全 文 ：园 艺 学 报 2010，37（3）：435–440
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期：2009–05–24；修回日期：2010–02–08
基金项目：农业部‘948’引进项目(2008-G3)
﹡ 通信作者 Author for correspondence （E-mail：ymfang@cau.edu.cn)
铁炮百合热激转录因子基因克隆与表达分析
辛海波 1，陈 莉 1，李晓燕 1，何秀丽 2，义鸣放 1,*
（1 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100193；2乳山市农业局，山东乳山 264500）
摘 要：以铁炮百合（Lilium longiforum）‘白天堂’为试材，通过 RACE 方法得到了一个热激转录因
子（Heat shock transcription factor，HSF）A 家族基因全长序列。该基因包含一个编码 350 个氨基酸的开
放阅读框。对推定的氨基酸序列进行聚类分析，与已知的 HSFA2 同源性较高，据此推断，克隆到的基因
是一个新的 HSFA2 成员。经过与功能明确的番茄和拟南芥 HSFA2 序列比对分析，该基因有热激转录因子
所具备的典型结构域和调控元件。RT-PCR 分析该基因时空表达模式的结果表明：37 ℃条件下处理 1 h，
根、鳞茎、叶中能检测到其表达，叶片 37 ℃处理 0.5 ~ 12 h 均可检测到表达。
关键词：百合；热激转录因子；热激；耐热性
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2010）03-0435-06

Cloning and Expression Analysis of hsf from Lilium longiforum
XIN Hai-bo1，CHEN Li1，LI Xiao-yan1，HE Xiu-li2，and YI Ming-fang1,*
（1Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture，China Agricultural University，Beijing 100193，
China；2 Agriculture Bureau of Rushan，Rushan，Shandong 264500，China）
Abstract: A all-length heat shock transcription factor(HSF) gene with 350aa ORF, belonging to
HSFA, was cloned from Lilium longiforum ‘white heaven’ by RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends).
Cluster analysis showed that this gene was highly homologous to known HSFA2 from other organisms and
one novel member of HSFA2. Furthermore, alignment with HSFA2 from tomato and Arabidopsis indicated
there was highly conserved DNA binding domain in this gene, harboring other characterized domains and
regulatory elements. RT-PCR showed that expression of this gene could be detected in roots and bulbs
treated by 37 ℃ for 1 hour and be detected in leaves during 0.5–12 hours at 37 ℃.

Key words：Lilium longiforum；heat shock transcription factor(HSF)；heat shock；thermotolerance

百合作为主要的切花和盆花材料，在国内外花卉市场上占有重要地位。但百合性喜冷凉湿润气
候，我国北方地区夏季炎热，越夏的百合经常会出现植株矮小，盲花少花，茎杆软，病虫害严重等
现象，影响到切花质量，并造成种球退化。如何提高百合耐热性是一个亟待解决的问题。
热激转录因子（Heat shock transcription factor；HSF）作为信号转导的末端组分，调节着热和其
它逆境下基因的表达（Wu,1995；Nover et al.,1996；Nakai,1999）。植物 HSF 的研究始于番茄（Scharf
et al.,1990），Mishra 等（2002）采用过表达和 RNAi 抑制试验证明，番茄中 HSFA1 可以调节热激

