全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（11）：2280–2286 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2013–05–02；修回日期：2013–09–04
基金项目：山东省农业良种工程项目（鲁农良种字〔2010〕117 号）；国家科技部成果转化项目（2006GB2C600167）；镇江市科技支撑
计划项目（NY2013028）；济南市科技明星计划项目（20120126）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lianghuimin0218@126.com；xiayang0506@126.com）
基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析
刘翠兰 1,3，燕丽萍 1,3，毛秀红 1,3，孙 超 1,3，夏 阳 1,3,*，梁慧敏 2,*
（1 山东省林业科学研究院，济南 250014；2江苏农林职业技术学院，江苏句容 212400；3 山东省林木遗传改良重点
实验室，济南 250014）
摘 要：以红叶石楠（Photinia fraseri）的胚性愈伤组织为受体材料，利用基因枪法导入外源抗寒基
因 rd29A，以期建立基因枪转化红叶石楠的技术体系。结果表明，基因枪转化红叶石楠的最佳组合条件为：
胚性愈伤组织在诱导培养基 MS + 6-BA 2.0 mg · L-1 + NAA 5.0 mg · L-1 + 2,4-D 0.5 mg · L-1 + 琼脂 5.0
g · L-1 + 蔗糖 20 g · L-1里，用 0.3 mol · L-1 甘露醇处理 15 ~ 16 h；基因枪轰击时添加 12.5 mol · L-1氯化钙
50 μL + 0.1 mol · L-1亚精胺 50 μL，每枪含金粉 300 μg + 质粒DNA 3.0 μg，轰击距离 9 cm，轰击压力 1 100 psi，
轰击次数 1 次。经多次筛选获得了 6 株转基因植株，转化植株经 PCR 检测和 Southern 分析，证实了 rd29A
已经整合到红叶石楠基因组中。
关键词：红叶石楠；rd29A；基因枪介导；转基因植株
中图分类号：S 68 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）11-2280-07

Studies on the Genetic Transformation Factors of Photinia fraseri Using
Microprojectile Bombardment
LIU Cui-lan1,3，YAN Li-ping1,3，MAO Xiu-hong1,3，SUN Chao1,3，XIA Yang1,3,*，and LIANG Hui-min2,*
（1Shandong Provincial Academy of Forestry，Ji’nan 250014，China；2Jiangsu AgricμLture and Forestry Profession
Technology College，Jurong，Jiangsu 212400，China；3Shandong Provincial Key Laboretory of Forest Genetic Improvement
Tree，Ji’nan 250014，China）
Abstract：The study has transformed the cold resistant gene rd29A into the acceptor，the embryo
callus derived from Photinia fraseri leaf，in order to establish the transformation system by using particle
bombardment method. The results indicate that the optimal transformation scheme for Photinia fraseri leaf
callus using particle bombardment method was treating embryogenic callus tissue within 0.3 mol · L-1
mannitol for 15–16 h，in MS medium supplemented with 2.0 mg · L-1 6-benzy aminopurine，5.0 mg · L-1
napthaleneacetic acid，0.5 mg · L-1 2,4-dichlorophenoxyacetic acid，5.0 g · L-1 agar powder and 20 g · L-1
glucose. When particle bombardmenting，in addition of 12.5 mol · L-1 CaCl2 50 μL and 0.1 mol · L-1
spermidine 50 μL，and bombarding the samples once a time，at 9 cm bombardment distance，at 1 100 psi
heli μm pressure and with the dosage of gold powder 300 μg and plasmid DNA 3.0 μg per bombardment.
Six transgenic Photinia fraseri plants were obtained in the study and it was confirmed that the rd29A gene
was integrated into Photinia fraseri genomes according to the PCR and Southern analysis of plant DNA.

