全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（6）：1141–1150 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–01–10；修回日期：2012–04–28
基金项目：国家‘863’计划项目（2011AA100208）；农业部花卉行业科技专项（200903020）；云南省社会发展科技计划项目（2009ZC140M）
* 共同第一作者
** 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wangjh0505@sohu.com）
百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选
马璐琳 1,*，张艺萍 1,*，丁 鲲 2，吴丽芳 1，王祥宁 1，崔光芬 1，贾文杰 1，
段 青 1，王继华 1,**
（1 云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，昆明 650205；2 云南省农村科技服务中心，昆明
650021）
摘 要：对 20 个百合种质资源的组培苗进行尖孢镰刀菌百合专化型（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）
室内接种鉴定；以筛选出有较好抗性的大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker）为材料，以镰
刀菌诱导 12 和 24 h 的作为处理组，无菌水处理作为对照组，采用 SMART 技术构建了百合经镰刀菌诱导
后的抑制差减正、反向两个 SSH 文库。在正向文库中选择了 4 个抗病相关的 ESTs，用半定量 RT-PCR 分
析这些 ESTs 的表达情况。经接种鉴定，20 个百合种质资源中，对百合镰刀菌表现高抗的有 3 个，中抗 9
个，感病 8 个；SSH 文库 ESTs 片段大小为 200 ~ 2 000 bp。依据斑点杂交结果，从正向 SSH 文库中挑取
50 个单克隆进行测序和比对分析，得到 6 种共 10 条抗病相关 EST。通过半定量 RT-PCR 对其中的 4 条抗
病相关 ESTs：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein kinase，S/TPK）、谷胱甘肽 S–转移酶
（glutathione S-transferase，GST）、过氧化物酶（peroxidase，POD）和亲环素（cyclophilin，CYP）的表
达情况进行了分析，证明它们在一定程度上都受百合镰刀菌诱导而表现上调表达，推测其可能参与了百
合对镰刀菌枯萎病的抗病过程。
关键词：百合大花卷丹；百合尖孢镰刀菌；SSH 文库；基因表达分析
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）06-1141-10

Resistance Identification of Lily Germplasms to Fusarium oxysporium and
Screening of the Resistance Related Genes
MA Lu-lin1,*，ZHANG Yi-ping1,*，DING Kun2，WU Li-fang1，WANG Xiang-ning1，CUI Guang-fen1，
JIA Wen-jie1，DUAN Qing1，and WANG Ji-hua1,**
（1Yunnan Flower Breeding Key Lab，Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming
650205，China；2Yunnan Rural Science and Techology Service Center，Kunming 650021，China）
Abstract：Tissue culture seedlings of 20 lily germplasms were identified for resistance against
Fusarium oxysporium by an in vitro inoculation method in laboratory，the highly resistant lily（Lilium
leichtlinii var. maximowivzii Baker ） was used to construct the forward suppression subtractive
hybridization（SSH）library and the backward SSH library using the SMART method. The seedlings were
induced by F. oxysporum f. sp. lilii for 12 h and 24 h after inoculation and those treated by water were
taken as control. Four resistance-related ESTs were analyzed by the semi-quantitative RT-PCR. The results

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showed that 3 of 20 identified lily germplasms were highly resistant，nine of them were middle resistant
and 8 were susceptible；The inserted segments of SSH library were 200–2 000 bp in length；According to
the results of dot blot hybridization，fifty clones of the forward library were picked out and sequenced，and
then 6 classes 10 resistance-related ESTs were obtained. The RT-PCR results of 4 resistance-related genes
（serine/threonine protein kinase，glutathione S-transferase，peroxidase，cyclophilin etc.）showed that they
were upregulated by F. oxysporum f. sp. lilii and supposed to involved in the disease resistance reaction for
Fusarium wilt.
Key words：Lilium leichtlinii var. maximowivzii Baker；Fusarium oxysporum f. sp. lilii；suppression
subtractive hybridization（SSH）library；gene expression analysis