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蛋白和其它热激转录因子的表达，是 HSF 在热激反应过程中的主控因子。番茄 HSFA2 是一个严格
受热激诱导的 HSF，它在热胁迫和恢复循环中具有较高的激活潜力，且能连续积累，因此，HSFA2
被认为是耐热性细胞中的一个统治性的 HSF（Scharf et al.,1998）。拟南芥中 HSFA2 可调节 hsp101、
hsp70、shsp 和 apx 的表达，同时严格地受热激诱导表达，其 knockout 突变体热敏感性提高，过表
达 hsfa2 的植株则表现出了较强的耐热和渗透胁迫的能力（Charng et al.,2007；Li et al., 2005；Ogawa
et al., 2007）。
迄今为止，百合耐热性研究侧重于热胁迫下抗氧化酶系统的响应机制探讨（Yin et al., 2008），
而百合热激蛋白和热激转录因子的研究未见报道。对模式植物拟南芥和番茄的研究表明，热激转录
因子在提高植株耐热性方面具有重要的调节作用，而且高等植物细胞水平的保护机制和基因功能具
有严格的保守性。因此作者研究克隆百合 hsf 基因，检测其表达情况，为进一步研究如何利用基因
修饰手段来提高百合的耐热性奠定基础。
6B1 材料与方法
试验所用材料为铁炮百合品种‘白天堂’的
组培苗。
RNA 的分离按照 invitrogen 公司的 Trizol 说
明书进行。DEPC 水溶解 RNA，用分光光度计测
定 OD260 和 OD280 数值，根据 OD260/OD280 值判断
RNA 的质量，用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完
整性。
cDNA 的 合 成 按 照 invetrogen 公 司 的
superscriptⅡ试剂盒说明书进行。
cDNA 合成和 PCR 反应所用引物见表 1。
对于基因 3′ 序列克隆，逆转录引物用 AP1，
反应条件按 superscriptⅡ说明书。
第一轮 PCR 反应引物用 PF1 和接头引物
AP2，94 ℃变性 3 min；94 ℃变性 30 s,52 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 1 min 30 s，35 个循环；72 ℃延伸 7
min。取第一轮产物 1 μL 进行第二轮反应，引物为 PF2 和 AP2，PCR 条件同上。对于基因 5′ 序列
信息的获取，用基因特异引物 PR1 进行逆转录，合成 cDNA，按 TaKaRa 公司未端转移酶说明书，
对 cDNA 模板进行加尾反应，再以其为模板进行 PCR 反应。第一轮反应引物用 AP1 和 PR1，延伸
时间为 1 min，第二轮反应取一轮产物 1 μL 为模板，引物用 AP2 和 PR2，延伸时间为 30 s，其余 PCR
条件同上。
用 DNAman 进行核苷酸和蛋白质多序列比对和聚类分析。
取不同温度处理的材料 0.1 g，采用 invitrogen 公司 Trizol 分离 RNA，按 promega 公司 M-MLV
试剂盒说明书合成 cDNA。用 actin 基因为内参，调整不同处理的模板用量，使模板用量尽可能一致。
用基因特异引物 PF3 和 PR3，在固定模板量的情况下进行 PCR 反应，检测基因的相对表达量。actin
退火温度 50 ℃，26 个循环，hsfa2 退火温度 48 ℃，36 个循环。每组处理重复 3 次，用凝胶成像软
件量化图片中 PCR 产物，文中显示具有代表性的一组电泳图片。
引物
Primers
序列
Sequence
PF1 AAG ACG TAY GAN ATG GTG GAN GA
PF2 ACT TCA AGC AYA RCA AYT TCT C
PF3 AAGCACAACAACTTCTC
PR1 TCAGATCAGGGCTGGCTC
PR2 CTCCTCTTAATGTCCTTC
PR3 TTAAGGCTGGGAATCTAG
AP1 CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC(T)17
AP2 CCGGATCCTCTAGAGCGGCCGC
actin For ATGGAACTGGAATGGTTAAG
actin Rev ATAGCAACATACATAGCAGG
表 1 逆转录和 PCR 引物
Table 1 Primers applied in the Rervese Triscription and PCR
3 期 辛海波等：铁炮百合热激转录因子基因克隆与表达分析 437

图 1 PCR 产物检测
A：3′ RACE 产物；B：5′ RACE 产物；C：CDS 产物；M：DL2000 marker。
Fig. 1 Agrose gel electrophoresis of PCR products
A，B and C show 3′，5′ and CDs product respectively. M: DL2000 marker.
2 结果与分析
10B2.1 百合hsf 基因克隆
根据已知的拟南芥和番茄 HSF 序列，设计兼并引物，采用 RACE 方法分别得到了基因 3′ 端
（1 011 bp）和 5′ 端（367 bp），经过拼接得到 1 262 bp 全长基因序列；该基因 3′ utr 和 5′ utr 长度分
别为 102 bp 和 107 bp，CDS 长 1 053 bp，包含一个编码 350 个氨基酸的开放阅读框（图 1）。将其核
酸序列提交 NCBI 在线比对（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），将同源性高的项目序列下载，
使用 DNAman 将百合 hsf 核酸序列与这些序列进行比对。
结果表明百合 hsf 与拟南芥 hsfa2（NM_128173）同源性最高，达到 56.6%，与杨树 hsf
（XM_002309456）次之，同源性为 56.3%，与番茄和水稻的 hsf（X67601,AM409186）同源性分别达
到 53.5%和 51.7%。
2.2 百合HSF聚类分析
用 DNAman 将核酸序列翻译成蛋白质序列，提交 NCBI（protein blast）进行在线比对，将同源
性较高的其它物种的 HSF 序列下载，用 DNAman 进行比对和聚类分析。与几类物种已知的 HSF 序
列聚类分析（图 2）表明，推定的百合 HSF 与杨树 HSF 同源性最高，达到 53.1%，与葡萄（50.6%）
和蓖麻（49%）次之。
从基因家族的划分上来看，百合 HSF 与研究相对较多的番茄和拟南芥 HSFA2 的相似性分别达
到 47.5%和 47%，而与拟南芥和苜蓿的 HSFA1 的同源性分别为 37.2%和 37%，结合核酸序列比对结
果，本试验中克隆到的百合 hsf 初步确定为 HSFA2 成员，将其命名为 LlHSFA2。
2.3 蛋白质序列比对
推定的百合 HSFA2 分子量为 39.548 kD，等电点为 5。与拟南芥和番茄 HSFA2 序列比对（图 3）
表明，LlHSFA2 具有高度保守的 DNA 结合域，相对不保守的寡聚域，核定位信号和激活域也具有
较高同源性。