11 期 刘翠兰等：基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析 2281

Key words：Photinia fraseri；rd29A；microprojectile bombardment；transgenic plants

红叶石楠是光叶石楠（Photinia glabra）和石楠（P. serralata）杂交选育的栽培品种（张虎 等，
2003），其叶片表面光亮，幼叶鲜红，观赏性强，在中国南方地区广泛种植。为适合于全国不同地理
环境栽植，需要在增强观赏性的同时提高其耐寒性。林木上的传统育种是个非常漫长的过程，植物
基因工程的应用克服了传统育种的不足（Woodson，1991）。转基因技术已在多种植物上获得了成功
（夏阳 等，2004；梁慧敏 等，2005；燕丽萍 等，2009，2011；刘翠兰 等，2011；Yan et al.，2012）。
有关红叶石楠的研究也仅限于组织培养方面，再生植株体系建立和遗传转化的报道极少（Rafael et
al.，1997）。红叶石楠在根癌农杆菌介导下最终转化体极少，因为农杆菌（Agrobacteri umtutnefaciens）
侵染红叶石楠叶片后，农杆菌很难被抑制（刘翠兰 等，2010），再加上内生菌（Endophytical bacteria）
的污染，导致红叶石楠试管苗移栽困难和死亡（周俊辉 等，2003）。而利用基因枪法就可以避免不
同菌叠加污染的发生。
本试验中利用基因枪法将抗寒基因 rd29A 导入红叶石楠胚性愈伤组织，对影响基因枪轰击转化
的因素进行了探索，为建立有效、较为完善的红叶石楠基因枪转化体系提供理论依据，为最终培育
出抗寒红叶石楠种质材料奠定基础。
1 材料与方法
1.1 植物材料与培养基
山东省林木遗传改良重点实验室提供红叶石楠组培苗。以 MS 为基本培养基。胚性愈伤组织诱
导培养基 H1：MS + 6-BA 2.0 mg · L-1 + NAA 5.0 mg · L-1 + 2,4-D 0.5 mg · L-1 + 琼脂 5.0 g · L-1 + 蔗糖
20 g · L-1，pH 5.8 ~ 6.0。预处理培养基 H2：MS + 6-BA 2.0 mg · L -1 + NAA 5.0 mg · L-1 + 2,4-D 0.5
mg · L -1 + 不同浓度甘露醇（0.1、0.3、0.5 mol · L-1）+ 琼脂 5.0 g · L-1 +蔗糖 20 g · L-1，pH 5.8 ~ 6.0。
分化筛选培养基 H3：MS + 6-BA 1.0 mg · L-1 + KT 1.0 mg · L-1 + IBA 0.5 mg · L-1 + Kan 50 mg · L-1 + 琼
脂 5.5 g · L-1+蔗糖 30 g · L-1，pH 5.8 ~ 6.0。生根培养基 H4：1/2MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 0.25
mg · L-1+ NAA 0.1 mg · L-1 + Kan 50 mg · L-1 + 琼脂 5.0 g · L-1+蔗糖 30 g · L-1，pH 5.8 ~ 6.0。
1.2 质粒及其制备
质粒 pCAMBIA2300，长度约 8.7 kb，含有耐盐、抗寒基因 rd29A（约 2.1 kb）和抗 Kan 基因
NPTⅡ（约 0.7 kb）（图 1），由山东省林木遗传改良重点实验室提供。采用碱裂解法提取质粒 DNA，
并用 PEG 沉淀法进行纯化（Sambrook et al.，1989）。

