全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (5) : 749 - 754
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 10 - 13; 修回日期 : 2009 - 03 - 17
基金项目 : 国家科技支撑计划项目 (2006BAD01A1803, 2007BAD45B01, 2007BAD45B02) ; 云南省科技计划项目 (2003NG05)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: wjh0505@gmail1com)
百合杂交后代 ISSR鉴定
吴学尉 1 , 崔光芬 1 , 吴丽芳 1 , 张艺萍 1 , 明　军 2 , 王　杰 3 , 王继华 13
(1 云南省农业科学院花卉研究所 , 昆明 650205; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 3 中国科学院武汉
植物园 , 武汉 430074)
摘 　要 : 使用筛选出的 5对 ISSR引物 , 对由东方百合优良品种 ‘Sorbonne’、‘Tiber’和 ‘Cobra’为
亲本的 4对杂交组合获得的 40个杂交后代指纹进行了分析 , 利用 NTSY Spc软件 UPGMA聚类构建的遗传
关系能够较好地反映其亲缘关系。其中 , 编号为 P23和 P21的引物是本试验中鉴定的分辨率较高的 ISSR引
物。
关键词 : 百合 ; 杂交后代 ; ISSR; 分子鉴定
中图分类号 : S 682135; Q 94511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0520749206
Iden tif ica tion of ISSR in L ily Hybr ids
WU Xue2wei1 , CU I Guang2fen1 , WU L i2fang1 , ZHANG Yi2p ing1 , M ING Jun2 , WANG jie3 , and WANG J i2
hua13
(1 Flow er Research of Institu te, Yunnan A cadem y of A gricultural Sciences, Kunm ing 650205, Ch ina; 2 Institu te of V egetables and
Flow ers, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 3W uhan B otan ica l Garden, Chinese A cadem y of
Sciences, W uhan 430074, China)
Abstract: Forty p rogenies obtained from 4 combinations of crosses among 3 oriental lily cultivars‘Sor2
bonne’, ‘Tiber’and‘Cobra’were analyzed with the screened 5 pairs of ISSR p rimers. The genetic rela2
tionship s constructed with UPGMA method of NTSY Spc software quite shows their linage relationship. And the
p rimers numbered with P23 and P21 possess relatively high resolution in the p resent research.
Key words: lily; hybrid; ISSR; identification
东方百合 (L ilium oriental hybird) 种球培育期长 (吴学尉 等 , 2004) , 从种子培育到开花成球需
要 3～4年的时间 , 一个品种的选育周期要长达 10年以上。因此在进行东方百合育种时 , 有必要开展
杂交后代真实性的早期鉴定 , 加速选育效率 , 降低育种成本。
近年来 , 分子标记技术被广泛应用于杂种的鉴定。据报道 , ISSR分子标记已用于石蒜 (张雷凡
等 , 2007)、半夏 (张君毅 等 , 2007)、牡丹 (索志立 等 , 2005)、茶树 (侯渝嘉 等 , 2006)、子莲
(魏英辉 等 , 2007) 等杂交后代的鉴定 , 罗凤霞等 (2005) 用 RAPD标记开展过百合杂交后代的鉴
定。
本研究旨在通过对东方百合杂交后代的 ISSR标记分析 , 为百合杂交后代真实性鉴定提供 DNA分
子证据 , 并为快速、便捷地鉴别百合杂交后代真实性探索新方法。
1　材料与方法
111　供试材料
