全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（2）：327–334 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2010–06–21；修回日期：2011–01–15
基金项目：国家科技支撑计划项目（2006BAD07B05，2006BAD01A18）；国家‘863’计划项目（2006AA100109）；北京市山区百合国
产化关键技术与产业化开发项目（YLHH2006001）；农业部园艺作物遗传育种重点开放实验室项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：liuchun@mail.caas.net.cn）
岷江百合悬浮细胞系的建立及植株再生
姜新超，刘 春*，明 军，穆 鼎，袁素霞
（中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081）
摘 要：以岷江百合（Lilium regale Wils.）颗粒细小、结构松散的乳白色愈伤组织为起始材料，接种
在 MS（NH4NO3 含量减半）+ 2.0 mg · L-1 picloram + 30 g · L-1蔗糖液体培养基上，在 25 ℃黑暗条件下振
荡（100 r · min-1）培养 10 ~ 20 d，建立分散性好、均匀、生长迅速的悬浮细胞系。在悬浮细胞系培养过
程中研究了不同参数对其生长的影响，结果表明：在 40 mL 培养液中接种量为 0.5 g（鲜样质量），18 d
继代 1 次，继代时保留 1/3 体积的旧培养液有利于其细胞增殖。将悬浮细胞转移到 1/2MS + 30 g · L-1蔗糖
的再生培养基上成功获得再生植株。
关键词：百合；岷江百合；悬浮细胞系；植株再生
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）02-0327-08

Establishment of Cell Suspension Culture and Plantlet Regeneration of
Lilium regale
JIANG Xin-chao，LIU Chun*，MING Jun，MU Ding，and YUAN Su-xia
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）
Abstract：Cell suspension culture of Lilium regale Wils. were initiated from creamy-white nodular
callus with loose structure. They were cultured in modified liquid MS medium（NH4NO3 with
half-strength）supplemented with picloram 2.0 mg · L-1 and sucrose 30 g · L-1，and shook at 100 r · min-1
under dark condition at 25 ℃. About 10–20 days after，stably growing cell suspensioncultures were
established. The growth pattern of the cultures was investigated and the optimal parameters were：0.5 g
（FW）initial inoculum per 40 mL liquid medium，a sub-culture every 18 days，and 1/3 volume of old
liquid medium left during subculture. Suspension cells regenerated plantlets on solid 1/2MS medium with
30 g · L-1 sucrose.
Key words：Lilium spp.；Lilium regale Wils.；cell suspension culture；plantlet regeneration

百合（Lilium spp.）现有品种主要来源于常规杂交育种，但其种间杂交不亲和性限制了其远缘杂
种的获得。切割柱头的授粉方式和早期胚胎拯救等手段可以在一定范围内克服远缘杂交障碍，获得
新种质，但不能解决所有期望杂交组合的成功或优良性状的组合。体细胞杂交技术（somatic
hybridization）可以将植物不同种、属，甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合并再生杂种植株，
是获得远缘杂种的一种有效手段（Evans，1983）。

