全 文 ：园 艺 学 报 2014，41（10）：2115–2124 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2014–07–07；修回日期：2014–09–12
基金项目：国家科技支撑计划项目（2013BAD14B03，2011BAD48B01-1）；河北省巨人计划创新团队项目
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：lmj1234567@aliyun.com）
冬枣极早期幼胚培养成苗技术研究
梁春莉 1,3，赵 锦 2，刘孟军 1,*
（1 河北农业大学中国枣研究中心，河北保定 071001；2 河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001；3 辽宁农业
职业技术学院，辽宁营口 115009）
摘 要：以胚龄 15 ~ 20 d 的球形期后期‘冬枣’幼胚为试材，对培养基种类、种皮保留与否、接种
方式、生长调节剂种类、水解乳蛋白（LH）和活性炭（AC）用量、蔗糖浓度等影响极早期幼胚培养的诸
因素进行了系统研究。结果表明，采用 MS + 3.0 mg · L-1 IAA + 0.5 mg · L-1 6- BA + 1 g · L-1 AC + 0.8 g · L-1
LH + 30 g · L-1 蔗糖的培养基，去除种皮后将带有胚乳的幼胚合点端接入培养基，在 21 ℃下进行培养，胚
萌发率和正常胚比率最高可分别达到 93%和 84%。萌发后的幼胚在 MS + IBA 0.4 mg · L-1 的培养基中继续
培养，生根率可达 40%。其中，去除种皮带胚乳培养和幼胚合点端朝下接种对极早期幼胚的培养至关重要。
关键词：枣；幼胚；培养；萌发；成苗
中图分类号：S 665.1 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2014）10-2115-10

A High-efficiency Regeneration System for Immature Embryo of Ziziphus
jujuba‘Dongzao’at Very Early Stage
LIANG Chun-li1,3，ZHAO Jin2，and LIU Meng-jun1,*
（1Research Center of Chinese Jujube，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；2College of Life
Science，Agricultural University of Hebei，Baoding，Hebei 071001，China；3Agricultural Vocational and Technical College
of Liaoning，Yingkou，Liaoning 115009，China）
Abstract：Late globular stage embryos（15–20-day-old）of Chinese jujube（Ziziphus jujuba
‘Dongzao’） were selected as materials. The factors influencing the rescue of the extremely young
embryo，including culture medium，inoculation way，removing or keeping seed coat，growth regulator
combination，as well as the concentrations of lactoalbumin hydrolysate（LH），activated carbon（AC）
and sucrose，were studied. The culture condition was optimized as follows：Using the medium of MS +
IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + sucrose 30 g · L-1，removing seed
coat，putting the chalazal end of embryo into culture medium（radicle end up），and keeping the culture
temperature around 21 ℃. Under the optimized condition，the rates of embryo germination and normal
embryo could reach 93% and 84%，respectively. The germinated embryos were then cultured in the
medium of MS + IBA 0.4 mg · L-1，and the rooting rate reached 40%. Removing seed coat and inoculating
the chalazal end of embryo are the keys for the culture of extremely young embryo of Chinese jujube.
Key words：Ziziphus jujuba；immature embryo；culture；germination；seedling formation