图 1 pCAMBIA2300-rd29A 的 T-DNA 区
Fig. 1 The T-DNA region of plasmid pCAMBIA2300-rd29A
1.3 基因枪介导的遗传转化
1.3.1 受体的准备
在超净工作台上剪取红叶石楠组培苗叶片，将其叶片边缘切去，沿叶脉横切成 1 cm2 小块，于
2282 园 艺 学 报 40 卷
培养基 H1 上预培养。组培室内白天 25 ℃、夜间 18 ℃，15 d 后叶片边缘长满了致密的胚性愈伤组
织，把胚性愈伤组织分成约 0.5 cm3 小块转移培养基 H2 上，添加不同浓度（0、0.1、0.3、0.5 mol · L-1）
甘露醇进行渗透处理 15 ~ 16 h。每处理重复 3 次，每皿 30 个胚性愈伤组织块，待轰击。
1.3.2 DNA金粉子弹的制作
称取颗粒大小为 1.0 μm 的金粉 3 mg 放于 1.5 mL 离心管中，加入 1 mL 70%的酒精，剧烈涡漩 3 ~
5 min，静止 15 min；14 000 r ∙ min-1 离心 10 s，去上清液；加入 1 mL 无菌水，剧烈涡漩 1 min，静
止 1 min；14 000 r ∙ min-1 离心 10 s，去上清液，重复清洗 3 次；加入 500 μL 无菌甘油，剧烈涡漩 5
min，打破凝集，分成每管 50 μL，金粉量每管 300 μg；金粉分散后依次加入 rd29A 质粒 DNA 3 μL
（浓度 1 000 μg ∙ L -1），不同 DNA 沉淀剂：CaCl2（12.5 mol ∙ L-1）50 μL、亚精胺（0.1 mol ∙ L-1）50
μL、CaCl2（12.5 mol ∙ L-1）50 μL + 亚精胺（0.1 mol ∙ L-1）50 μL，边涡旋边加样；继续涡旋 2 ~ 3 min，
静止 1 min；14 000 r ∙ min-1 离心 2 s 后去除上清液，加 140 μL 70%乙醇，静止沉淀，14 000 r ∙ min-1
离心 2 s 后去除上清液；加 48 μL 无水乙醇，轻弹管壁数次，低速下涡旋 2 ~ 3 s，然后取样加在微弹
载体上，即每枪含金粉 300 μg + 质粒 DNA 3.0 μg。
1.3.3 基因枪轰击
采用高速氦气基因枪 PDS-1000/He（Bio-Rad）进行轰击。轰击参数为真空度大于 28 inHg，气
体压力 1 100 psi，每皿轰击 1 次，轰击距离分别设为 6、9 和 12 cm，重复 3 次。轰击后的材料转入
不加甘露醇的培养基 H1 上继续黑暗培养，有助于修复金粉颗粒造成的损伤，并促使胚性愈伤组织继
续发育，5 d 后转入抗性培养基 H3 上，于组培室内白天 25 ℃、夜间 18 ℃、光强为 2 000 lx 的条件
下进行分化筛选培养，在上述步骤中均设有未轰击的材料作对照。
1.4 转基因植株的分子检测方法
1.4.1 PCR检测
取抗性植株叶片，按 CTAB 法提取总 DNA（王关林和方宏筠，1998），未转化植株 DNA 为阴
性对照，以 rd29A 基因的引物进行扩增。上游引物序列为 F：5′-CGAGGATCCTCTCTTAAAGCTCCTT-
3′，下游引物序列为 R：5′-TCTAGGGTACC GTGGAAAATGGATC-3′（上海生工），扩增片段为长度
2 100 bp。PCR 反应体系为 2× Taq PCR MasterMix 12.5 μL（天根生化科技有限公司），F（10 mmol · L-1）
1 μL，R（10 mmol · L-1）1 μL，模板 DNA（20 ng）2 μL，ddH2O 8.5 μL 总体积为 25 μL。扩增程序
为：95 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min，循环 44 次，72 ℃延伸
10 min。取 8 L 扩增产物用 1.0%的琼脂糖凝胶电泳，GeneGenius 全自动凝胶成像分析系统观察结
果并照相。
1.4.2 Southern分析
对 PCR 阳性株进行 Southern 杂交，以 pCAMBIA2300-rd29A 质粒作模板进行 PCR 扩增，回收
的 PCR 产物即作为 Southern 杂交的探针。Southern Blot 采用 Boehringer Manheim 公司生产的 Dig
High Prime Labeling and Detection Starter KitⅠ，具体操作过程依据试剂盒使用说明书，限制性内切
酶选用 EcoRⅠ和 PstⅠ。
2 结果与分析
2.1 轰击前的渗透处理对转化效率的影响
在培养条件相同的情况下，添加不同浓度的甘露醇进行渗透处理 15 ~ 16 h，结果表明：随着甘
11 期 刘翠兰等：基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析 2283