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体细胞杂交成功的关键之一是获得大量有活力的原生质体。在百合原生质体研究中，对愈伤组
织（Simmonds et al.，1979）、花粉（Tanaka et al.，1987）和生殖细胞（Tanaka，1987）均分离到了
大量原生质体，但未获得再生植株，在芽原基（Sugiura et al.，1993）中分离的原生质体可以再生，
但试验操作复杂、可重复性差。悬浮细胞系是分离原生质体的理想材料，它分离的原生质体活力强，
可成功再生植株（Mii et al.，1994；Godo & Mii，1996；Horita et al.，2002）。Horita 等（2003）利
用悬浮细胞系分离的原生质体杂交，成功获得了第一例百合体细胞杂种植株。与茎尖、愈伤组织等
其它材料相比，悬浮细胞系有增殖快、去壁容易、分离得到的原生质体活力强等优点。然而目前已
成功建立悬浮细胞系的百合品种有限，主要集中在东方百合（Oriental hybrid lily）（Horita et al.，2002，
2003）和新铁炮百合（Lilium × formolongi）（Mii et al.，1994；Godo & Mii，1996；Chin-wen Ho et al.，
2006），同时这些悬浮细胞系还存在建立时间长（一般需 2 ~ 3 个月）和难以长期保存等问题。因此，
迫切需要建立更多种类、具有良好状态的百合悬浮细胞系，以提供更多具有优良性状的材料供体细
胞杂交育种选择。
岷江百合（Lilium regale Wils.）原产于中国四川岷江流域，具有耐盐碱、抗旱、抗病毒能力强
的优点，是重要的抗病毒、耐盐碱百合育种亲本材料，目前尚未见到将其应用于体细胞杂交育种相关
研究的报道。前人的研究发现，生长素 picloram 可能是百合属植物愈伤组织诱导和保持的必要条件（Han
et al.，2000）；愈伤组织是悬浮培养的起始材料，也是悬浮培养能否成功的关键因素（杨远媛 等，2005；
赖钟雄 等，2007；周晓罡 等，2008）；不含植物生长调节剂的 MS 培养基上悬浮细胞再生情况良好
（Mii et al.，1994；Nakano et al.，2000；Ho et al.，2006）。本试验中利用生长素 picloram 进行岷江
百合愈伤组织诱导和悬浮培养，选取分散性好、没有任何组织结构和原胚分化的愈伤组织为起始材
料，在降低了 MS 中大量元素含量和蔗糖浓度的培养基上进行悬浮细胞再生，以期在短时间内建立
岷江百合优良的悬浮细胞系，并将悬浮细胞成功再生，为岷江百合抗性优异基因的利用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
岷江百合愈伤组织是由中国农业科学院蔬菜花卉研究所百合组实验室培养的试管鳞茎的鳞片在
MS + 2.0 mg · L-1picloram + 30 g · L-1 蔗糖 + 3.6 g · L-1 琼脂培养基上诱导形成，诱导培养条件为 25
℃， 60 μmol · m-2 · s-1 连续光照，继代培养条件为 25 ℃，黑暗培养。该愈伤组织（图 1，A）呈乳
白色，结构松散，颗粒细小，没有任何组织结构和原胚分化，分散性好。
试验时间为 2008 年 6 月—2010 年 4 月。
1.2 方法
1.2.1 悬浮细胞系的建立
取愈伤组织鲜样质量 2 g，接种到 100 mL 三角瓶中，加入 40 mL 培养液〔MS（NH4NO3 含量减
半）+ 2.0 mg · L-1 picloram + 30 g · L-1 蔗糖，pH 5.8〕，置于 25 ℃恒温摇床上（100 r · min-1）在黑暗
条件下培养。培养前期，每隔 3 d 继代 1 次，继代 2 ~ 3 次后，7 d 继代 1 次。继代时将三角瓶置于
无菌操作台中静置 10 min，待所有细胞沉到瓶底后，倒掉上部的旧培养液，补充新鲜培养液。当继
代 3 ~ 4 次，培养物大量繁殖后，用孔径为 40 目的镍网过滤除去大的细胞团，保留分散良好的悬浮
培养物继续培养，此过程不断重复，以维持悬浮培养物良好分散性。培养过程中采用 OLYMPUS CX31
光学显微镜观察悬浮细胞生长情况，并显微摄影。
2 期 姜新超等：岷江百合悬浮细胞系的建立及植株再生 329