2116 园 艺 学 报 41 卷
枣（Ziziphus jujuba Mill.）的胚败育现象普遍并且非常严重，加之存在闭花授粉现象，在杂交育
种时需要在开花前的黄蕾期进行人工去雄和授粉。黄蕾期花蕾直径只有 3 mm 左右，人工去雄操作
困难且很容易伤害花器，影响授粉受精和胚的发育，导致杂交果的胚败育和早期脱落现象十分严重。
据作者多年的枣树人工杂交试验观察，大多数枣品种的杂种胚在授粉后 30 d 左右败育，许多重要的
亲本品种甚至在授粉后 3 周内即出现严重的幼胚败育（祁业凤和刘孟军，2004a，2004b；王玖瑞，
2004；马庆华 等，2008；闫超 等，2009，2012；梁春莉 等，2012），加之枣坐果率很低，到果实
成熟期能获得饱满杂交种子的几率通常只有万分之一左右。因此，开展极早期幼胚的挽救培养对于
枣的杂交育种意义重大。
有关枣的胚培养研究已有不少报道，但授粉后 40 d 以前幼胚的培养成功率均极低。金竹萍等
（2006）对‘六月鲜’枣花后 30 d 的幼胚进行培养，胚萌发率最高可达 66%，但未提及成苗情况。
祁业凤和刘孟军（2004a）对‘冬枣’坐果后 30 d 的幼胚进行培养，成苗率低于 10%；杜学梅等（2005）
对‘六月鲜’枣花后 40 d 幼胚进行培养，成苗率仅 1.26%。张存智等（2008）、崔秀梅等（2012）
分别对‘陇东马牙枣’、‘JM3’和‘金芒果枣’进行胚培养，发现胚龄 60 d 左右的胚萌发率和成苗
效果较好。从已有报道看，枣的胚龄越小，其离体培养成功率越低。枣胚离体培养时，其褐化的程
度随胚龄降低而升高（王玖瑞 等，2004）。早期幼胚中酚类物质含量高，褐化速度远大于幼胚分化
发育速度，使得后面的培养很难进行。由于多数枣优良品种的胚败育发生在授粉后 30 d 以内，早期
幼胚的培养成为枣树杂交育种的关键技术。本试验中以‘冬枣’授粉后 15 ~ 20 d 的极早期幼胚为试
材，对影响幼胚萌发和成苗因素进行了较系统的研究，尤其对幼胚褐化及其防控进行了深入研究并
取得突破，建立起了适合‘冬枣’极早期幼胚挽救培养的高效技术体系。
1 材料与方法
1.1 材料与处理
5 年生‘冬枣’材料取自河北农业大学标本园，选用生长结果正常的健康植株，采集花后 15 ~ 20 d
的幼果。
将采集的幼果放入烧杯，加入洗衣粉，流水冲洗 1 ~ 2 h，在超净工作台上用 75%乙醇清洗 2 min，
无菌水冲洗 1 ~ 2 次，用 0.1% HgCl2 消毒 8 min，无菌水冲洗 3 ~ 5 次，然后剥离果肉取出种子，继
而剥掉种皮。将带有胚乳的幼胚（以下简称幼胚）合点端接种在分别附加 IAA、IBA、NAA、6-BA
等植物生长调节剂的 MS 培养基上。培养条件为 18 ~ 29 ℃、光照 13 h · d-1、光照强度 2 000 lx。接
种 7 d 后统计胚膨大率，15 d 后统计胚萌发率，30 d 后统计正常胚率，然后将已长出两片子叶的幼
胚在无菌条件下取出，将其胚根转接至 MS + IBA 0.4 mg · L-1 + 蔗糖 30 g · L-1 的分化培养基继续培
养，7 d 后胚根开始伸长，30 d 后统计成苗率，并观察幼胚生长情况。
1.2 确定幼胚发育阶段
在盛花期选取同一天开放的枣花挂牌标记作为定花，由定花所结的果作为定果，根据定花和定
果确定胚龄。在坐果（裂蕾后 2 d）后 15 ~ 20 d 采集幼果 30 个，用游标卡尺测量幼果、幼嫩种子和
剥去种皮后带胚乳幼胚的横、纵径；同时将所采集的幼果用改良 FAA 固定液固定，常规石蜡切片法
制片，切片厚度 8 ~ 10 μm，番红—固绿染色，显微镜观察、拍照，确定幼胚的发育时期。
1.3 幼胚萌发培养条件的优化
适宜生长调节剂配比的初步筛选：在预备试验阶段，将幼嫩种子去除种皮，合点端朝下接种到
10 期 梁春莉等：冬枣极早期幼胚培养成苗技术研究 2117

