5 软件设计嵌套 PCR 引物，由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成，
引物序列见表 1。将 PCR 扩增得到的目的条带回收后，通过 T/A 克隆连接到 pMD19-T 载体上构建
启动子克隆载体，转化大肠杆菌 Top10 感受态，通过菌落蓝白斑和菌落 PCR 筛选出阳性克隆，交由
北京奥科鼎盛生物科技有限公司对启动子序列进行测序。

表 1 引物序列和用途
Table 1 Sequence and usage of primers
用途
Usage
正向引物序列（5′→3′）
Forward primer sequence（5′→3′）
反向引物序列（5′→3′）
Reverse primer sequence（5′→3′）
PGIP1 外部 PCR Outer PCR of PGIP1 TGTTCAATGGATTTCGTGG GAGAGAGCGGGTTTTAGGA
PGIP2 外部 PCR Outer PCR of PGIP2 AGCGTGTGACATCCGTGAG GGAGGAGAAGAGTAGGGTTAGG
PGIP1 内部 PCR Inner PCR of PGIP1 TTTTATTTGTGGAGGCGAGATGACC TTTTAGGACGGAGGAGAAGAGTAGG
PGIP2 内部 PCR Inner PCR of PGIP2 CTTGAGTCAGTTTTGGTATGGTTG GGAGAAGAGTAGGGTTAGGGAGA
PGIP1 表达载体构建
Expression vector construction of PGIP1
CCCAAGCTTTTTTATTTGTGGAGGCGAG CGCGGATCCTGTTTTGGGTTTTGGTTGG
PGIP2 表达载体构建
Expression vector construction of PGIP2
CCCAAGCTTCTTGAGTCAGTTTTGGTATGG CGCGGATCCTGTTTTGGGTTTTGGTTGG

1.2.2 启动子生物信息学分析 将测序结果拼接获得 PGIP 基因上游启动子序列，利用 DNAMAN
（Ver. 6.0.3.99）软件进行序列比对，利用 NCBI 中的 BLAST（Altschul et al.，1997；http：//blast. ncbi.
nlm. nih. gov/）对两种PGIP基因启动子序列一致性进行分析，利用PlantCARE软件（http：// bioinformatics.
psb. ugent. be/webtools/plantcare/html/）进行启动子顺式作用元件预测分析。
1.2.3 启动子活性分析 以获得的启动子克隆载体为模板，用引入内切酶位点 BamHⅠ/HindⅢ的引
物（表 1）进行 PCR 扩增获得启动子片段，回收后进行 BamHⅠ/HindⅢ双酶切，将启动子片段定向
连接到植物瞬时表达载体 pC0390-GUS，构建启动子植物瞬时表达载体 pC0390-GUS-promoter（图 1），
并转化农杆菌获得转化菌。同时，转化 CaMV35S 启动子驱动的 pC35S-GUS 的烟草作为阳性对照，
以未转化的烟草作为阴性对照。组培室内培养 6 ~ 7 周的烟草 NC89 无菌苗用于启动子活性的瞬时表
达分析，参照 Sparkes 等（2006）的方法进行农杆菌菌液注射烟草叶片完成转化，具体操作步骤参
照徐伟荣（2010）的方法。取转化后的叶片用 X-Gluc 染色处理，并参照 Jefferson（1987）的方法进
行 GUS 荧光定量分析。
图 1 pC0390-GUS-promoter 植物表达载体 T-DNA 区示意图
Fig. 1 Schematic representation of T-DNA region of pC0390-GUS-promoter

1.2.4 PGIP基因表达分析 以‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’苹果为材料，取成熟的苹果叶片液氮速冻，
–80 ℃保存备用。采用喷施孢子悬浮液的方法，对‘秦冠’进行褐斑病接种处理，分别于接种后 24、