镰刀菌枯萎病又称根腐病、茎腐病，是百合生产中危害最严重的病害。利用抗镰刀菌枯萎病种
质资源，筛选发掘抗病基因，培育抗病品种是防治百合镰刀菌枯萎病最经济有效的方法。Straathof
和 van Tuyl（1994）研究发现东方百合对镰刀菌抗性最差，麝香百合次之，亚洲百合最强。刘妍等
（2009）通过田间镰刀菌接种试验，对部分东方百合进行了抗镰刀菌鉴定工作，筛选出一个对镰刀
菌麟茎腐烂病有较强抗性的材料。杨秀梅等（2010）对包括兰州百合、卷丹、麝香百合和多斑豹子
花等 4 个中国野生百合在内的 40 份百合资源进行抗镰刀菌鉴定，发现兰州百合表现为高抗，卷丹表
现为中抗。在百合抗性基因的发掘方面，Straathof 等（1996）运用 RAPD 分子标记对亚洲百合杂种
系的镰刀菌抗性进行了遗传分析，筛选出 3 个与镰刀菌抗性显著相关的标记。Shahin 等（2009）运
用 3 种不同的分子标记系统（DArT、AFLP 和 NBS profiling）构建了亚洲百合回交群体的遗传图谱，
并将 4 个抗镰刀菌 QTL 位点进行了定位。
本研究中对部分中国野生百合资源和栽培品种进行镰刀菌抗性评价与鉴定，筛选优良抗性资
源，在此基础上利用对百合镰刀菌具有较好抗性的中国野生百合大花卷丹为试材，采用室内人工接
种百合尖孢镰刀菌诱导抗病相关基因表达，通过 SMART 技术构建镰刀菌诱导的抑制消减杂交
（suppression subtractive hybridization，SSH）文库，获得与镰刀菌枯萎病抗性相关的 ESTs，通过生
物信息学分析文库中 ESTs 序列的种类与特性，并对部分抗病相关 ESTs 的表达谱进行分析。本研究
中采用百合组培生根苗进行室内镰刀菌枯萎病抗性鉴定，可以克服有些野生百合资源因种球稀少而
难以满足试验要求的缺点，同时又能缩短试验周期，加快百合种质抗性筛选进程；通过构建并筛选
SSH 文库，可以降低目标基因克隆的假阳性，有效获得百合镰刀菌抗性相关 ESTs，为百合镰刀菌枯
萎病抗性基因的筛选发掘及抗病育种提供一定研究依据。
1 材料与方法
1.1 百合种质资源对镰刀菌抗性鉴定
百合资源组培苗扩繁及接种鉴定试验于 2010 年 3—9 月，在云南省农业科学院花卉研究所组培
室进行；SSH 文库构建及候选基因表达分析试验于 2010 年 10 月—2011 年 8 月，在云南省农业科学
院花卉研究所云南省花卉育种重点实验室进行。
将云南省农业科学院花卉研究所百合课题组离体保存的 20 份百合资源（8 份东方百合品种，5
份亚洲百合品种，7 份中国野生百合，表 2）扩繁后，接种至生根培养基（MS + NAA 0.1 mg · L-1）
中（张艺萍 等，2006），采用生根苗进行接种鉴定。
百合组培苗培养所需要 MS 基本培养基的试剂和植物生长调节剂如 NAA 等均购自昆明赛贝斯
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商贸（云科生物）有限责任公司。
百合尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum f. sp. lilii）病原菌为田间百合枯萎病植株上分离得到的尖
孢镰刀菌致病菌株 Fol2ysc 菌株，由农业部花卉产品质量监督检验测试中心（昆明）分离纯化并提
供，于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PSA）上保存待用。
将20份百合资源的生根苗根部切伤后人工接种百合枯萎病菌孢子悬浮液（孢子1 × 106个 · mL-1）。
设 3 个重复，每个重复 30 株。接种后于 25 ℃条件下培养 10 d 后调查生根苗的发病情况（方中达，
1998）。
病情分级标准：0 级为健康无病；1 级为 1 ~ 2 片叶叶缘卷曲萎蔫；2 级为 3 ~ 4 片叶卷曲萎蔫；
3 级为 4 ~ 6 片叶卷曲萎蔫；4 级为叶片几乎全部萎蔫，甚至死亡（丁丁 等，2011）。
感染指数 = Σ[（病级植株数 × 病级代表数值）/（植株数总和 × 最高病级代表数值）]× 100。
按样本的平均感染指数划分百合种质对病菌的抗性等级：高抗（HR）≤ 20.0，中抗（MR）20.1 ~
50.0，中感（MS）50.1 ~ 80.0，高感（HS）≥ 80.1（方中达，1998）。
1.2 百合尖孢镰刀菌诱导的 SSH 文库构建及抗病基因表达分析
1.2.1 接种和取样方法
取大花卷丹组培生根苗在 25 ℃、10 h 光照/14 h 暗培养条件下培养 20 d，选取植株高度、叶片
数和大小基本一致的组培生根苗，经百合尖孢镰刀菌（孢子悬浮液）诱导作为处理组，分别取镰刀
菌诱导 0、6、12、24、48 和 72 h 后的叶片，对照组取 12 和 24 h 的叶片，于液氮中速冻，–80 ℃
保存备用。
部分镰刀菌诱导的 12 和 24 h 时间段叶片与无菌水处理 12 和 24 h 时间段叶片用于构建 SSH 文
库，其余用于后期 SSH 文库中 ESTs 的表达谱分析。
1.2.2 SSH 文库构建及插入片段鉴定
RNA plant 植物 RNA 提取试剂盒购自北京天为时代科技有限公司，Super SMARTTM PCR cDNA
Synthesis Kit、PCR-Select cDNA Subtraction Kit、Advantage 2 Polymerase Mix 购自 Clontech 公司
（America），QIAquick PCR Purification Kit 购自 Qiagen 公司（Germany），DL2000 DNA marker、
AMV 反转录酶、Taq 酶、dNTP、pMD-18-T 载体购自 TaKaRa 公司（Japan）。
大花卷丹叶片总 RNA 的提取按照 RNA plant 植物 RNA 提取试剂盒（北京天为时代科技有限公
司）说明书进行。
分别取处理组和对照组材料 12 和 24 h 两个时间段当量混合后的总 RNA 作为 tester 和 driver，
参照 Super SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 说明书（Clontech 公司）合成双链 cDNA。参照
PCR-Select cDNA Subtraction Kit 说明书（Clontech 公司）以处理组的 cDNA 为目标群体，对照组的
cDNA 为对照群体，进行正向抑制消减杂交。以对照组的 cDNA 为目标群体，处理组的 cDNA 为对
照群体，进行反向抑制消减杂交。两次差减 PCR 扩增产物按照 QIAquick PCR Purification Kit 说明
书（Qiagen 公司）进行纯化回收，纯化回收产物与 pMD18-T 克隆载体连接后转化感受态宿主菌，
培养过夜后挑取白色菌落扩大培养制备甘油菌于–70 ℃保存。分别从正、反向两个文库随机挑取
384 个克隆扩大培养后作为扩增模板，以巢式 PCR 引物 Primer 1 和 Primer 2 进行菌液 PCR 扩增，对
插入片段大小进行鉴定，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 斑点杂交及 EST 序列分析
Ultrahyb、Strip-EZ DNA Kit 购自 Ambion 公司（America），MicroSpin G-50 Columns 购自
Amersham 公司（America），同位素 32P：α-32P-dATP 购自北京福瑞生物工程公司，杂交尼龙膜购
自 Millipore 公司（America）。
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分别取正、反向抑制消减杂交 cDNA 片段的第 2 次 PCR 扩增产物 5 μL 为模板，经 RsaⅠ酶切
后纯化即为正、反向探针（分别以 MT 和 MC 表示），探针的标记及纯化参照 Strip-EZ DNA Kit 说
明书进行。取 0.6 μL 菌液 PCR 产物进行点膜，膜经变性、中和、洗涤、干燥后分别与标记好的正、
反向探针进行预杂交和过夜杂交，杂交完成后，进行洗膜，最后进行扫描图像，信号定量并分析试
验结果，具体步骤参照 Ultrahyb 说明书（Ambion 公司）。
斑点杂交阳性克隆送往上海欧易生物科技有限公司进行测序，对得到的序列在 NCBI（http：//
www. ncbi. nlm. nih. gov/ BLAST）上进行比对分析，并进行功能注释。
1.2.4 抗病相关基因半定量 RT-PCR 表达分析
DL2000 DNA marker、AMV 反转录酶、Taq 酶、dNTP 均购自 TaKaRa 公司（Japan）。
在正向文库推测的抗病相关基因中选择了 4 条 ESTs[分别为：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/
threonine protein kinase，S/TPK）、谷胱甘肽 S–转移酶（Glutathione S-transferase，GST）、过氧化
物酶（peroxidase，POD）和亲环素（cyclophilin，CYP）]进行半定量 RT-PCR 验证，根据 EST 序列，
用 Primer 5.0 软件设计引物，半定量 RT-PCR 所用内参引物来自百合 Actin 基因（辛海波 等，2010），
引物送交上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物见表 1。
分别取大花卷丹经镰刀菌诱导 0、6、12、24、48 和 72 h 后的叶片提取总 RNA，再按 AMV 反
转录酶说明书（TaKaRa 公司）分别进行半定量–逆转录完成 cDNA 的合成。半定量 RT-PCR 反应
体系为：cDNA 模板 1 μL，上、下游引物各 1 μL（10 pmol · L-1），5 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5
μL（10 mmol · L-1），MgCl2 1.5 μL，Taq DNA 聚合酶 0.2 μL（1 ~ 1.5 U），ddH2O 17.3 μL。PCR 反
应条件：95 ℃ 3 min；95 ℃ 1 min，49 ~ 52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，28 个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR
产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪拍照，观察分析结果。