MS 培养基中，采用 L16（43）正交设计，设 3 因素（6-BA，IBA，GA3）4 水平（6-BA 浓度 0、0.5、
1.0 和 2.0 mg · L-1；IBA 浓度 0、1.0、2.0 和 3.0 mg · L-1；GA3 浓度 0、0.3、0.5 和 0.7 mg · L-1）。
基本培养基试验：将 15 ~ 20 d 幼胚接种在 MS、1/2MS、B5 的基本培养基上，附加 6-BA
0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1、蔗糖 50 g · L-1，培养温度为 20 ~ 25 ℃，研究基本培养基种类对冬枣
幼胚萌发的影响。
培养温度试验：将幼胚接种在 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1 的培养
条件下，将接种后的培养瓶分别置于平均温度为 18、21、25 和 29 ℃的条件下，研究不同培养温度
对极早期幼胚萌发的影响。
接种方式试验：将幼胚按照平放、合点端插入和珠孔端插入培养基 3 种接种方式，在 MS + 6-BA
0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1 培养基中进行培养，培养温度为 21 ℃，研究其对幼胚
萌发的影响。
1.4 幼胚生长培养条件的优化
水解乳蛋白（lactoalbumin hydrolysate，LH）添加物试验：将幼胚合点端朝下接入培养基 MS + 6-BA
0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1，在培养基中分别添加浓度为 0、0.3、0.5、0.8、1.0 g · L-1
水解乳蛋白，研究其对幼胚生长的影响。
活性炭（activated carbon，AC）试验：为了防止幼胚在培养过程中褐化，将去除种皮后的幼胚
合点端接种在附加 IBA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1 的 MS 培养基
上，加入不同量的活性炭，研究添加 AC 控制褐化的效果。
生长素类生长调节剂试验：将去除种皮的冬枣幼胚合点端接种在 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 培养基
中，分别添加 NAA、IAA、IBA，浓度均为 3.0 mg · L-1，研究生长素种类对幼胚生长的影响。
蔗糖浓度试验：将去除种皮的冬枣幼胚合点端接种在含蔗糖浓度分别为 0、30、50、70、90 g · L-1
的 MS 基本培养基上，附加 IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8 g · L-1，研究
蔗糖浓度对幼胚生长的影响。
种皮处理试验：设置了种皮保留与去除两种处理。将坐果后 20 d 的幼果进行表面消毒后，在工
作台上用解剖刀将枣果剖开，取出带有种皮的幼嫩种子，沿种子纵轴方向切开种皮，判断胚珠合点
端的位置后，左手用镊子固定合点端，以免合点端受损（否则褐化严重），右手用解剖刀从破损处
种皮向下刮滑，种皮即可去除而保留下胚乳。将去除种皮的带胚乳幼胚接种在附加 IAA 3.0 mg · L-1 +
6-BA 0.5 mg · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + AC 1 g · L-1 + 蔗糖 30 g · L-1的 MS 基本培养基上，研究保留种皮
对冬枣幼胚生长的影响。
1.5 测定指标与标准
参照杜学梅等（2005）的标准，在幼胚培养中，接种幼胚体积膨大视为胚成活，胚变绿、子叶
形成视为幼胚萌发，以幼胚萌发率高低作为衡量幼胚启动培养效果的评价标准；在萌发胚中，子叶
浅黄色且展开为正常胚，窄小抱合视为畸形，以正常胚萌发的比率作为衡量幼胚生长优劣的标准；
接种萌发后的子叶胚分化出茎叶视为成苗，以成苗率高低作为胚培养效果的最终标准。
统计方法为：胚膨大率（%）= 膨大幼胚数/接种幼胚数 × 100；胚萌发率（%）= 萌发胚数/
膨大幼胚数 × 100；正常胚比率（%）= 正常胚数/萌发胚数 × 100；成苗率（%）= 成苗数/接种带
子叶胚数 × 100。
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2 结果与分析
2.1 幼胚发育阶段的确定
‘冬枣’坐果 15 ~ 20 d 的果实平均横径为 6.88 mm，纵径 10.48 mm；种子的平均横径为 4.72 mm，
纵径 6.80 mm；带胚乳幼胚纵径为 4.86 mm。根据以上统计结果，以王群瑛（1983）、白淑霞（1992）
在枣胚胎学研究中关于枣胚的发育时期与果实/种仁大小的关系作为依据，初步推断此时冬枣幼胚的
发育时期介于球形胚和心形胚之间，结合石蜡切片观察（图 1，A）进一步确定为球形胚后期。
2.2 幼胚萌发条件的优化
2.2.1 生长调节剂配比
通过对 6-BA、IBA 和 GA3 不同配比条件下胚萌发率的比较，筛选出冬枣幼胚萌发的适宜生长
调节剂配比为 6-BA 0.5 mg · L-1+ IBA 3.0 mg · L-1，胚萌发率达到 47.1%（表 1）。

