全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（8）：1560–1566 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–03–22；修回日期：2013–05–27
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lzhh1954@163.com）
大樱桃黑斑病病原鉴定及其致病性研究
赵远征，刘志恒*，李俞涛，周 思，黄欣阳
（沈阳农业大学植物保护学院，沈阳 110866）
摘 要：针对大樱桃黑斑病进行了病原菌鉴定及致病性测定，通过形态学鉴定和 rDNA-ITS 序列分析，
确定其病原菌为链格孢（Alternaria alternata）。致病性测定结果表明：该菌可以直接侵染或通过自然孔口
和伤口侵染大樱桃果实，伤口接种的果实发病较重；病原菌对有伤叶片具有一定的致病能力，不侵染无
伤叶片；该菌对梨、杏、李等果实致病性较强，对山楂果实的致病能力相对较弱。
关键词：大樱桃；黑斑病；链格孢；鉴定；致病性
中图分类号：S 662.5 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）08-1560-07

Studies on Identification and Pathogenicity of Cherry Black Spot Caused
by Alternaria alternata
ZHAO Yuan-zheng，LIU Zhi-heng*，LI Yu-tao，ZHOU Si，and HUANG Xin-yang
（College of Plant Protection，Shenyang Agricultural University，Shenyang 110866，China）
Abstract：The test was based on the pathogen’s identification and pathogenicity of cherry black spot.
And it was identified as Alternaria alternata by morphological identification and rDNA-ITS sequence
analysis. Pathogenic test showed that it infected the cherry fruits directly or by wound and natural ostiole，
and disease on the fruits inoculated by the pathogen through wound was more serious. The pathogen
showed some pathogenicity on the wound leaves，but had no effect on the intact ones. The pathogen
effected on pear，apricot and plum fruits with high pathogenicity，while it infected hawthorn fruits with a
relatively low pathogenicity.
Key words：cherry；black spot；Alternaria alternata；identification；pathogenicity

大樱桃黑斑病作为大樱桃的一种新病害，严重影响其产量和品质。调查发现该病在辽宁大樱桃
主产区大连呈连年加重趋势，在果实成熟季节 6、7 月份，病情严重的果园发病率高达 75%，严重
时甚至造成绝收。该病害主要危害大樱桃果实，在果面上形成大小不一的黑色斑块，其上常伴有轮
纹晕圈，导致果实腐烂，病患处组织硬化，后期果面凹陷、开裂，最终造成果实干缩、脱落。
由于目前国内外缺乏对大樱桃黑斑病的相关研究，其发病规律和防治方法尚不明确。本试验中
对该病害的病原菌进行了分离鉴定，并对其致病性进行了测定，从而明确该病害的病原及其致病特
点，以期为该病害的预测预报和防治提供理论依据。