表 1 半定量 RT-PCR 分析所设计的引物
Table 1 Primers designed for semi-quantitative RT-PCR
引物
Primer
上游引物（5′→3′）
Forward primer
下游引物（5′→3′）
Reverse primer
退火温度/℃
Melting temperature
Actin ATGGAACTGGAATGGTTAAG ATAGCAACATACATAGCAGG 51.0
S/TPK GCCTTCAGTAGTGGTTCT GAGTGATTTGGGTGTTTT 49.0
GST CACAAGTTTCTCGCATTT CATCATACCAACCTACGC 50.5
POD TGAAACATCCCACCTTAC TATTACCGCAACATCCTC 52.0
CYP AATACCAATGGGTCTCAG ATAACCGAACAAGCACTC 50.0
2 结果与分析
2.1 百合种质资源镰刀菌抗性鉴定
抗性鉴定结果（表 2）表明：8 个东方百合品种中，Mero Star、Aberlour 和 Berlin 的感染指数在
20.1 ~ 50.0 之间，对百合镰刀菌表现为中抗；Egypt、Paramount、Monrovia、Caruso 和 Acapulco 的
感染指数在 50.1 ~ 80.0 之间，表现为中感。
5 个亚洲百合品种中，Gorden Globe 的感染指数为 16.5，对百合镰刀均表现为高抗；Lemon Pixie、
Kansas、Tropic 和 Saniciro 表现为中抗。
7 个百合野生种中，大花卷丹和湖北百合的感染指数在 20.0 以下，对百合镰刀菌表现为高抗；
淡黄花百合和宜兴百合表现为中抗；紫脊百合、台湾百合和玫红百合表现为中感。大花卷丹对百合
镰刀菌表现为高抗，且感染指数最低，因此选其作为构建 SSH 文库的材料。