表 1 生长调节剂配比对幼胚萌发的影响
Table 1 Effects of concentration combinations of plant regulators on the germination of young embryo
试验编号
Test code
6-BA/（mg · L-1） IBA/（mg · L-1） GA3/（mg · L-1） 胚萌发率/% Germination rate of embryo
1 0 0 0 2.9 j
2 0 1.0 0.3 17.6 g
3 0 1.0 0.5 17.6 g
4 0 3.0 0.7 31.4 bc
5 0.5 0 0.3 8.5 i
6 0.5 1.0 0.5 14.3 h
7 0.5 2.0 0.7 28.5 bcd
8 0.5 3.0 0 47.1 a
9 1.0 0 0.5 5.7 ij
10 1.0 1.0 0.7 20.0 f
11 1.0 2.0 0 25.7 d
12 1.0 3.0 0.3 34.2 b
13 2.0 0 0.7 11.4 h
14 2.0 1.0 0 17.1 g
15 2.0 2.0 0.3 22.2 ef
16 2.0 3.0 0.5 22.5 e

2.2.2 基本培养基
由表 2 可以看出，冬枣幼胚膨大率在 MS 和 1/2MS 基本培养基上均达到 90.0%，显著高于 B5
培养基的；在 MS 培养基上的胚萌发率则显著高于其他两种培养基的。可见，‘冬枣’极早期幼胚在
MS 培养基上培养效果最好。
表 2 不同基本培养基对幼胚萌发的影响
Table 2 Effects of different mediums on the germination of young embryo
基本培养基
Basic medium
接种胚数
Number of embryo inoculated
胚膨大率/%
Expansion rate of embryo
胚萌发率/%
Germination rate of embryo
MS 30 90.0 a 47.1 a
1/2MS 30 90.0 a 44.4 b
B5 30 83.3 b 44.0 b
注：附加 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1。同一列中的不同字母代表显著差异（P < 0.05）。
Note：Adding 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + sucrose 50 g · L-1. Different letters in the same column represent significant difference at
0.05 level.
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2.2.3 培养温度
培养温度对冬枣幼胚萌发的影响很大（表 3）。在 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗
糖 50 g · L-1 培养基上 21 ℃时培养效果最好，胚膨大率、胚萌发率、正常胚比率均最高，分别为 93.3%、
71.4%和 60.0%；29 ℃时均最低。同时发现，培养温度较高时胚乳褐化现象严重。因此认为，‘冬
枣’幼胚培养的温度以 21 ℃左右为宜。

表 3 培养温度对幼胚萌发生长的影响
Table 3 Effects of temperature on the germination and growth of young embryo
培养温度/ ℃
Culture temperature
接种胚数
Embryo inoculated
胚膨大率/%
Expansion rate of embryo
胚萌发率/%
Germination rate of embryo
正常胚比率/%
Rate of normal embryo
18 15 86.7 b 69.2 a 55.5 b
21 15 93.3 a 71.4 a 60.0 a
25 15 60.0 c 44.4 b 25.0 c
29 15 46.7 d 42.9 b 0 d
注：基本培养基为 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + sucrose 50 g · L-1.

2.2.4 接种方式
由见表 4 可以看出，不同的接种方式对胚的萌发率具有重要影响。将胚珠合点端（图 1，B）插
入基本培养基为 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1 中，正常萌发胚比率为
63.2%，萌发后幼胚胚根均朝上，子叶朝下（图 1，C）。而将珠孔端插入培养基内，胚珠合点端褐
化严重，胚的萌发率降为 0。可见，幼胚培养时必须将胚珠合点端插入培养基。

表 4 不同接种方式对幼胚萌发生长的影响
Table 4 Effects of display type on the germination and growth of young embryo
接种方式
Display type of embryo
接种胚数
Embryo inoculated
胚膨大率/%
Expansion rate of
embryo
胚萌发率/%
Germination rate of
embryo
正常胚比率/%
Rate of normal
embryo
平放 Horizontal 20 35.0 b 40.3 b 11.1 b
珠孔端插入培养基 Micropyle end down 20 3.3 c 0 c 0 c
合点端插入培养基 Chalazal end down 20 86.7 a 82.6 a 63.2 a
注：基本培养基为 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 + sucrose 50 g · L-1.