1.2.2 悬浮细胞系培养参数的测定
接种量和继代时间：取 0.5、1.0 和 2.0 g 鲜样质量的悬浮培养物分别接种到装有 40 mL 新鲜培
养液的 100 mL 三角瓶中，每 3 d 测细胞鲜样质量，直到细胞停止增殖。绘制接种量和细胞增殖倍数
曲线，确定悬浮培养的适宜接种量和最佳继代时间。
旧培养液比例：取 0.5 g 悬浮培养物接种到装有 40 mL 新鲜培养液的 100 mL 三角瓶中，7 d 继
代 1 次。继代时用 400 目镍网过滤（悬浮细胞不能经过 400 目镍网而留在镍网内），保留设定的旧培
养液（比例设为 0、1/5、1/3、1/2），补充新鲜培养液至 40 mL，将悬浮细胞重新接种到配比的培养
液继续培养。两次继代后测定细胞鲜样质量，确定继代时保留旧培养液的最适量。
pH 值：取 0.5 g 悬浮培养物，接种到装有 40 mL 培养液的 100 mL 三角瓶中，每 3 d 测定 1 次培
养液的 pH 值，直到细胞停止增殖。
1.2.3 悬浮细胞再生
悬浮细胞继代培养时不进行镍网过滤，直到悬浮细胞长成直径大于 1 mm 的愈伤组织。将愈伤
组织转移到 1/2MS + 30 g · L-1 蔗糖的再生培养基上进行植株再生，得到的再生小苗在 MS + 1.0 g · L-1
IBA + 30 g · L-1蔗糖的培养基上培养成再生鳞茎。培养条件为25 ℃，每天光照8 h，光强60 μmol · m-2 · s-1。
愈伤组织接种到再生培养基上 2 个月后测定其再生频率。
上述所有的试验数据测定均重复 3 次以上。采用 DPS 软件对试验数据进行统计分析。
2 结果与分析
2.1 悬浮细胞系建立过程中培养物形态的变化
愈伤组织接种到液体培养基中即自动散开。培养初期，部分细胞褐化，形态不规则，单细胞比
例相对较小（图 1，B、C），粘壁现象严重，需 3 d 更换 1 次培养基去除褐化死亡的培养物。
图 1 悬浮细胞的培养过程
A：起始接种的愈伤组织乳白色，结构松散，颗粒细小；B：单细胞比例低；C：畸形细胞比例高；
D：单细胞比例高，畸形细胞比例低；E：细胞核明显，内含物丰富；F：悬浮系外观。
Fig. 1 The process of cell suspension cultures
A：Initial callus，granular milky white with loose structure；B：Less single-cell；C：More abnormal cells；D：More single-cell and less abnormal
cells；E：Suspension cells with distinct nucleolus and rich content；F：Established cell suspension culture.
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经过 3 ~ 4 次的继代筛选，培养液清亮、培养物大量繁殖后，用孔径为 40 目镍网过滤掉大细胞
团，得到由单细胞和小细胞团（2 ~ 30 个细胞组成）构成（图 1，D）的培养物。该培养物细胞呈圆
球形，细胞核明显，内含物丰富（图 1，E）。
单细胞和小细胞团经 3 ~ 4 周可长成大细胞团（愈伤组织），因此需周期性（3 ~ 4 周）过滤，以
维持悬浮系良好的分散性。
滤出的大细胞团仍可继续培养，其在培养过程中会分散出单细胞或小细胞团。
从愈伤组织起始接种到建立起分散性好、均一、生长迅速的悬浮细胞系（图 1，F），需 10 ~ 20 d。
2.2 悬浮细胞系培养参数
2.2.1 适宜接种量和最佳继代时间
各接种量与其细胞增殖倍数的相关曲线如图 2 所示，培养 0 ~ 3 d 时各处理的细胞基本不进行增
殖，为细胞的生长延迟期。
从 3 d 时开始细胞开始增殖，6 d 时各处理的增殖倍数相同。
6 d 以后，接种量为 0.5 g 的开始表现出明显的优势，细胞的生长速度不断加快，在 18 d 时达到
最快（曲线斜率最大），此时营养及环境条件比较适宜，但此后虽然细胞不断增殖，但其生长速率下
降，营养及环境条件开始不适宜，培养物表现出褐化死亡现象，到 24 d 时停止生长，培养物褐化现
象严重。
由此可见，3 ~ 24 d 为其对数生长期，24 d 以后为其生长延迟期，18 d 为最佳继代时间。而接
种量为 1.0 g 和 2.0 g 的处理在培养 6 d 以后长势明显差于 0.5 g 的处理，其最佳继代时间为别为 15 d
和 6 d。
结果表明，0.5 g 为最适宜接种量，18 d 为最佳继代时间，在整个生长周期中，悬浮细胞生长速
度较快，增殖倍数达 8 倍左右。
图 2 岷江百合接种量与其细胞增殖倍数的相关曲线
Fig. 2 Relationship between initial cell density and multiple of cell proliferation
2.2.2 继代时旧培养液比例
将悬浮培养物以 40 mL 培养液中接种 0.5 g 的设定量接种，继代两次后绘制继代时旧培养液比
例和细胞增殖倍数的关系图，结果（图 3）表明，保留旧培养液比例为 1/3 时，细胞增殖倍数最高，
可达 10 倍左右；保留 1/2 时细胞增殖倍数略低，可达 8.5 倍；保留 1/5 和完全为新鲜培养基时细胞
增殖倍数最低，约为 8 倍。