以东方百合杂种系优良品种 ‘Sorbonne’、‘Tiber’和 ‘Cobra’为亲本材料 , 2006年在云南省农
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园 　　艺 　　学 　　报 36卷
业科学院花卉研究所雨树村试验基地设计 4对杂交组合 , 分别为 Sorbonne ×Tiber, Tiber ×Sorbonne,
Sorbonne ×Cobra和 Tiber ×Cobra。
亲本材料于 2006年 3月下旬定植 , 母本于 6—7月花开放前 2 d去雄并套袋隔离 , 同时收集父本
花粉进行杂交 , 杂交后套袋 , 记录。同时开展 ‘Sorbonne’和 ‘Tiber’的自交比对试验。
杂交和自交都能收到种子。成熟种子采收处理后放置于 2～3 ℃冷库打破休眠 , 于 2007年 6月播
种育苗。
幼苗经过 8个月的生长后长至 10 cm高时取 012 g叶片提取 DNA。每个杂交组合取 10个后代个
体的叶片用于 DNA提取 , 每种亲本取 015 g叶片提取 DNA。
112　D NA提取与引物筛选
采用改良的 CTAB法 (邹喻苹 等 , 2001) 从百合鳞片中提取总 DNA。根据已报道的其它球根类
ISSR引物序列 , 由上海生工生物工程有限责任公司合成 30个引物 , 在相同的模板和扩增条件下从中
筛选出 5个能获得清晰条带、反应稳定的 ISSR引物用于正式 PCR扩增。引物编号、序列和退火温度
如下。P8: 5′2 (AC) 8 GT23′, 60 ℃; P12: 5′2 ( TC) 7 TG23′, 48 ℃; P19: 5′2 (AC) 8 CG23′, 58 ℃;
P21: (CTC) 4 RC, 51 ℃; P23: 5′2 ( GGC) 6 23′, 58 ℃。
113　 ISSR2PCR扩增
ISSR2PCR扩增在 B iomentra T1型 PCR仪上进行。20μL PCR反应体系中含 25 ng DNA 模板 ,
10 mmol·L - 1 10 ×buffer, 20 mmol·L - 1 MgCl2 , 1 mmol·L - 1 dNTP, 012μmol·L - 1引物和 1 U Tag
DNA聚合酶。
引物和 Tag酶购自宝生物工程 (大连 ) 有限公司 ( Generay B iotech)。
PCR程序为 : 94 ℃预变性 3 m in; 94 ℃变性 40 s, 在适合引物退火的温度下退火 15 s, 72 ℃延伸
115 m in, 37个循环 ; 最后 72 ℃延伸 10 m in。
PCR产物用 2%琼脂糖 ( Promega公司 ) 凝胶在 1 ×TBE缓冲液中在 3 V·cm - 1的电压下电泳 3 h,
以 EB染色 30 m in, 完成染色后的胶块用 A lphamager公司的凝胶成像系统摄影。
114　遗传相似性分析
电泳图谱的每条带 (DNA片段 ) 均为 1个分子标记 (Marker) , 代表 1个引物的结合位点。以长
度在 100～1 500 bp范围内的 PCR扩增片段用于统计分析 , 各分子标记的迁移率用 Quantityone软件
(Version462) 计算扩增片段的分子量 , 然后根据其条带的有无统计表格 , 有带记为 “ - ”; 根据统计
表格 , 将所有的二元数据 , 有带 (显性 ) 记作 1, 无带 (隐性 ) 记为 0, 生成各材料的 0, 1矩阵 , 根
据 0, 1矩阵建立 3个亲本品种和 40个杂交 F1 代的 DNA指纹图谱 ; 最后利用 NTSYSpc2110e版软件
的 UPGMA (Unweighted Pair Group Method with A rithmetic averages) 构建所有亲本与所有杂交 F1 代个体
的遗传关系树状图 , 分析杂交后代与亲本的遗传关系。
2　结果与分析
211　杂交后代的 ISSR鉴定
5个 ISSR引物的 PCR扩增结果和指纹图谱统计结果表明 , Sorbonne ×Tiber的杂交组合中共检测
到 16个位点 , 母本、父本和子代的共有位点有 8个 (表 1未显示 )。子代与父本的共有位点有 3个 ,
位点编号 P82500在 2个子代中出现 , P122540在 8个子代中出现 , P232600在 5个子代中出现 ; 子代
与母本共有的位点有 3 个 , 位点编号 P1921400在 7个子代中出现 , P2121000在 3个子代中出现 ,
P212390在 10个子代中都出现 (表 1)。
Sorbonne ×Cobra的杂交组合中共检测到 11个位点 , 母本、父本和子代的共有位点有 2个 (表 1
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未显示 )。子代与父本的共有位点有 5个 , 位点编号 P82450在 4个子代中出现 , P82580在 2个子代中