2.3 幼胚生长条件的优化
幼胚萌发后，子叶浅黄色且展开的为正常胚，其胚根生长及茎尖分化较好；若子叶窄小抱合，
接种在生根培养基后，两子叶不及时展开、胚根细长、不能形成正常侧根的为非正常胚。提高正常
胚比率是胚培养诱导成苗的关键环节。为提高胚培养效果，在 MS 基本培养基、培养温度为 21 ℃的
条件下，对影响幼胚生长的如下因素进行了优化试验。
2.3.1 水解乳蛋白添加物
在植物幼胚萌发过程中，为促进胚胎正常发育，常添加一些对生长有益的天然复合物（周莉 等，
2003；Azad et al.，2012）。由表 5 可以看出，添加适量的水解乳蛋白（LH）可显著提高幼胚的萌
发率和正常胚的比率。当水解乳蛋白的浓度较低（0.3 ~ 0.5 g · L-1）时，胚膨大率虽然较高，但幼胚
子叶较小，正常胚比率低；当浓度提高至 0.8 g · L-1 时，胚萌发率达 80%，且正常胚占 70%，此时
幼胚子叶较饱满开展；当浓度继续提高至 1.0 g · L-1 时，效果又有所下降。因此认为，枣幼胚培养基
中附加 LH 0.8 g · L-1 最为适宜。
2120 园 艺 学 报 41 卷
表 5 水解乳蛋白（LH）对幼胚生长的影响
Table 5 Effects of lactoalbumin hydrolysate on the
growth of young embryo
LH/
（g · L-1）
接种胚数
Embryo
inoculated
胚膨大率/
%
Expansion
rate of
embryo
胚萌发率/
%
Germination
rate of
embryo
正常胚比
率/%
Rate of
normal
embryo
0 26 96.2 a 61.5 c 61.5 b
0.3 14 85.7 b 85.7 a 14.3 d
0.5 16 62.5 d 62.5 c 25.0 c
0.8 20 80.0 c 80.0 b 70.0 a
1.0 18 94.4 a 77.8 b 22.2 c
注：基本培养基为 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 + IBA 3.0 mg · L-1 +
蔗糖 50 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + 6-BA 0.5 mg · L-1 +
IBA 3.0 mg · L-1 + sucrose 50 g · L-1.
表 6 抗褐化剂活性炭（AC）对冬枣幼胚生长的影响
Table 6 Effects of activated carbon on the growth
of young embryo
AC/
（g · L-1）
接种胚数
Embryo
inoculated
胚膨大率/
%
Expansion
rate of
embryo
胚萌发率/
%
Germination
rate of
embryo
正常胚比
率/%
Rate of
normal
embryo
0 30 91.7 c 79.3 d 47.4 d
1 30 93.4 b 100 a 71.4 a
2 25 87.5 d 87.5 b 52.6 b
3 30 93.3 bc 85.7 bc 50.0 c
4 30 96.7 a 82.8 c 45.5 d
注：基本培养基为 MS + IBA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 +
LH 0.8 g · L-1 + 蔗糖 50 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + IBA 3.0 mg · L-1 +
6-BA 0.5 mg · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + sucrose 50 g · L-1.
2.3.2 活性炭
由表 6 可知，附加 1 ~ 3 g · L-1 的活性炭，胚萌发率、正常胚比率均有所提高。在未加活性炭的
培养基上，胚及周围培养基变褐，胚萌发率为只有 79.3%。加入 1 g · L-1 活性炭时，胚萌发率、正常
胚比率最高，分别为 100%、71.4%。随活性炭浓度增加，胚萌发率、正常胚比率随之降低。可见，
低浓度（1 g · L-1）的活性炭对胚萌发、正常胚形成有促进作用，高浓度的活性炭则相反。