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表 2 百合种质资源对镰刀菌抗性鉴定结果
Table 2 Resistance identification of lily germplasm to Fusarium oxysporium
组别
Group
名称
Name
感染指数
Disease index
抗性
Resistance
Berlin 26.7 ± 3.4 中抗 Middle resistant
Aberlour 34.5 ± 4.5 中抗 Middle resistant
Mero Star 45.6 ± 3.4 中抗 Middle resistant
Acapulco 52.5 ± 1.7 中感 Middle susceptible
Egypt 53.3 ± 1.1 中感 Middle susceptible
Caruso 53.9 ± 2.8 中感 Middle susceptible
Paramount 64.5 ± 1.2 中感 Middle susceptible
东方百合
Oriental hybrids
Monrovia 70.6 ± 1.7 中感 Middle susceptible
Gorden Globe 16.5 ± 0.9 高抗 High resistant
Lemon Pixie 25.0 ± 0.6 中抗 Middle resistant
Kansas 25.0 ± 1.7 中抗 Middle resistant
Saniciro 35.2 ± 3.0 中抗 Middle resistant
亚洲百合
Asiatic hybrids
Tropic 46.4 ± 2.0 中抗 Middle resistant
野生种 大花卷丹 L. leichtlinii var. maximowivzii Baker 15.9 ± 3.7 高抗 High resistant
Wild species 湖北百合 L. henryi var. Baker 16.1 ± 2.8 高抗 High resistant
宜兴百合 L. lancifolium Thunb 28.7 ± 2.0 中抗 Middle resistant
淡黄花百合 L. sulphureum Baker apud Hook. f 33.9 ± 2.8 中抗 Middle resistant
紫脊百合 L. leucanthum Baker var. centifolium 53.4 ± 2.3 中感 Middle susceptible
玫红百合 L. amoenum Wilson ex Sealy 54.5 ± 2.3 中感 Middle susceptible
台湾百合 L. formosanum Wallace 57.5 ± 1.9 中感 Middle susceptible