出现 , P82980在 4个子代中出现 , P122620在 5个子代中出现 , P1221000在 4个子代中出现 ; 子代与
母本的共有位点有 3个 , 位点编号 P82750在 4个子代中出现 , P192800在 3个子代中出现 , P212700
在 1个子代中出现 (表 1)。
Tiber ×Sorbonne的杂交组合中共检测到 16个位点 , 母本、父本和子代的共有位点有 7个 (表 1
未显示 )。子代与父本的共有位点有 4个 , 位点编号 P82650在 8个子代中出现 , P212800在 3个子代
中出现 , P212450在 6个子代中出现 , P232620在 6个子代中出现 ; 子代与母本的共有位点有 2 个 ,
位点编号 P232800在 6个子代中出现 , P232900在 9个子代中出现 (表 1)。
Tiber ×Cobra的杂交组合中共检测到 6个位点 , 母本、父本和子代的共有位点有 2个 (表 1未显
示 )。子代与父本的共有位点有 1个 , 位点编号 P232430在 7个子代中出现 ; 子代与母本的共有位点
有 3个 , 位点编号 P82410在 3个子代中出现 , P212420在 7个子代中出现 , P2121300在 6个子代中出
现 (表 1)。
表 1　利用 5个 ISSR引物获得的杂交后代及其亲本的 D NA指纹图谱的比较
Table 1　Com par ison of D NA f ingerpr in ts of the hybr ids and the ir
paren ts ba sed on ISSR2PCR by 5 pr im ers
标记编号
Marker code
杂交后代共有带个体数
Total of the same fragments
p resent in parents
Sorbonne Tiber Cobra Sorbonne ×Tiber
Sorbonne ×
Cobra
Tiber ×
Sorbonne
Tiber ×
Cobra
P82500 2 - -
P122540 8 - -
P232600 5 - -
P1921400 7 - -
P2121000 3 - -
P232390 10 - -
P82450 4 - -
P82580 2 - -
P82980 4 - -
P122620 5 - -
P1221000 4 - -
P82750 4 - -
P192800 3 - -
P212700 1 - -
P82650 8 - -
P212800 3 - -
P212450 6 - -
P232620 6 - -
P232800 6 - -
P232900 9 - -
P232430 7 - -
P82410 3 - -
P212420 7 - -
P2121300 6 - -
在 ISSR标记得到的图谱 (图 1) 中 , 百合子代与亲本的共有带频繁出现 , 杂交过程是严格控制
的 , 子代与父本出现共有带 , 说明这些后代是特定亲本杂交产生的杂种 , 杂交后代的遗传信息分别来
自不同的亲本 , 不同子代可能遗传亲本不同的优良性状 , 部分子代在自身基因重组过程中产生了变
异。从而为百合杂交后代提供了一种有效的新的 DNA 水平的鉴定方法。
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图 1　Sorbonne ×Cobra杂交后代及其亲本的 D NA ISSR标记电泳结果 (引物为 P21)
M: 100 bp ladder DNA分子量标准 ; CK: 空白对照 ; s1～s6: 母本 ;
c1～c5: 父本 ; sc1～sc7: F1。
F ig. 1　D NA am plif ica tion pa ttern s of the cross Sorbonne ×Cobra com b ina tion s by P21 pr im er
M: 100 bp ladder DNA marker; CK: Comparison; s1 - s6: Female;
c1 - c5: Male; sc1 - sc7: F1.
212　杂交后代遗传特性分析
由图 2可看出 , 同一杂交组合后代间的遗传距离较近 , 都分别优先聚在一起。Tiber和 Cobra与
其杂交后代间的遗传关系也较近 , 而 Sorbonne与其杂交后代的遗传距离较远 , 最后才与其它聚在一
起。
图 2　百合杂交亲本及 F1 代间的 ISSR遗传关系树状图 ( UPGM A)
F ig. 2　D endrogram for lily paren ts and the ir F1 hybr ids ba sed on ISSR markers ( UPGM A)
S: Sorbonne; T: Tiber; C: Cobra; ST: Sorbonne ×Tiber; TS: Tiber ×Sorbonne; SC: Sorbonne ×Cobra; TC: Tiber ×Cobra.