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48、72 和 144 h 取叶片用液氮速冻，–80 ℃保存备用。
叶片总 RNA 的提取参照周玉亭和王钰（2010）的改良 CTAB 法进行，按照反转录试剂盒说明
书完成 cDNA 的合成。实时荧光定量 PCR 反应在 iCycler iQ5 荧光实时定量 PCR 仪（Bio-Rad，USA）
上进行。以苹果 Actin 为内参基因，内参基因的引物序列与瞿振芳等（2013）报道的一致。根据已
知苹果基因组序列设计特异引物，PGIP1 的正向和反向引物序列为：5-GAACCACAAATTCACAT
CTCTCG-3，和 5-AGGCTTTCTTGATTTGTAGGAGG-3；PGIP2 的正向和反向引物序列为：5-CTTC
AACCACAAATTCACTATCTC-3和 5-TTTCTTGATTTGCAGGAGGAC-3。实时荧光定量 RT-PCR
反应体系、程序和数据分析参考瞿振芳等（2013）的方法。
2 结果与分析
2.1 苹果PGIP基因家族成员的启动子序列差异比较
克隆获得了‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’苹果的 PGIP1 和 PGIP2 基因的 4 个启动子序列，分别
为 QG1、QG2 和 PR1、PR2；大小分别为 2 104 bp、2 042 bp 和 2 105 bp、2 041 bp。序列对比结果
显示，得到的 4 个启动子（QG1、QG2 和 PR1、PR2）与苹果基因组中的序列一致性为 99%；两个
品种 PGIP1 基因的启动子（QG1 和 PR1）的序列一致性为 99%，仅有 4 个碱基的差异；两个品种
PGIP2 基因的启动子（QG2 和 PR2）的一致性为 99%，且这两个启动子–1 192 到–1 段完全一致，
差异仅在–1 192 上游。同一品种中不同 PGIP 基因的启动子（‘秦冠’的 QG1 和 QG2，‘太平洋玫
瑰’的 PR1 和 PR2）的一致性均为 71%。
2.2 苹果PGIP基因家族成员的启动子元件分析
经植物启动子元件分析软件 PlantCARE 预测，本研究获得的 4 个序列均存在大量顺式作用元件，
结果见表 2。4 个启动子序列都存在核心元件 TATA-box 和增强元件 CAAT-box，符合真核生物基因
启动子的基本结构特征。在两个苹果品种中，PGIP1 基因启动子中的 TATA-box 和 CAAT-box 的数
量都明显多于 PGIP2 基因启动子中的，同一基因的启动子中（QG1 和 PR1、QG2 和 PR2）的 TATA-box
和 CAAT-box 的数量相同或相近。
除基本的启动子结构元件外，PGIP 基因启动子中还存在 6 类元件：光调控元件、激素响应元件、
胁迫响应元件、器官特异性元件、特异代谢响应元件和其他响应元件。其他响应元件包括昼夜节律
和高转录水平作用元件。
在光调控元件中，4 个启动子中都含有 ATCT-motif、Box 4、Box I、GAG-motif、G-Box 和 Sp1，
但在数量上存在小的差异。PGIP1 基因启动子特有元件是 3-AF1 和 CATT-motif；PGIP2 基因启动子
特有的是 AT1-motif、ATC-motif、GATA-motif 和 I-box。
在激素响应元件中，4 个启动子都含有脱落酸响应元件 ABRE、乙烯响应元件 ERE；PGIP1 基
因启动子中还存在响应生长素诱导的 TGA-element 和响应赤霉素诱导的 TATC-box。
在胁迫诱导元件中，4 个启动子均存在厌氧诱导作用元件和响应干旱调控的 MYB 结合位点。
PGIP1 基因启动子中存在茉莉酸甲酯响应元件 CGTCA-motif 和 TGACG-motif，以及冷害和脱水响
应元件 C-repeat/DRE；而 PGIP2 基因启动子中存在水杨酸响应元件 TCA-element、热胁迫响应元件
HSE 和抗病和胁迫响应元件 TC-rich repeats。
在器官特异性元件中，4个启动子都含有根特异表达元件as-2-box、分生组织表达调控元件CAT-box、
胚乳表达相关元件 GCN4_motif 和 Skn-1_motif。在特异代谢调控元件中，除 PR2 外其它 3 个启动子
11 期 符聪慧等：苹果 PGIP 基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析 2173
都含有玉米醇溶蛋白代谢调控顺式元件 O2-site。其他响应元件中，只有 PGIP2 含有昼夜节律调控元
件 circadian、黄酮合成基因调控 MYB 结合位点 MBSⅡ和高转录水平作用元件 5UTR Py-rich stretch。
综上分析认为 PGIP 基因启动子具有诱导型启动子特征，并且 PGIP1 基因和 PGIP2 基因的启动
子有着各自不同的诱导响应模式。