8 期 赵远征等：大樱桃黑斑病病原鉴定及其致病性研究 1561

1 材料与方法
1.1 病样采集及病原菌分离
2010—2012 年在辽宁大连的樱桃种植区采集具有典型发病特征的大樱桃果实，并对大樱桃黑斑
病田间发病特点、侵染症状和危害情况进行记载和描述。
参照《植病研究方法》（方中达，1998）中常规组织分离法对病果上的病原菌进行分离、纯化，
并经单孢分离获得纯培养菌株。
1.2 病原菌形态鉴定
将纯化菌株接种于 PDA 平板，25 ℃恒温箱培养，观察菌落颜色、形状、菌丝疏密程度。孢子
培养和产孢表型观察参照孙霞（2006）描述的方法，将菌株于 25 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗循环保湿
条件下培养 5 ~ 7 d 后，利用光学显微镜和扫描电子显微镜进行观察。描述记载孢子形态及产孢结构，
测量孢子大小。
1.3 柯赫氏法则证病
选用表面消毒后的离体健康大樱桃果实，用消毒针头在果实表面针刺造成微伤口，从 PDA 上培
养 7 d 的菌落边缘打取 5 mm 的菌饼接种于伤口处，每处理重复 3 次，每重复 5 个果实。以接种无
菌的 PDA 培养基作为对照，25 ℃恒温培养，观察记录发病情况；将发病果实进行再次分离，培养
获得的病原菌与原分离菌株进行比较观察并加以鉴定。
1.4 病原菌 rDNA-ITS 序列分析
利用马铃薯蔗糖液体培养基，28 ℃、150 r · min-1 条件下振荡培养病原菌菌株 TX10-06，3 d 后
收集菌丝，采用 CTAB 法提取总 DNA（Robert，2005），选用真菌通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGA
ACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）对病原菌的 ITS 和 5.8S rDNA 进行
PCR 扩增（王洪凯 等，2001）。扩增程序：94 ℃变性 5 min；94 30 s℃ ，55 30 s℃ ，72 30 s℃ ，35
个循环；72 ℃延伸 7 min。
PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，由宝生物工程（大连）有限公司进行测序，测序结果在
GenBank 数据库中进行 BLAST 比对分析。
1.5 病原菌的致病性测定
1.5.1 病原菌对果实的致病性
将健康的离体大樱桃果实表面消毒备用。采用无伤接种菌饼、针刺接种菌丝和孢子悬浮液接种
（孢子浓度为 1 × 106 个 · mL-1）3 种处理方法。①打取菌落边缘直径为 5 mm 的菌饼，将含有病原
菌的一面朝向果实，直接贴合在果实表面；②用消毒针头在果实表面造成伤口，挑取少量菌丝接于
伤口处；③将果实表面造成微伤口，用无菌水配成浓度为 1 × 106 个 · mL-1 的孢子悬浮液对果实进行
均匀喷雾并在无菌密封小瓶中保湿培养。菌饼接种以接种无菌的 PDA 培养基块作为对照，孢子悬浮
液接种以无菌水作为对照。
在 25 ℃恒温箱中培养 7 d 后观察发病情况，并比较不同接种方法的发病程度。每种处理重复 3
次，每重复 10 个果实。

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1.5.2 病原菌对叶片的致病性
选用健康无伤的大樱桃叶片，将叶片表面消毒后，采用无伤接种菌饼和针刺接种菌饼的方法将
菌饼接种于叶片上，叶柄处包裹无菌湿润的脱脂棉进行保湿。以接种无菌的 PDA 培养基块作为对照，
25 ℃恒温培养 7 d 后观察发病情况，并比较不同接种方法的发病程度。每种处理重复 3 次，每重复
10 个叶片。
1.5.3 病原菌对不同寄主的致病性
采用针刺接种法，以菌饼作为接种体，分别接种于表面消毒后的苹果、梨、杏、李、桃和山楂
蔷薇科植物果实上，每种处理 6 个果实，每处理重复 3 次。在 25 ℃恒温箱中培养 7 d 后观察发病情
况，记录病害级别并计算病情指数。病害级别和病情指数参照万佐玺（2001）的计算方法。
2 结果与分析
2.1 病害症状描述
该病害主要危害大樱桃果实，常在果柄萼洼处发病，形成黑色病斑（图 1，A）；初期果面上形
成黑褐色圆形或不规则斑点，逐渐扩展蔓延，形成大小不一的黑色斑块，其上常伴有轮纹晕圈（图
1，B）；后期病患处组织僵硬导致果面开裂，全果变黑，果面严重凹陷或腐烂；病部表面产生浓密
的黑色霉层，最后形成僵果悬挂枝上经久不落，或腐烂病果直接脱落于地表（图 1，C）。病原菌主
要在病果上越冬，成为翌年发病的主要侵染源。
2.2 病原菌形态鉴定结果
人工培养 7 d 后，菌落呈灰色至暗青褐色，菌丝或气生菌丝发达（图 2，A）。
分生孢子梗单生或簇生，直立或弯曲，分隔，褐色或淡褐色，随着产孢作合轴式延伸，12.5 ~ 90.0
μm × 2.0 ~ 5.0 μm（图 2，B）。
产孢表型呈矮树状分枝，支链一般长 1 ~ 5 个孢子，可进行二次分枝（图 2，C）。
分生孢子单生或短链生，倒梨形，卵形或倒棍棒形，淡褐色或褐色，表面光滑或具疣突，孢身
20.0 ~ 42.0 μm × 7.5 ~ 14.5 μm，横隔膜 3 ~ 8 个，纵、斜隔膜 0 ~ 3 个，有的分隔处隘缩，短喙柱状
（图 2，D、E）。
根据形态特征的观察结果，将病原菌鉴定为链格孢（Alternaria alternata）（张天宇，2003）。
接种处理的大樱桃均可发病，接种 3 d 后症状显现，发病初期果面形成水渍状病斑，菌丝在果
实表面扩展，形成灰绿色菌丝丛；后期菌丝颜色变为灰黑色，果面凹陷形成黑褐色病斑，而对照处
理不发病。观察人工接种发病症状与自然发病症状相一致，根据柯赫氏法则，对接种发病后的病斑
再次分离，从接种病斑中获得了与原菌株相同的病原菌，通过对其菌落、孢子及产孢表型等形态鉴
定，确定该病原菌为链格孢（A. alternata）。
2.3 病原菌 rDNA-ITS 序列分析结果
利用真菌通用引物 ITS1/ITS4 对菌株 rDNA-ITS 进行 PCR 扩增，重复 2 次，均扩增出一条 529 bp
大小的片段，阴性对照中无 PCR 扩增产物。将测序获得的序列上传到 NCBI 进行 BLAST 比较分析，
该病原菌菌株的 rDNA-ITS 序列与 GenBank 中收录的序列进行同源性比较，发现其序列与链格孢
A. alternata（GenBank 登录号 JF835834）相似性达到 99%。结合形态鉴定结果，确定该病原菌为
A. alternata。