2.3.3 生长素类生长调节剂
由表 7 可知，培养基中附加 6-BA 0.5 mg · L-1 和 IAA 3.0 mg · L-1 时，胚萌发率、正常胚比率分
别高达 89.4%和 75.0%；而附加 6-BA 和 IBA 的效果最差，虽然胚膨大率可达 90%，但胚萌发率、
正常胚的比率分别仅为 47.1%、25.0%。可见，IAA 对冬枣幼胚培养的效果较好。

表 7 外源生长调节剂的不同浓度配比对幼胚生长的影响
Table 7 Effects of different combinations of plant growth regulator on the growth of young embryo
外源生长调节剂/（mg · L-1）
Plant growth regulator
6-BA NAA IAA IBA
接种胚数
Embryo inoculated
胚膨大率/%
Expansion rate of
embryo
胚萌发率/%
Germination rate of
embryo
正常胚比率/%
Rate of normal
embryo
0.5 3.0 20 95.0 a 89.4 a 75.0 a
0.5 3.0 40 92.5 a 72.2 b 42.9 b
0.5 3.0 20 90.0 b 47.1 c 25.0 c
注：基本培养基为 MS + 6-BA 0.5 mg · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + 6-BA 0.5 mg · L-1.

2.3.4 蔗糖浓度
由表 8 可知，在不附加蔗糖的 MS + IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8
g · L-1 培养基上，胚不能萌发。当蔗糖浓度为 30 g · L-1 时，胚的萌发率、正常胚比率均最高，分别
达到 93.1%、82.8%。随蔗糖浓度进一步增高，胚萌发率、正常胚比率和成苗率反而逐渐降低。在蔗
糖浓度达到 90 g · L-1 时，正常胚比率降至 0。可见，蔗糖浓度过高会抑制胚萌发，本试验中蔗糖浓
度为 30 g · L-1 时最适合冬枣幼胚的萌发和生长。
2.3.5 种皮对幼胚萌发生长的影响
由表 9 可以看出，未去除种皮的冬枣幼胚接入培养基后，种皮很快褐化，在幼胚还没有萌发之
10 期 梁春莉等：冬枣极早期幼胚培养成苗技术研究 2121

前，胚乳已变黑死亡，胚萌发率为 0。而去除种皮的幼胚接入培养基后，胚乳褐化速度明显降低，
待胚萌发后可见培养基变褐，但程度较低，胚萌发率高达 86.2%，正常胚比率高达 84.0%。可见，
去除种皮非常有利于冬枣幼胚的萌发和生长。

表 8 蔗糖浓度对幼胚生长的影响
Table 8 Effects of different sucrose concentrations on the growth of young embryo
蔗糖浓度/（g · L-1）
Sucrose concentration
接种胚数
Embryo inoculated
胚膨大率/%
Expansion rate of embryo
胚萌发率/%
Germination rate of embryo
正常胚比率/%
Rate of normal embryo
0 30 0 d 0 d 0 d
30 30 96.7 a 93.1 a 82.8 a
50 30 90.0 b 88.9 a 66.7 b
70 30 81.7 c 79.2 b 42.1 c
90 30 81.7 c 62.5 c 0 d
注：基本培养基为 MS + IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8 g · L-1.

表 9 种皮对幼胚生长的影响
Table 9 Effects of seed coat on the growth of young embryo
处理
Treatment
胚膨大率/%
Expansion rate of
embryo
出愈率/%
Callus formation
Percentage
褐化率/%
Browning
percentage
胚萌发率/%
Germination rate of
embryo
正常胚比率/%
Rate of normal
embryo
种皮保留 Seed with seed coat 40.0 b 0 100.0 a 0 b 0 b
去除种皮 Seed without seed coat 94.9 a 0 14.8 b 86.2 a 84.0 a
注：基本培养基为 MS + IAA 3.0 mg · L-1+ 6-BA 0.5 mg · L-1+ LH 0.8 g · L-1 + AC 1 g · L-1 + 蔗糖 30 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + AC 1 g · L-1 + sucrose 30 g · L-1.