露醇浓度的加大，转化率也呈增加趋势，但增加比率与加大浓度不成正比。红叶石楠胚性愈伤组织
在未进行甘露醇处理时转化率为 0，在添加 0.1 mol · L-1 的甘露醇处理时转化率为 1.4%，添加 0.3
mol · L-1 时转化率为 1.8%，添加 0.5 mol · L-1 时转化率为 1.5%（图 2，A）。高渗处理浓度的加大同
时也增加了胚性愈伤组织的损伤，变得软而疏松，加上微弹的轰击，在筛选分化过程中容易引起细
胞的死亡，从而降低了转化效率。所以在基因枪转化时高渗处理浓度不宜太大，添加甘露醇浓度为
0.3 mol · L-1 较为合适。
2.2 DNA 沉淀剂对转化效率的影响
在制备轰击微弹时，添加不同 DNA 沉淀剂：氯化钙、亚精胺、氯化钙 + 亚精胺，转化效果不
同。经 60 ~ 90 d 抗性筛选统计，添加 12.5 mol · L-1 氯化钙 50 μL，转化率为 1.6%，添加 0.1 mol · L-1
亚精胺 50 μL，转化率为 1.7%，添加 12.5 mol · L-1 氯化钙 50 μL + 0.1 mol · L-1 亚精胺 50 μL，转化率
为 2.1%（图 2，B）。
2.3 基因枪轰击距离对转化效率的影响
基因枪轰击时，采用不同的轰击距离，经过分化筛选后统计转化率。由图 2，C 可见，当轰击
距离为 6、9、12 cm 时，转化率分别为 1.1%、1.7%、1.5%。研究结果表明，真空度大于 28 inHg，
气体压力 1 100 psi，轰击距离为 9 cm，轰击 1 次时，转化效率最高为 1.7%。



图 2 渗透处理（A）、不同沉淀剂（B）和轰击距离（C）对转化效率的影响
Fig. 2 Effects of osmotic treatment（A），different precipitant（B），
shoot distance（C）on calli transformation efficiency

2.4 转基因植株的获得
经上述试验确定最佳的基因枪转化参数为：胚性愈伤组织在诱导培养基 H1 里，用浓度为 0.3
mol · L-1 甘露醇处理 15 ~ 16 h，基因枪轰击时添加 12.5 mol · L-1 氯化钙 50 μL + 0.1 mol · L-1 亚精胺
50 μL，每枪含金粉 300 μg + 质粒 DNA 3.0 μg，轰击压力 1 100 psi，轰击距离 9 cm，轰击次数 1 次。
轰击后的胚性愈伤组织在筛选培养基上生长 6 周后，分化成小植株。
为了进一步减少假阳性，在含 50 mg · L-1 卡那霉素抗性分化筛选培养基上再连续筛选 60 ~ 90 d。
把连续筛选后的抗性苗接种到不添加 Kan 的分化培养基 H3 上，进行快繁壮苗生长（图 3），当苗高
3 ~ 5 cm 时接种在含 50 mg · L-1 卡那霉素生根培养基 H4 上诱导生根，生根的植株即为转基因抗性植
株。

2284 园 艺 学 报 40 卷
图 4 转基因植株 PCR 分析
M：DNA 分子量；P：质粒（阳性对照）；WT：阴性对照；1 ~ 6：
转基因植株；7 ~ 9：未转化植株。
Fig. 4 PCR analysis on transgenic plants
M：DNA marker；P：Plasmid as positive control；WT：As negative
control；1–6：Transgenic plants；7–9：Untransformed plants.
图 5 转基因植株 Southern 杂交分析
WT：未转基因植株；T1-2、T1-6：转基因植株。
Fig. 5 Southern analysis on transgenic plants
WT：Non-transgenic plant；
T1-2 and T1-6：Transgenic plant.

图 3 基因枪受体材料筛选与分化
1：叶片诱导胚性愈伤组织；2：抗性苗筛选与分化；3：转基因抗性植株快繁；4：石蜡切片胚性细胞（箭头所示）。
Fig. 3 Selecting and disintegrating of the acceptors
1：Somatic embryo；2：Resistance plant；3：Rapid propagation；4：Embryo cell（the direction of the arrow）.