2 期 姜新超等：岷江百合悬浮细胞系的建立及植株再生 331










图 3 继代时旧培养液比例对细胞增殖倍数的影响
Fig. 3 Effect of proportion of old liquid medium on multiple of cell proliferation

2.2.3 培养过程中 pH 值的变化
将悬浮培养物以 40 mL 培养液中接种 0.5 g 的设定量接种，测定其一个生长周期 27 d（图 2）内
的 pH 值变化。如图 4 所示，在缓慢生长期（0 ~ 3 d）pH 值由 5.8 迅速下降到 4.0 左右，在对数生长
期（3 ~ 24 d）的前中期保持稳定，到 18 d 后细胞生长减慢，pH 值缓慢上升，到静止期（24 d 后）
稳定到 5.0 左右。

图 4 岷江百合培养过程中 pH 变化与细胞增殖倍数关系曲线
Fig. 4 Relationship between pH value and multiple of cell proliferation
2.3 悬浮细胞再生
单细胞或小细胞团在悬浮培养的条件下 3 ~ 4 周可长成直径大于 1 mm 的愈伤组织（图 5，A）。
将愈伤组织转移到 1/2MS + 30 g · L-1 蔗糖的再生培养基上进行植株再生，在再生初期，愈伤组织死
亡率高，再生物的畸形率高（图 5，D），接种 2 个月时，愈伤组织再生频率约为 40%。若选取存活
的愈伤组织和再生物继续进行继代培养，随着培养时间延长，再生物的畸形现象逐步改善，再生频
率逐渐提高（图 5，E）。当得到的再生小苗基部直径大于 5 mm 时，将其与愈伤组织分离并接种到
MS + 1.0 g · L-1 IBA + 30 g · L-1 蔗糖的培养基上进行再生鳞茎培养，2 个月后，再生小苗即可长成直
径大于 1.5 cm 的再生鳞茎（图 5，F），最终获得 94 株再生鳞茎。
愈伤组织以器官发生途径再生，其再生途径包括两种方式：先生根（图 5，B）发生方式和先长
芽（图 5，C）发生方式。
先生根的发生方式是愈伤组织先长出毛绒状结构或毛绒状根系，此类根系呈黄白色，生长在培
养基表面，不能插入培养基内部吸收营养，未继续发育，在培养过程中逐渐死亡。
先长芽的发生方式是愈伤组织先长出绿色的再生芽，而后再生芽伸长成叶片，叶片基部膨大形
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成鳞茎，鳞茎基部长出根系，此类根系呈白色，表面光滑，可插入培养基内部。这是器官发生途径
中可成功获得完整植株的再生方式。
图 5 悬浮细胞系的再生过程
A：细胞团直径大于 1 mm 的悬浮细胞系；B：愈伤组织表面长出毛绒状结构或毛绒状根系；C：愈伤组织再生小苗；
D：愈伤组织死亡率高，再生物的畸形率高；E：再生物的畸形现象逐步改善，
再生频率逐渐提高；F：再生鳞茎。
Fig. 5 The regenerating process of cell suspension cultures
A：Cell suspension with the diameter of cell groups over 1 mm；B：Regenerating callus with plush-like structure or plush roots；
C：Regenerating callus with shoot；D：More died callus and abnormal plantlet；E：More normal plantlet and high
regeneration rate；F：Regenerated bulbs.
3 讨论
悬浮细胞系建立的关键是挑选适合于悬浮培养的愈伤组织（杨远媛 等，2005；赖钟雄 等，2007；