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　5期 吴学尉等 : 百合杂交后代 ISSR鉴定 　
　　Sorbonne ×Tiber和 Tiber ×Sorbonne父母本相同的正反交 , 其 F1 代与其父母本聚在一起了 ; Sor2
bonne ×Cobra和 Tiber ×Cobra相同父本不同母本的 F1 代也与其父母本聚在一起 , 进一步说明 ISSR是
一种有效的杂交后代鉴定方法。
213　杂交后代个体特异性分析
用 ISSR鉴定出的杂交后代 , 同时还产生了一些父母本都不具有的新的扩增条带 (表 2) , 表现出
杂交后代一定的分离性状。
对于 Sorbonne ×Tiber杂交组合 , 编号为 6、7、8的杂交后代 , 用 19号引物扩增时 , 在 1 100 bp
处产生了一条新的扩增带 , 标记编号为 SP1921100ST; 编号为 5的杂交后代 , 用 21号引物扩增时 , 在
700 bp处产生了一条新的扩增带 , 标记编号为 SP212700ST。
对于 Tiber ×Sorbonne杂交组合 , 编号为 3的杂交后代 , 用 8号引物扩增时 , 在 500 bp处产生了
一条新的扩增带 , 标记编号为 SP82500TS; 编号为 6、8、9的杂交后代 , 用 21号引物扩增时 , 在 700
bp处产生了一条新的扩增带 , 标记编号为 SP212700TS; 编号为 4、7、9、10的杂交后代 , 用 23号引
物扩增时 , 在 650 bp处产生了一条新的扩增带 , 标记编号为 SP232650TS。
对于 Sorbonne ×Cobra杂交组合 , 编号为 2的杂交后代 , 用 8号引物扩增时 , 在 600 bp处产生了
一条新的扩增带 , 标记编号为 SP82600SC。
而对于 Sorbonne ×Cobra杂交组合 , 用筛选出的 5个引物扩增时 , 都没有发现新的扩增带。
表 2　利用 5个 ISSR引物获得的杂交后代个体间新扩增带 D NA指纹图谱的比较
Table 2　Com par ison of D NA fingerpr in ts of the bands am ong
the hybr ids ba sed on ISSR2PCR by 5 pr im ers
组合
Crossing
标记编号
Marker code
杂交后代编号 Hybrids code
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Sorbonne ×Tiber SP1921100ST - - -
SP212700ST -
Tiber ×Sorbonne SP82500TS -
SP212700TS - - -
SP232650TS - - - -
Sorbonne ×Cobra SP82600SC -
Tiber ×Cobra
3　讨论
在百合的杂交后代筛选中 , 杂种真实性的早期鉴定非常重要 , 只有在早期知道杂交后代是否为真
正杂种 , 预测其性状偏向于父本多一些还是偏向母本多一些 , 才能确定是否需要继续培育种球 , 降低
育种成本。本试验中应用的 ISSR分子标记是一种快速、简便的鉴定百合杂种的方法 , 但是该方法有
需要注意的地方 , 第一点就是进行 PCR 扩增时 , 引物的设计是一个关键环节 , 直接影响扩增产物的
多态性 , 这与索志立等 (2005) 用 ISSR标记研究牡丹得到的结果相同 , 第二点是 DNA模板浓度对
ISSR标记的 PCR扩增影响较大 , 首先要对模板浓度设计一个梯度试验 , 以选出最适的模板浓度。本
试验结果还显示出编号为 P23和 P21的引物在每个组合的子代中都具有良好的扩增效果 , 因此 , 可作
为一个百合杂种鉴定的通用引物。
本文结果显示 , 绝大部分引物扩增出的多态性条带中子代与双亲条带互补 , 即在 F1 中出现的条
带或在父本中出现 , 或在母本中出现。但在少数引物的扩增条带中 , 其 ISSR图谱出现了与理论不符
合的情况 , 在父、母本中出现的条带在 F1 代中没有出现 , 出现缺失。这种现象在其它作物上也有发
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现 , 有人认为是由于配子形成过程中染色体的交换及 DNA分子碱基修饰引起的突变造成位点丢失
(陈琼 等 , 2007)。另外还发现了父、母本中没有出现的条带在 F1 代中出现 , 出现增加带 , 这可能
是因为选取的材料都是高度杂合的品种 , 由于配子形成过程中染色体的不等价交换产生的新片段 , 导
致 F1 代表现分离。聚类分析时 , TS4聚到了 SC与 TC之间 , 进一步说明 Sorbonne和 Tiber的亲缘关系
较近。
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