2.2 SSH 文库构建及抗病相关 ESTs 表达谱分析
2.2.1 百合尖孢镰刀菌诱导的大花卷丹 SSH 文库构建
对正、反向文库各随机挑取的 384 个白斑克隆进行 PCR 扩增后电泳检测，结果（图 1）表明，
绝大部分克隆中含有插入片段，集中在 200 ~ 2 000 bp 之间，大部分为单片段插入，说明文库构建
过程中 RsaⅠ酶切较为彻底，连接和转化效果较好。



图 1 文库克隆插入片段 PCR 检测
M：DL2000 marker；1 ~ 15：文库中随机挑取的克隆。
Fig. 1 The detection of the insert fragment in library clones
M：DL2000 marker；1–15：Random selected single clone in library.

分别用正、反向消减 cDNA 的 PCR 产物为探针（分别为 MT 和 MC）对文库进行斑点杂交筛选
（图 2），用 optiquant 软件对杂交结果进行扫描对比分析，确定只在 tester 探针杂交膜上出现杂交
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斑点，或是在两种杂交膜上均出现杂交斑点但杂交信号强度 tester 比 driver 高 2 倍以上的克隆为阳
性表达克隆。最终从正、反向 SSH 文库中共得到 160 个阳性克隆。其中正向文库 100 个，反向文库
60 个。



图 2 斑点杂交结果
A、B：分别以 MT 和 MC 作为探针杂交结果。
Fig. 2 The results of dot blot hybridization
A，B：The results of blot hybridization with MT and MC probe，respectively.


在正向 SSH 文库阳性克隆中，根据斑点杂交扫描信号强度由高至低顺序挑选 50 个克隆进行测
序，测序结果通过 NCBI 进行 BLAST 比对分析。除假定蛋白、无同源和序列太短无法匹配外，共
得到有一定具体功能的 26 条 ESTs，功能主要涉及物质与能量代谢、信号转导、蛋白质合成与代谢、
抗病防御等途径（表 3），其中推测与抗病相关的 ESTs 有 6 种，共 10 条。