2.4 幼胚生根成苗条件的优化
萌发后‘冬枣’幼胚，从培养瓶取出处于胚根朝上，子叶朝下状态，接入基本培养基 MS + 蔗
糖 30 g · L-1 附加不同激素的分化培养基时，将幼胚胚根端朝下插入培养基（图 1，D），继续培养。
图 1 冬枣 15 ~ 20 d 幼胚培养成苗过程
A. 幼胚接种前的解剖学特征（球形胚后期）；B. 带胚乳幼胚合点端接入培养基；C. 幼胚萌发后胚根向上；
D. 萌发后的幼胚胚根向下接入分化培养基；E. 长成的幼苗；F. 幼苗生根；G. 幼苗驯化移栽。
Fig. 1 The process of immature embryo culture of Ziziphus jujuba‘Dongzao’
A. The anatomical status of the immature embryo before inoculated（late globular stage）；B. Inoculation of immature embryo with endosperm
（chalazal end down）；C. The germinated immature embryo（the radicle end upward）；D. Inoculation of germinated embryo（radicle
end down）into seedling medium；E. The seedling formed from young embyo；F. Rooting condition；G. Transplanted seedling.
2122 园 艺 学 报 41 卷
表 10 不同生长调节剂配比对幼胚生根成苗的影响
Table 10 Effects of plant growth regulator on the rooting and
plantlet regeneration rate of germinated embryo
6-BA/
（mg · L-1）
IBA/
（mg · L-1）
生根率/%
Rooting rate
成苗率/%
Seedling rate
0.5 0.4 0 0
0.3 0.4 0 0
0.1 0.4 0 0
0 0.4 40.0 a 40.0 a
0 0.5 32.0 b 32.0 b
0 0.6 30.0 b 30.0 b
注：基本培养基为 MS + 蔗糖 30 g · L-1。
Note：The basic culture medium for MS + sucrose 30 g · L-1.
加入 6-BA 的处理中，萌发的幼胚出现大量
类似猫耳朵的幼嫩小叶，但茎尖不延长，其成
苗率和生根率均为 0；而只加 0.4 mg · L-1的 IBA
时，生根率与成苗率均可达 40.0%（表 10），
随 IBA浓度升高萌发胚的生根率与成苗率又都
有所降低。冬枣在附加适宜浓度的 IBA 时可先
生根再成苗（图 1，E ~ G）。冬枣组培苗生根
较难，其生根条件需要进一步探索和优化。
3 讨论
胚败育早而严重是制约枣树杂交育种的瓶颈因素。枣树胚败育通常发生在授粉后 30 d 左右，许
多重要亲本品种甚至在授粉后 3 周内即出现严重的幼胚败育，而胚龄小于 30 d 的幼胚培养成功率极
低。本研究对冬枣胚龄 15 ~ 20 d 的球形期后期幼胚，去除种皮后将带有胚乳的幼胚合点端接入 MS +
IAA 3.0 mg · L-1 + 6-BA 0.5 mg · L-1 + AC 1 g · L-1 + LH 0.8 g · L-1 + 蔗糖 30 g · L-1 的培养基，在 21 ℃
下进行培养，胚萌发率和正常胚比率最高可分别达到 93%和 84%。萌发后的幼胚在 MS + IBA 0.4
mg · L-1 的培养基中继续培养，生根率可达 40.0%。本研究首次建立了冬枣极早期幼胚培养成苗技术
体系，对提高枣树杂交育种效率具有重要意义，同时对其他果树的极早期幼胚培养有一定参考价值。
已有研究表明，胚龄是限制果树幼胚挽救成功的关键因素（Celso et al.，1995；Krishna & Singh，
2007；Shen et al.，2011）。本课题组对冬枣花后 17 d 的幼胚进行石蜡切片观察，发现正处于球形胚
时期，与张学英等（2004）观察无核枣授粉后 20 d 的胚胎发育时期基本相同。对于植物胚胎发育阶
段与幼胚培养的关系已有一些报道。Geerts 等（2011）认为，菜豆幼胚挽救最佳时间为球形胚或心
形胚时期。Tilton 和 Russell（1984）认为，大豆未成熟胚的胚培养最早时间为球形胚时期。满红等
（2005）的研究表明，结球甘蓝杂交后代幼胚在球形胚前期胚萌发率为 0，球形胚后期胚萌发率可
则达到 13.3%。本课题组曾对冬枣花后 5 ~ 10 d 的幼胚进行培养，未获得胚的萌发，分析原因主要
是此时胚乳处于发育早期，自身营养物质很少，不能满足幼胚生长所需营养；而胚龄达到 15 ~ 20 d
时，胚胎发育至球形胚后期，胚乳处于旺盛生长期，外观呈现乳白色，半透明半固态，且富有弹性，
能为幼胚发育提供大量的营养。
有关胚接种方式对幼胚培养的影响研究较少。郑先波等（2005）在西瓜成熟胚培养时，认为胚
平放可提高胚培养效果。杜何为等（2003）和肖莉杰等（2003）在研究玉米胚性愈伤组织诱导时发
现，幼胚的盾片朝下接种可有效提高愈伤诱导效率。但李慧芬等（1999）认为，在玉米自交系愈伤
组织诱导中幼胚盾片的放置方式对出愈率无明显影响。祁业凤和刘孟军（2004b）在冬枣坐果后 20 d
幼胚培养中采用胚平放在培养基上，其成苗率仅为 3.7%。白淑霞（1992）对枣胚乳发育的研究认为，
在球形胚后期，胚乳细胞开始形成细胞壁，但在合点端的胚乳细胞始终保持游离核状态，形成花瓶
状胚乳吸器，显示其从周围吸收营养运输到本体的功能。本研究中将胚珠合点端插入培养基，其胚
乳的吸收功能得以充分发挥，从而有利于保证幼胚萌发及生长。本试验首次采用胚珠合点端接种的
培养方式，因珠孔端朝上，使得萌发后幼胚全部胚根朝上子叶朝下（正常种子萌发时，胚根朝下，
子叶朝上），所以在诱导分化阶段，需要再将分化出的子叶倒转，使胚根朝下生长，此时胚根可以
吸收培养基中提供的营养。这种培养程序既降低了胚乳褐化程度，也为吸收营养提供了捷径，使枣
幼胚培养效果显著提高。
植物幼胚的培养需经历胚乳胚（胚乳看护培养）发育、胚培养、成苗、移栽驯化等步骤（Fernandez
10 期 梁春莉等：冬枣极早期幼胚培养成苗技术研究 2123