8 期 赵远征等：大樱桃黑斑病病原鉴定及其致病性研究 1563













图 1 大樱桃黑斑果腐病症状
Fig. 1 Symptom of cherry black fruit rot
























图 2 病原菌形态
Fig. 2 The morphological characteristics of Alternaria alternate

2.4 病原菌致病性测定
测定结果表明，经过直接接种、针刺接种和孢子悬浮液接种的大樱桃果实均能发病，而对照处
理均不发病，3 d 后症状显现，7 d 后发病严重（图 3，A ~ C）；病原菌具有较强的侵染能力，直接
接种时可穿透果实表皮进入组织内部，针刺接种时可通过伤口进行扩展；孢子悬浮液接种的果实除
在伤口处发病外，还多在果柄处发病，与田间调查时果柄处发病率高的结果相一致；针刺接种较其
他两种接种的果实病斑扩展快，说明伤口有利于病原菌的侵染；菌饼接种的果实带菌量大，发病严
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重。无伤接种的大樱桃叶片不发病（图 3，D），而针刺接种的叶面部位产生黑色病斑并逐渐扩展，
菌丝在其上形成绒毛状黑绿色菌丝丛并扩展至叶背部（图 3，E、F）。


















图 3 人工接种病原菌发病症状
A：菌丝接种（果实）；B：孢子悬浮液接种（果实）；C：菌饼接种（果实）；D：无伤接种（叶片）；
E：有伤接种（叶正面）；F：有伤接种（叶背面）。
Fig. 3 Symptom of cherry inoculated by Alternaria alternata
A：Inoculated by mycelium（fruit）；B：Inoculated by spore suspension（fruit）；C：Inoculated by PDA plugs of mycelia（fruit）；
D：Inoculated without hurt（leaf）；E：Inoculated with hurt（front of blade）F：Inoculated with hurt（back of blade）.