周晓罡 等，2008）。本实验室曾用 6-BA 与 NAA 组合，KT 与 NAA 组合，麦草畏（3,6–二氯–2–
甲氧基苯甲酸）与 NAA 组合，2,4-D 与 NAA 组合，2,4-D 与 6-BA 组合进行岷江百合愈伤组织诱导，
得到的愈伤组织结构不够松散，未能建立理想的细胞悬浮系（刘坤，2007）。本试验中采用生长素
picloram 诱导愈伤组织后，提高了诱导率，并得到了结构疏松、分散性好的愈伤组织，从而建立了
均一、生长迅速的岷江百合悬浮细胞系。
与前人的研究（Mii et al.，1994；Godo & Mii，1996；Horita et al.，2002）相比，本研究中由于
选用了具有良好状态的愈伤组织，悬浮细胞系的建立时间大大缩短，由 2 ~ 3 个月缩短为 10 ~ 20 d，
并且其单细胞比例高，在静置条件下酶解 1 h 即可得到大量的原生质体（数据未发表）。
接种量、继代时间、旧培养基比例对悬浮细胞系生长增殖的影响显著（孙敬三和桂耀林，1995）。
接种量过少达不到一定的细胞密度，细胞不进行分裂；接种量过多，培养基营养供应不足，需缩短
继代时间，且细胞死亡率增加。
继代时间太短，细胞生长处于延迟期，细胞增殖少；继代时间过长，培养液中营养耗尽，细胞
分泌有害物质，细胞死亡。
旧培养基中可能含有利于细胞增殖的物质，但如果旧培养基在继代时比例过高可能会造成营养
不足或有害物质增加，不利于细胞增殖。
本试验中研究了岷江百合悬浮系的相关参数，结果表明：接种量为 40 mL 培养液中接种 0.5 g，
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18 d 继代 1 次，继代时保留 1/3 旧培养基利于悬浮细胞系增殖，每次继代可增殖 8 倍，远远高于前
人（Godo & Mii，1996；Tribulato et al.，1997；Ho et al.，2006）的相关研究（2 ~ 3 倍，14 d）。同
时，试验中发现，接种量分别为 0.5 g、1.0 g 和 2.0 g，培养 6 d 时 3 个处理的增殖倍数相同，均为 2
倍左右，若此时进行继代，在 18 d 时各处理细胞增殖均可达到 8 倍左右。因此，若要使悬浮细胞快
速增殖，可选用 2.0 g 接种量，6 d 继代 1 次，这样可以在达到相同增殖效果的同时降低工作量。
试验中测定了一个生长周期（27 d）内培养液 pH 值变化，pH 值在接种后由 5.8 迅速下降到 4.0
左右，类似的变化在许多物种悬浮细胞培养中也有报道（孙世孟 等，1994；陈发棣 等，2006；Azevedo
et al.，2008）。这种变化可能是起始愈伤组织对新环境的适应性反应，其细胞间可能含有大量的酸性
分泌物，被接种到培养液中后酸性物质释放致使培养液 pH 值降低。pH 值在经过起始的大幅度下降
之后，在很长一段时间内均保持在 4.0 左右，此时细胞处于生长对数期，细胞生长迅速，说明 4.0
可能是岷江百合悬浮系生长的最适宜 pH 值。从 18 d 开始，细胞增殖减缓，培养物褐化死亡现象严
重，pH 值开始上升，这可能与死亡细胞时内含物释放有关。
前人研究结果表明，百合悬浮细胞在不含植物生长调节剂的 MS 培养基上再生率高且大部分以
胚胎途径再生（Mii et al.，1994；Nakano et al.，2000；Ho et al.，2006），但本试验中悬浮细胞在不
含植物生长调节剂的 MS 培养基上是通过器官发生途径再生成植株，且再生频率偏低。这说明不含
植物生长调节剂的 MS 培养基可能并不适于岷江百合悬浮细胞再生，需要进一步研究以提高其再生
率。

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