et al.，1991；Fratini & Ruiz，2011）。本试验在枣幼胚萌发生长阶段首次采用二步培养法，即首先
进行胚乳看护（杜学梅 等，2005）幼胚培养（幼胚外包被有胚乳），利用胚乳及外界培养基的营养
保持枣幼胚的胚性生长，接种后 10 d 左右幼胚颜色转绿，表明幼胚萌发；30 d 后，幼胚分化出子叶
（子叶胚），开始具备自养能力，此时胚乳已经干枯，胚乳看护阶段完成。接下来，将胚乳内已长
出两片小子叶的胚在无菌条件下取出，转移至分化培养基。这种培养方法适于胚龄小、肉眼看不见
胚、尚无法分离幼胚时应用。对于枣幼胚培养，祁业凤和刘孟军（2004a）采用的二步培养与本研究
不同，其指枣幼胚先培养成苗然后转至幼苗生长培养基；张存智等（2008）在对陇东马芽枣花后 60
d 幼胚进行培养时也采用与祁业凤和刘孟军（2004a）一样的二步培养。在极早期幼胚培养体系中，
第一步促进幼胚萌发生长极其重要，是保证胚培养成功的关键。本研究中对影响培养的 7 个因素（生
长调节剂配比、蔗糖浓度、抗褐化剂、水解添加物、培养温度、种皮的有无、接种方式）逐一进行
试验，发现这些因素对幼胚培养效果均有影响，其中以种皮的有无和接种方式影响最大。

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