2.5 转基因植株分子鉴定
选取长势良好的抗性再生苗 9 株，分别提取叶片基因组 DNA，以含 rd29A 基因的质粒作为阳性
对照，未转化株的基因组 DNA 为阴性对照，PCR 扩增电泳检测结果见图 4。由图 4 可见，在反复
检测的 9 株抗性植株中，有 6 株在分子量大小约 2 100 bp 处有一条与质粒扩增产物一致的特异带，
有 3 株未能扩出目的片段，为未转化植株。对 PCR 检测为阳性的 2 号和 6 号植株进行 Southern 杂
交检测（图 5），转化植株出现明显的杂交带，而野生型植株（WT）无杂交信号，表明外源 rd29A
基因已整合到红叶石楠基因组中。


11 期 刘翠兰等：基因枪介导红叶石楠遗传转化因素分析 2285

3 讨论
在影响基因枪转化的因素中，外植体的预处理和 DNA 沉淀剂是影响转化频率的关键因素。Vain
等（1993）在玉米胚性细胞基因枪转化时，用 0.4 mol · L-1 的渗透压在轰击前处理 4 h 和轰击后处理
16 h，可将其 GUS 基因的稳定表达增加 6 ~ 7 倍。梁辉等（1998）在小麦幼胚的基因枪转化中，也
得到相同的结论。本研究中在转化前利用 0.3 mol · L-1 甘露醇高渗处理叶片愈伤组织 15 ~ 16 h 可以
获得较高的转化率，较未处理的受体材料转化率提高 1.8 倍左右（图 2，A）。但高渗处理时间不宜
太长，否则愈伤组织将变得松软而死亡，不能分化成植株，从而对转化产生较大的影响。DNA 沉淀
剂可使 DNA 能更好的附着在微弹上，有效的提高转化频率。从图 2，B 中可以看出：DNA 沉淀剂
的最佳浓度组合氯化钙和亚精胺的组合使用，转化率最高，可能的原因是二者能联合促进质粒 DNA
对金粉微粒的包被，如单独使用，转化率明显降低，其中亚精胺有学者（王鸿鹤 等，2000）认为在
微弹载体制备过程中容易引起金粉的凝结，对细胞还有一定的毒害作用，从而影响转化效率。
轰击距离和轰击压力也是转化成功与否的重要因素。轰击距离和轰击压力影响微弹速度的大
小，轰击距离越近，轰击压力越大，微弹对受体组织的穿透力越强，对转化受体产生的损伤也越大。
相反，微弹对受体的穿透力越弱，有时甚至没有穿透受体。轰击次数越多对受体的损伤也会越大，
研究者通常采用的方式是轰击次数为 2 次，对于不同的植物材料和不同的外植体，轰击参数也会不
同（马生健 等，2004；郭丽琼 等，2005）。万丙良和张献龙（2001）以质粒 pBI121 作外源 DNA，
对基因枪介导转化水稻花药愈伤的有关参数进行了优化，射程 9 cm、枪膛氦气压力 1 100 psi、真空度
3 600 ~ 3 733 Pa、轰击次数两次可提高转化效率。本试验分别对主要参数做了比较研究，确定了基
因枪转化红叶石楠愈伤组织最佳的参数组合：胚性愈伤组织在诱导培养基 H1 里，用浓度为 0.3
mol · L-1 的甘露醇处理 15 ~ 16 h，基因枪轰击时添加 12.5 mol · L -1 氯化钙 50 μL + 0.1 mol · L -1亚精
胺 50 μL，每枪含金粉 300 μg + 质粒 DNA 3.0 μg，轰击压力 1 100 psi，轰击距离 9 cm，轰击次数 1
次，获得了 6 株转化植株，但外源基因能否稳定遗传以及在染色体上的整合位点如何，还有待于进
一步的研究。