病原菌的寄主范围较为广泛，可导致供试寄主不同程度发病。病原菌对梨、杏、李果实均有较
强的致病作用，病情指数达 70 以上，严重时能够导致果实内部组织软化和腐烂；在苹果、桃的果实
表面出现水渍状黑色病斑，病斑周围果面略微凹陷，病情指数可达 50 以上；对山楂的侵染能力较弱，
病情指数为 20（图 4）。









图 4 链格孢对不同寄主的致病性
Fig. 4 Pathogenicity of A. alternata in different hosts
8 期 赵远征等：大樱桃黑斑病病原鉴定及其致病性研究 1565

3 讨论
大樱桃黑斑病是我国近年来大樱桃上发生的一种新病害，鉴定采用形态学和分子技术相结合的
方法，确定该病病原菌为链格孢（Alternaria alternata）。链格孢（A. alternata）作为链格孢属（Alternaria
Nees）的模式种，是农业上重要的致病真菌（张天宇，2003）。近年来国内外关于 A. alternata 引起
的叶斑类病害报道甚多，Thomidis 和 Tsipouridis（2006）曾在希腊首次发现 A. alternata 引起樱桃叶
斑病；意大利的 Hydrangea macrophylla（Garibaldi et al.，2007）上和巴基斯坦的 Rumex dentatus
（Siddiqui et al.，2009）上都有叶斑病的发生，发病率最高达 70%。在我国北柴胡、鱼腥草寄主植
物上均有该致病菌引起叶斑病的报道（Zhang et al.，2010；Zheng et al.，2011），病害导致作物减产，
造成直接经济损失。该病主要危害大樱桃果实，与严进等（2009）报道的梨果实黑斑病症状相似，
均在果实表面造成近圆形或不规则黑褐色病斑，果实凹陷，潮湿时病斑表面生黑色霉层。与朱建兰
和常永义（2004）所报道的樱桃黑色轮斑病有所区别，后者由樱桃链格孢引起，主要危害叶片。
由于 A. alternata 的孢子形态和产孢表型易受环境影响而发生改变，因此该菌的鉴定比较复杂繁
琐。本试验利用形态学方法对病原菌进行鉴定，并采用分子生物学技术对鉴定结果进行验证和补充。
Simmons 和 Roberts（1993）提出了产孢表型的概念，将产孢表型作为区分小孢子链格孢种的重要依
据，并将梨上分离的 200 多个分离系依产孢表型划分 6 个组。近年国内对链格孢分子鉴定取得了相
关进展，王洪凯等（2001）用 5.8S rDNA 及 ITS 分析了链格孢种级分类；薛峰等（2005）对 Ulocladium、
Stemphylium 和 Alternaria 的典型菌种进行了分子系统发育分析，构建了 ITS 和 gpd 基因序列分子系
统发育树。利用 ITS 序列分析可将该病原菌与 Alternaria 中的大部分种区分开，但仍然有一些种类
与之具有较高的相似性。本研究将 ITS 序列分析中与病原菌菌株相似性高的种类逐一进行比较形态
学研究，发现除 A. alternata 外，其余种在形态上均与病原菌存在显著差异，因此可以确认该病原菌
为 A. alternata。试验结果表明，单独利用 ITS 序列分析不能有效区分 Alternaria 中的一些种类，因
此在 A. alternata 鉴定上仍以形态学鉴定为主。
调查发现，风雨、暴晒、虫害、自然采摘和运输等原因容易造成果面形成伤口，进而导致病害
发生严重，由此认为重视防虫和减少人为机械伤口的形成能减少病害发生。孢悬液接种时果柄处发
病率较高，此现象与田间调查时果柄部位发病率高的结果相一致，究其原因与果柄萼洼处较易积水
且具有自然孔痕利于病原菌侵染有关。病原菌对有伤叶片具有一定侵染力，但不侵染无伤叶片，结
合田间调查时病害多在果实上发生的结果，初步推断病原菌对叶片侵染能力较弱。关于病原菌不易
在大樱桃叶片上发病的具体机理还有待于进一步展开研究。该菌较易侵染含糖量高的果品，对有机
酸含量高的果品侵染能力较差，寄主大樱桃果实含糖量高利于该病菌侵染。
病原鉴定和致病性研究进一步验证了田间病害发生的调查结果，可为大樱桃黑斑病病害流行规
律以及病害防治的研究提供依据，同时也有助于该病原菌致病机理研究工作的进一步开展和深入。

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