表 3 正向 SSH 文库中部分阳性克隆的生物信息学分析结果
Table 3 The results of some positive clones in forward SSH library by bioinformatic analysis
克隆号
Cloning
序列长度/ bp
Length
同源基因
Homologous gene
E-值
E-value
MT-A01 552 60S 核糖体蛋白 L23 60S ribosomal protein L23[Zea mays] 4e-07
MT-A10 249 4–香豆酸脂酰辅酶 A 连接酶 4-coumarate-CoA ligase[Solanum chilense] 3e-35
MT-A11 207 几丁质酶 Chitinase[Hypocrea lixii] 7e-04
MT-B06 510 40S 核糖体蛋白 S5 40S ribosomal protein S5[Capsicum annuum] 9e-14
MT-B12 367 草酰辅酶 A 脱羧酶 Oxalyl-CoA decarboxylase [Vitis vinifera] 3e-62
MT-C02 400 S–腺苷甲硫氨酸合成酶 S-adenosyl methionine synthetase[Pinus taeda] 6e-56
MT-C09 402 26S 蛋白酶调节亚基 26S protease regulatory subunit[Arabidopsis thaliana] 8e-81
MT-E01 442 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Serine/threonine protein kinase[Glycine max] 5e-08
MT-F04 786 谷胱甘肽 S–转移酶 Glutathione S-transferase[Ricinus communis] 3e-99
MT-F05 670 过氧化物酶 Peroxidase[Gossypium hirsutum] 1e-26
MT-G03 837 亲环素 Cyclophilin[Tagetes patula] 3e-72
MT-G11 380 核酮糖–1，5–二磷酸羧化酶/加氧酶小亚基 Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/
oxygenase small subunit[Fritillaria agrestis]
1e-43
MT-G12 623 3–脱氧–D–阿拉伯庚酮糖–7–磷酸合成酶 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate
7-phosphate synthase[Vitis vinifera]
2e-120

6 期 马璐琳等：百合抗镰刀菌资源鉴定及抗病相关基因筛选 1147

2.2.2 正向 SSH 文库中部分抗病相关 ESTs 的半定量 RT-PCR 分析
为验证 SSH 结果的可靠性，根据文库中克隆测序结果，从 6 种 10 条抗病相关 ESTs 中，选取了
4 种相关报道较多，序列较长，便于设计引物进行表达分析的 ESTs，设计特异引物进行表达分析，
以百合 Actin 基因作为内参。
半定量 RT-PCR 结果显示，正向 SSH 文库中的 4 个抗病相关 ESTs 在一定程度上都受百合镰刀
菌诱导而上调表达，并且表达趋势基本相同，仅在表达最高峰值上有一定差别。4 个抗病相关 ESTs
都是在 0 h 时段表达量最低，从 6 h 时段表达水平开始升高，其中 S/TPK 和 GST 在 48 h 达到最高峰
值，在 72 h 迅速降低；POD 和 CYP 的表达最高峰值则分别是在 12 和 24 h，然后逐渐降低，直到
72 h 时段（图 3）。



图 3 部分差异表达序列的半定量 RT-PCR 分析
Fig. 3 The semi-quantitative RT-PCR results of some differentially expressed ESTs