表 2 PGIP 基因启动子序列中的顺式作用元件
Table 2 cis-elements in PGIP gene promoter sequences
各启动子中元件数量
Numbers of cis-element 顺式元件 cis-element
功能
Function
QG1 PR1 QG2 PR2
CAAT-box 启动子和增强子区域调控元件
Common cis-acting element in promoter and enhancer regions
56 56 48 50
TATA-box 核心启动子元件 Core promoter element around -30 of transcription start 89 90 77 77
3-AF1 binding site 光调控元件 Light responsive element 1 1 0 0
AT1-motif 光调控元件 Part of a light responsive module 0 0 1 0
ATC-motif 光调控元件 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness 0 0 1 1
ATCT-motif 光调控元件 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness 1 1 2 2
Box 4 光调控元件 Part of a conserved DNA module involved in light responsiveness 2 2 3 2
Box I 光调控元件 Light responsive element 1 1 4 4
CATT-motif 光调控元件 Part of a light responsive element 1 1 0 0
GAG-motif 光调控元件 Part of a light responsive element 4 4 3 3
GATA-motif 光调控元件 Part of a light responsive element 0 0 1 1
G-Box 光调控元件 cis-acting regulatory element involved in light responsiveness 4 4 2 2
I-box 光调控元件 Part of a light responsive element 0 0 1 1
Sp1 光调控元件 Light responsive element 1 1 1 1
ABRE 脱落酸诱导顺式作用元件 cis-acting element involved in the abscisic acid responsiveness 1 1 1 1
ERE 乙烯响应元件 Ethylene-responsive element 1 1 2 2
TATC-box 赤霉素诱导顺式作用元件 cis-acting element involved in gibberellin-responsiveness 1 1 0 0
TGA-element 生长素诱导元件 Auxin-responsive element 1 1 0 0
TCA-element 水杨酸诱导顺式元件 cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness 0 0 3 3
CGTCA-motif 茉莉酸甲酯诱导顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
1 1 0 0
TGACG-motif 茉莉酸甲酯诱导顺式作用元件
cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsiveness
1 1 0 0
ARE 厌氧诱导顺式作用元件 cis-acting regulatory element essential for the anaerobic induction 1 1 1 1
C-repeat/DRE 冷害和脱水反应调控元件
Regulatory element involved in cold- and dehydration-responsiveness
1 1 0 0
HSE 热胁迫响应顺式作用元件 cis-acting element involved in heat stress responsiveness 0 0 1 2
TC-rich repeats 抗病和胁迫诱导顺式作用元件
cis-acting element involved in defense and stress responsiveness
0 0 1 1
MBS 干旱诱导 MYB 结合位点 MYB binding site involved in drought-inducibility 3 3 3 3
MBSⅡ 黄酮合成基因调控 MYB 结合位点
MYB binding site involved in flavonoid biosynthetic genes regulation
0 0 1 1
circadian 昼夜节律调控顺式作用元件 cis-acting regulatory element involved in circadian control 0 0 2 1
5UTR Py-rich stretch 高转录水平顺式作用元件 cis-acting element conferring high transcription levels 0 0 1 1
O2-site 玉米醇溶蛋白代谢调控顺式元件
cis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulation
1 1 1 0
as-2-box 根特异表达和光响应相关元件
Involved in shoot-specific expression and light responsiveness
1 1 1 1
CAT-box 分生组织表达调控元件 cis-acting regulatory element related to meristem expression 1 1 1 1
GCN4_motif 胚乳表达顺式作用元件 cis-regulatory element involved in endosperm expression 2 2 1 1
Skn-1_motif 胚乳表达必需顺式作用元件 cis-acting regulatory element required for endosperm expression 9 9 7 5

‘太平洋玫瑰’PGIP1 基因的启动子与‘秦冠’的基本相同，只是多了 1 个 TATA-box，而且显
示该元件方向为反向的，而 TATA-box 的功能与其方向性无关（Huang et al.，1996），暗示二者功能
基本相同。‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’PGIP2 基因的启动子在元件上存在较大差异，二者基本元件
CAAT-box、TATA-box 在类型和位置上均有差异；‘秦冠’PGIP2 基因的启动子比‘太平洋玫瑰’的
多 1 个光响应元件 Box 4、1 个玉米醇溶蛋白代谢调控顺式元件 O2-site 和 1 个昼夜节律调控顺式元
件 circadian；而后者仅比前者多 1 个热胁迫响应元件 HSE（图 2）。

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图 2 PGIP2 基因启动子 QG2 和 PR2 顺式作用元件差异比较
带“–”的数字表示该位置距离起始密码子的碱基数，箭头指示元件方向，线段指示元件位置，元件名称参见表 2。
Fig. 2 The different cis-acting elements between PGIP2 gene promoter QG2 and PR2
The number with“–”represents for the distance to the start code. The arrow indicates the direction of elements.
Line position indicates element sequence. The cis-acting element names refer to Table 2.