References
Guo Li-qiong，Yang Fei-yun，Xiong Sheng，Lin Jun-fang. 2005. The transformation system for Volvariella volvacea by particle bombardment. Acta
Horticulturae Sinica，32 (5)：828–833. (in Chinese)
郭丽琼，杨飞芸，熊 盛，林俊芳. 2005. 草菇基因枪法遗传转化体系的建立. 园艺学报，32 (5)：828–833.
Liang Hui，Zhao Tie-han，Li Liang-cai，Ouyang Jun-wen，Tian Wen-zhong，Jia Xu. 1998. Studies on some factors affecting transformation of wheat
immature embryos by biolistic bombardment. Acta Genetica Sinica，25 (5)：443–448. (in Chinese)
梁 辉，赵铁汉，李良材，欧阳俊闻，田文忠，贾 旭. 1998. 影响基因枪法转化小麦幼胚的几个因素的研究. 遗传学报，25 (5)：
443–448.
Liang Hui-min，Xia Yang，Sun Zhong-xu，Wang Tai-ming，Liu De-xi，Wang Guo-liang，Huang Jian，Chen Shou-yi. 2005. Establishment of genetic
transformation system of Medicago sativa mediated by Agrobacterium tumefaciens. Joumal of Agricultural Biotechnology，13 (2)：152–156.
(in Chinese)
梁慧敏，夏 阳，孙仲序，王太明，刘德玺，王国良，黄 剑，陈受宜. 2005. 根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系的建立. 农业生物技
术学报，13 (2)：152–156.
Liu Cui-lan，Xia Yang，Yan Li-ping，Mao Xiu-hong，Li Li，Pang Cai-hong，Li Shuang-yun. 2010. The studies on sensitivity of teraploid black locust，
Sophora japonica and Davidson photinia to strains of Agrobacterium tumefaciens and antibiotics. Shandong Forestry Science and Technology，
190 (5)：20–23. (in Chinese)
刘翠兰，夏 阳，燕丽萍，毛秀红，李 丽，庞彩红，李双云. 2010. 四倍体刺槐、国槐和红叶石楠对根癌农杆菌菌株及不同抗生素敏
2286 园 艺 学 报 40 卷
感性研究. 山东林业科技，190 (5)：20–23.
Liu Cui-lan，Yan Li-ping，Mao Xiu-hong，Liang Hui-min，Xia Yang. 2011. Breeding of new alfalfa cultivar Shanmu No. 3（SLM07）by transformation
of the betaine aldehyde dehydrogenase gene. Chinese Journal of Grassland，33 (3)：6–11. (in Chinese)
刘翠兰，燕丽萍，毛秀红，梁慧敏，夏 阳. 2011. 转 BADH 基因山苜 3 号（SLM07）紫花苜蓿新品种选育. 中国草地学报，33 (3)：
6–11.
Ma Sheng-jian，Zeng Fu-hua，Xu Bi-yu，Lu Xiang-yang，Wu Zhi-hua. 2004. Protocol establ ishment of tall fescue transgene by biolistics. Acta
Horticulturae Sinica，31 (5)：691–693. (in Chinese)
马生健，曾富华，徐碧玉，卢向阳，吴志华. 2004. 基因枪介导的高羊茅基因转化体系的建立. 园艺学报，31 (5)：691–693.
Rafael Ramirez-Malagonl，Anatoli Borodanenkol，Jose Luis Barrera-Guerral，Neftali Ochoa-Alejo. 1997. Micropropagation for fraser photinia
（Photinia fraseri）. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，48：219–222 .
Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T. 1989. Molecular cloning：A laboratory manual，2nd ed . New York：Cold Spring Horbor Laborartory Press.
Vain P，McMullen M D，Finer J J. 1993. Osmotic teatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of maize.
Plant cell Rep，12 (2)：84–88 .
Wan Bing-liang，Zhang Xian-long. 2001. Production of transgenic rice plants resistant to bacterial blight. Journal of Huazhong Agricultural