3 讨论
3.1 百合种质资源镰刀菌抗性鉴定
由于百合种球生长周期较长，鳞片（或组培）小籽球需经过 1 ~ 2 年的时间才能培育成商品种
球，加之部分野生百合资源种球数量少，退化严重，因此难以满足试验要求，而采用百合组培生根
苗进行镰刀菌抗性鉴定，不仅可以缩短试验周期，而且避免了田间各种环境因素的影响。但同时由
于种球的稀少而无法进行田间抗病鉴定，所以在下一步工作中将对一些种球稀少的百合资源通过组
培扩大繁殖，在田间载体条件下对其镰刀菌枯萎病抗性进行鉴定，结合现有室内抗病鉴定结果，对
百合资源的镰刀菌抗性做进一步的鉴定评价。
在鉴定的东方百合和亚洲百合两大类中，亚洲百合对镰刀菌抗性最好，东方百合抗性较差，这
与 Löffler 等（1996）的研究结果相一致。中国野生百合中的大花卷丹、湖北百合、淡黄花百合、宜
兴百合等对镰刀菌均表现抗病，其中大花卷丹、湖北百合表现为高抗。本结果将对我国野生百合资
源的充分研究和利用，抗病基因的筛选发掘以及自主知识产权优良抗病百合品种的选育提供一定研
究基础。
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3.2 百合尖孢镰刀菌诱导的 SSH 文库构建及抗病相关 ESTs 表达谱分析
本研究中利用 SSH 技术对中国野生百合大花卷丹经百合镰刀菌诱导后的叶组织基因表达谱进
行了分析，发现经镰刀菌诱导后有大量差异表达的基因，其中镰刀菌处理后的正向文库中上调表达
较明显的有 100 个，反向文库中上调较明显有 60 个。从基因作用的角度看，直接参与抗病的基因可
能更易受镰刀菌诱导，因此更应关注那些经镰刀菌处理的正向 SSH 文库中上调（差异）表达较明显
的基因。另外，镰刀菌在侵染植物时还往往会产生一定的毒素，如禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀
菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）毒素，而这些毒素又可能损伤植物细胞膜，抑制植物体内蛋白质
的合成（马璐琳 等，2009），从而可能会使镰刀菌处理的正向文库中的部分基因下调表达，而使反
向文库中部分基因相对上调表达。然而反向文库的这部分差异表达的基因是否与抗病有关，还需要
进一步研究。
基因功能注释表明，在百合尖孢镰刀菌诱导后的大花卷丹叶组织正向 SSH 文库差异表达 ESTs
中，抗病相关基因有 6 种共 10 条，涉及几丁质酶（Chitinase）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Serine/threonine
protein kinase，S/TPK）、S–腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosyl methionine synthetase，SAMS）、谷
胱甘肽 S–转移酶（Glutathione S-transferase，GST）、过氧化物酶（Peroxidase，POD）和亲环素
（Cyclophilin，CYP）等基因。由于关于百合镰刀菌抗性基因的研究鲜见报道，所以以上这些基因
是否与百合镰刀菌枯萎病抗性直接相关还需研究。但在这些抗病相关基因中，有的已被报道并推测
可能与其它植物的镰刀菌抗性有关，如：研究者推测某些抗赤霉病小麦品种中的 GST 基因可能参与
了小麦对禾谷镰刀菌的抗病过程（Kruger et al.，2002；林凡云 等，2008；马璐琳 等，2009），但
GST 在易感镰刀菌枯萎病的其它植物中还鲜见报道；Chitinase、S/TPK 及 POD 等则可能与小麦（Kong
et al.，2005）、西瓜（Xu et al.，2008；吕桂云 等，2010）、黄瓜（周新刚，2009）、香蕉（Thangavelu
et al.，2003）等作物的镰刀菌病害抗性有关。此外，以上这几类抗病相关基因对多种植物中的其它
不同病害也具有一定抗性或受多种病菌诱导表达（Gowri et al.，1991；Kawalleck et al.，1992；Fan et
al.，2007； Lee et al.，2007；李星 等，2008；张建文 等，2009；朱妍和王超，2010）。SSH 文库
结果显示抗病相关基因的功能涉及多种类型，表明有多个抗性相关基因参与了百合的镰刀菌抗病途
径中的抗病反应，百合对镰刀菌枯萎病的抗性途径是一个多基因控制的复杂过程。
本研究中选择 4 个抗病相关 ESTs 进行半定量 RT-PCR 分析，结果与 SSH 文库相一致，说明 SSH
技术不失为一种较大规模分析和筛选百合镰刀菌抗性相关基因高效而准确的手段。这 4 个 ESTs 都
是受百合镰刀菌诱导上调表达的，说明它们可能与百合抗镰刀菌枯萎病有关，然而，它们在百合中
还鲜见报道。由于植物抗镰刀菌病害机制的多样性、复杂性，因此要全面揭示百合抗镰刀菌的分子
机制，有必要在以后的工作中对大花卷丹中这几类可能与抗百合镰刀菌有关的基因进一步系统研究，
透彻分析和了解它们的功能和机理，为百合抗镰刀菌枯萎病相关基因克隆及百合抗病育种奠定基础。
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《新编拉汉英植物名称》

本书收集具有经济价值和学术价值或通俗常见的种子植物、蕨类植物、苔藓植物、藻类植物、真菌、地衣
名称 55 800 条。每种植物名称有拉、汉、英三种文字对照，按拉丁文字母顺序排列。书后附有英文俗名和汉名
索引。本书可供农、林、医药、环境保护等学科的管理机构、科研单位、大学中的科技人员以及生物工程、植物检
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