2.3 苹果PGIP基因家族成员的启动子活性分析
构建了 QG1、QG2、PR1 和 PR2 启动下的 GUS 基因的植物表达载体，将这些表达载体通过农
杆菌介导法分别转化烟草叶片，比较了 GUS 蛋白的瞬时表达情况，叶片 GUS 染色结果见图 3。


图 3 转 PGIP 启动子的烟草叶片 GUS 瞬时表达检测
CK-：阴性对照；CK+：阳性对照；PR1 和 PR2：‘太平洋玫瑰’PGIP1 和 PGIP2 启动子；QG1 和 QG2：‘秦冠’PGIP1 和 PGIP2 启动子。
Fig. 3 Transient expression of GUS in tobacco leaf disks conducted by PGIP promoters
CK-：Negative control；CK+：Positive control；PR1：PGIP1 promoter of‘Pacific Rose’；PR2：PGIP2 promoter of‘Pacific Rose’；
QG1：PGIP1 promoter of‘Qinguan’；QG2：PGIP2 promoter of‘Qinguan’.

GUS 活性定量分析结果见图 4，阳性对照（CK+）GUS 活性最高，阴性对照（CK-）几乎没有
活性，4 个 PGIP 启动子都具有启动活性，‘太平洋玫瑰’PGIP1、PGIP2 和‘秦冠’PGIP1、PGIP2
的活性分别为阳性对照的 47.65%、1.62%和 59.55%、3.84%。
11 期 符聪慧等：苹果 PGIP 基因部分家族成员启动子的克隆与功能分析 2175
‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’PGIP1 基因的
启动子的活性显著高于PGIP2基因启动子（P <
0.01），其中‘秦冠’PGIP1 基因启动子的活性
是 PGIP2 基因启动子的 15.49 倍，‘太平洋玫
瑰’PGIP1 基因启动子的活性是 PGIP2 基因启
动子的 29.35 倍。可能与 PGIP1 启动子中
TATA-box 和 CAAT-box 数量明显较多有关。
‘秦冠’的 PGIP1 基因启动子活性与‘太
平洋玫瑰’差异不显著；而‘秦冠’PGIP2 启
动子活性显著高于‘太平洋玫瑰’PGIP2 启动
子（P < 0.01），是后者的 2.37 倍。这同‘秦冠’
抗病性优于‘太平洋玫瑰’的情况一致。
图 4 ‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’苹果 PGIP 基因启动子
在烟草中的瞬时启动活性比较
Fig. 4 GUS activity analysis of different PGIP promoters of
‘Qinguan’and‘Pacific Rose’apples in tobacco plants
2.4 PGIP基因表达与启动子活性相关性分析
利用实时荧光定量 PCR 比较了两个苹果品种的 PGIP1 和 PGIP2 基因转录表达差异（图 5）以
及接种褐斑病病原菌诱导下‘秦冠’中 PGIP 基因的表达情况（图 6）。由图 5 可知，PGIP1 和 PGIP2
表达水平品种间差异不大，但同一品种中 PGIP1 表达量明显高于 PGIP2，这与离体启动子 PGIP1
活性高于 PGIP2 的研究结果一致。对启动子活性与 PGIP 基因表达水平相关分析表明，二者之间并
不存在直接相关关系，说明植物的 PGIP 基因表达可能存在较为复杂的调控机制。
由图 6 可知，‘秦冠’叶片接种褐斑病病原菌后，PGIP1 和 PGIP2 表达水平均对接种褐斑病有
响应，其中接种处理的 PGIP1 表达水平除 48 h 外均高于未接种对照，接种处理的 PGIP2 表达水平
仅 72 h 显著高于对照，其他时间点与对照差异不显著。由此可见，病原菌诱导能够诱导迅速诱导
PGIP1 的表达，而对 PGIP2 的诱导较慢，且维持时间较短，这一结果与‘秦冠’PGIP1 和 PGIP2
中分别存在不同的响应病原菌诱导的启动子元件相一致。

图 5 ‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’苹果 PGIP 基因的表达
Fig. 5 PGIP gene expression in‘Qinguan’and
‘Pacific Rose’apples
图 6 ‘秦冠’苹果叶片接种褐斑病菌后 PGIP 基因的表达
Fig. 6 PGIP gene expression in‘Qinguan’apple leaves after
inoculation of Marssonina coronaria