University，20 (1)：1–6. (in Chinese)
万丙良，张献龙. 2001. 基因枪介导转化水稻花药愈伤获得抗白叶枯病转基因植株. 华中农业大学学报，20 (1)：1–6.
Wang Guan-lin，Fang Hong-jun. 1998. Principle and technology of plant gene engineering. Beijing：Science Press：598–599. (in Chinese)
王关林，方宏筠. 1998. 植物基因工程原理与技术. 北京：科学出版社：598–599.
Wang Hong-he，Huang Xia，Qiu Guo-hua，Huang Xue-lin，Tan Zhao-ping，Huang Wei-ru. 2000. Optimization of the biological and physical
parameters of bombardment-mediated transformation of micro-cross section explants of banana. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis
Sunyatsent，39 (2)：87–91. (in Chinese)
王鸿鹤，黄 霞，邱国华，黄学林，谭兆平，黄伟如. 2000. 基因枪法转化香蕉薄片外植体的参数优化. 中山大学学报：自然科学版，
39 (2)：87–91.
Woodson W R. 1991 . Biotechnology of floricultural crops. HortScience，26 (8)：1029–1033 .
Xia Yang，Liang Hui-min，Chen Shou-yi，Sun Zhong-xu，Wang Tai-ming，Li Xiao-yu，Fu Ling-ling，Huang Jian，Yan Li-ping，Liu De-xi. 2004.
Betaine aldehyde dehydrogenase（BADH）gene transformation of tetraploid clone of black locust mediated by Agrobacterium. Scientia
Agricultura Sinica，37 (8)：1208–1211. (in Chinese)
夏 阳，梁慧敏，陈受宜，孙仲序，王太明，李小玉，付玲玲，黄 剑，燕丽萍，刘德玺. 2004. 四倍体刺槐转甜菜碱醛脱氢酶基因的
研究. 中国农业科学，37 (8)：1208–1211.
Yan Li-ping，Liu Cui-lan，Liang Hui-min，Mao Xiu-hong，Wang Fei，Pang Cai-Hong，Shu Jing，Xia Yang. 2012. Physiological responses to salt
stress of T2 alfalfa progenies carrying a transgene for betaine aldehyde dehydrogenase. Plant Cell，Tissue and Organ Culture，108：191–199.
Yan Li-ping，Xia Yang，Liang Hui-min，Wang You-ping，Liu Cui-lan，Wang Zhen-meng，Li Li. 2009. Study on the field screening for transgenic
alfalfa by smearing kanamycin on the leaves . Chinese Agricultural Science Bulletin，25 (14)：22–26. (in Chinese)
燕丽萍，夏 阳，梁慧敏，王友平，刘翠兰，王振猛，李 丽. 2009. 卡那霉素叶片涂抹法田间筛选转基因苜蓿的研究. 中国农学通报，
25 (14)：22–26.
Yan Li-ping，Xia Yang，Mao Xiu-hong，Liu Cui-lan，Liang Hui-min. 2012. Breeding and salt resistance evaluation of BADH transgenic alfalfa
cultivar Shanmu 2 . Chinese Bulletin of Botany，46 (3)：293–301. (in Chinese)
燕丽萍，夏 阳，毛秀红，刘翠兰，梁慧敏. 2011. 转 BADH 基因紫花苜蓿山苜 2 号品种的抗盐性鉴定及系统. 植物学报，46 (3)：
293–301.
Zhang Hu，Wang Run-xian，Qiu Guo-jin，Wang Kai-dong，Liu Guo-hua. 2003. Tissue culture and rapid propagation of Photinia fraseri. Plant
Physiology Communications，39 (1)：34. (in Chinese)
张 虎，王润贤，邱国金，王开冻，刘国华. 2003. 紫叶石楠的组织培养与快速繁殖. 植物生理学通讯，39 (1)：34.
Zhou Jun-hui，Zhou Hou-gao，Liu Hua-quan. 2003. Endophytic bacterial contamination in plant tissue culture. Guihaia，23 (1) ：41 – 47. (in Chinese)
周俊辉，周厚高，刘花全. 2003. 植物组织培养中的内生细菌污染问题. 广西植物，23 (1)：41–47.