3 讨论
本研究中从‘秦冠’和‘太平洋玫瑰’苹果入手，根据已公布的苹果基因组，利用同源序列克

2176 园 艺 学 报 41 卷
隆得到 PGIP 基因家族不同成员 PGIP1 和 PGIP2 的启动子，通过顺式作用元件预测发现启动子中存
在多个生物和非生物因素诱导调控元件，通过构建植物融合表达载体，定量测定并比较启动子活性
差异，结果发现 PGIP1 基因启动子活性远高于 PGIP2 基因启动子，这与 PGIP 基因表达分析的结果
吻合，推测该结果与 PGIP 基因启动子中 TATA-box 和 CAAT-box 数量有着明显关系。TATA-box 是
真核生物基因启动子的基本结构特征，它是基因依赖于 RNA 聚合酶Ⅱ转录所必需的，能指导起始
前复合物的形成，决定转录起始位点，并调控上游激活蛋白的行为。CAAT-box 与 RNA 聚合酶的结
合有关，它可以极大提高基本启动子的低水平转录活性（李广平 等，2009）。因此，PGIP1 基因启
动子中 TATA-box 和 CAAT-box 数量明显多于 PGIP2，可能就是其活性高于 PGIP2 的主要原因之一。
启动子元件预测结果显示，PGIP1 基因启动子含有茉莉酸甲酯响应元件，而 PGIP2 基因启动子
中存在水杨酸响应元件。水杨酸（SA）是抗病基因特异的植物系统性抗病反应的重要信号分子，参
与植物的过敏反应和系统获得抗性反应（Klessig & Malamy，1994），是植物产生系统抗性所必需的
内源信号分子（赵淑清和郭剑波，2003）；茉莉酸甲酯（MeJA）可作为病原物、激发子及创伤诱导
植物防卫基因表达的信号分子（Titarenko et al.，1997）。许多报道（Bergmann et al.，1994；Titarenko
et al.，1997；Kachroo et al.，2000；van Wees et al.，2000）指出，MeJA 诱导抗病性途径与 SA 等激发
子有所不同，不同途径之间存在协同或拮抗作用。由此推测 PGIP 基因家族成员可能各自存在不同的
MeJA 和 SA 特异性诱导的抗病性表达机制。同样，王秀云等（2011，2012）关于桃 PGIP 启动子的研
究显示 PpPGIP1 启动子中同时存在 SA 和 MeJA 响应元件，而 PpPGIP2 启动子中只含有 SA 响应元
件，特别是 PpPGIP1 启动子没能响应 SA 诱导表达。因此，需要进一步的 MeJA 和 SA 诱导表达试
验才能验证这两个启动子是否在诱导物 MeJA 和 SA 的选择上存在不同，是否能够响应其诱导作用。
病原菌侵染、胁迫、创伤、真菌葡聚糖、寡聚半乳糖醛酸苷以及水杨酸、吲哚乙酸等都会诱导
PGIP 基因的表达（Bergmann et al.，1994；De Lorenzo et al.，2001；Liang et al.，2005），但不同的
PGIP 基因对诱导条件有差异（D’Ovidio et al.，2004）。对油菜（Li et al.，2003）、菜豆（Di Matteo et
al.，2006）、拟南芥（Ferrari et al.，2003）的研究表明，PGIP 家族各成员对诱导条件的选择响应上
存在明显差异。Devoto 等（1998）对菜豆 pgip-1 基因启动子的研究发现，该启动子能够响应机械损
伤诱导表达，但不受寡聚半乳糖醛酸苷、真菌葡聚糖、水杨酸、隐地蛋白和病原菌感染的诱导表达，
可能该研究获得的是 PGIP1 类的启动子序列。但 Joubert 等（2013）发现葡萄 Vvpgip1 启动子–3.1 kb
到–1.5 kb 的区域响应病原菌侵染诱导，–1.1 kb 到–0.1 kb 的区域响应机械损伤诱导，各诱导条件
在启动子存在不尽相同的响应区域。这一结果与葡萄启动子元件分析结果并不一致。Mota 等（2000）
通过克隆两个苹果 PGIP 启动子，并构建融合载体获得转基因烟草，验证了在灰霉病病菌侵染的诱
导下，处理 18 h 后的叶片中能够检测到 PGIP 启动子驱动的 GUS 基因的表达，说明 PGIP 启动子能
够响应病原菌侵染，但具体的两个 PGIP 启动子之间的活性差异并未指出，也没能揭示 PGIP 启动子
上响应病原菌侵染的区域。本研究中‘秦冠’苹果 PGIP2 启动子活性显著高于‘太平洋玫瑰’苹果，
而‘秦冠’的抗病性高于‘太平洋玫瑰’，也表明 PGIP2 启动子活性可能与抗病性相关。但是，苹
果 PGIP 基因家族成员 PGIP1 和 PGIP2 针对病原菌的诱导，其响应区域在启动子上的位置，以及不
同抗病性品种启动子活性差异显著的区域，都有待进一步研究探索。因此，有必要探索苹果不同 PGIP
基因家族成员的诱导表达机制，结合已知启动子序列和功能元件预测，构建不同的序列突变表达载
体，进一步确定各诱导条件的响应区域。

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