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图 3 百合 HSFA2 与番茄 LpHSFA2(P41152)和拟南芥 AtHSFA2(NP180184)的多序列比对
DBD：DNA 结合域；HR-A/B：寡聚域；NLS：核定位信号；AHA1/AHA2：激活域；NES：核输出信号。
Fig. 3 Multiple aligment of amino acid sequence of the deduced LlHSFA2 with
well-known those of tomato (P41152) and Arabidopsis(NP180184)
DBD：DNA binding domain；HR-A/B：Oligomerization domain；NLS：Nuclear localization sequence；
AHA1/AHA2：Activation domains；NES：Nuclear export sequence.
图 2 LlHSFA2 与已知的热激转录因子序列聚类
Fig. 2 Phylogenetic tree for HSF from Lilium and those from different species
2.4 百合hsfa2 时空表达
图 4 表明，百合 hsfa2 常温下根、鳞茎、叶中均未检测到表达，而在 37 ℃处理 1 h 后，在这 3
种器官中均检测到其有明显表达。用凝胶成像软件量取 DNA 条带的密度值，以叶片 1 h 的相对表达
量为 1，对根、鳞茎和叶片表达量进行相对定量。在 37 ℃处理 1 h 后，根和鳞茎与叶片的相对表达
量无显著性差异（t-test 值分别为 0.0741 和 0.419）。据此说明，试验中克隆的百合 hsf 基因表达严格
地受热激调控,与番茄和拟南芥 hsfa2 的表达特性相同,进一步确定克隆到的是 hsfa2 基因。

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图 4 hsfa2 不同器官表达情况
Fig. 4 hsfa2 expression in various tissues
图 5 叶片 hsfa2 不同热激时间表达情况
Fig. 5 hsfa2 expression in the leaves at different time point at 37 ℃
以上结果表明：热激情况下 hsfa2 在根、鳞茎、叶中表达无显著性差异，用叶片分离的 mRNA 反
转成 cDNA 为模板，对 hsfa2 不同热激时间的表达情况进行了分析。结果显示，在常温下检测不到
hsfa2 的表达，37 ℃处理 0.5 ~ 12 h 均可以检测到其有明显的表达。以同样的方法，对各 DNA 条带
进行定量，仍以叶片 1 h 表达量为 1 对 0 ~ 12 h 基因表达量进行相对定量，结果表明，从 0.5 ~ 6 h，
基因表达量呈上升趋势，6 ~ 12 h 表达量变化呈平缓状态。
3 讨论
植物拥有数量众多的 HSF，分为 A、B、C 三类（Nover, 1996）。其中，拟南芥有 21 个，番茄
至少有 18 个，大豆中至少有 34 个（Miller & Mittler, 2006）。Guo 等（2008）采用生物信息学的方法，
对水稻基因组数据库进行查找，剔除重复的序列，共发现了 33 个水稻 HSF。百合基因较大，推测
有 30 个以上。庞大的基因家族功能较多，涉及到了生长、发育和逆境反应等诸多方面，必定会给基
因功能的研究带来极大的挑战。选择在模式植物中功能明确的同源基因，采用反向遗传学的方法，
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先选定基因再分析功能，是一条相对便捷合理的途径。
聚类和 NCBI 对比结果显示，与 LlHSFA2 同源性较高的前 3 项分别是杨树、葡萄和蓖麻，这些
基因的功能和蛋白质分析还未见报道。根据它们与番茄和拟南芥中的 HSFA2 的高度同源性，可以初
步确定，本研究在百合中克隆到的基因与图 2 中的杨树，葡萄和蓖麻基因同属于 HSFA2 类成员。
与功能明确的番茄和拟南芥 HSFA2 序列比对表明，该基因推定的蛋白序列 DBD（DNA binding
domain）有着高度的保守性，虽然其它的结构域相对不保守，但从氨基酸的性质上来看都是一些非
极性氨基酸（图 3），这是 HSF 的基本特征（Nover et al., 2001；Kotak et al., 2007）。据此推断，蛋白
的功能也可能非常相似。
研究表明，hsfa2 的表达严格地受热激调节，这与拟南芥中的 hsfa2 表达模式（Kotak et al., 2007）
相似,说明百合 hsfa2 很可能参与了百合热信号转导途径。本文试验中检测到百合叶片 hsfa2 表达情
量在 37 ℃处理 0 ~ 6 h 呈上升趋势，6 ~ 12 h 表达量相对平稳。HSFA2 是一个特异受热诱导且在热
激反应中占统治地位的 HSF，热激后百合 hsfa2 在很长一段时间内表达上升，且在 12 h 其表达仍非
常明显，这与其蛋白功能是密切相关的。但这一结果与 Li 等（2005）得到的在 3 h 后表达明显下降，
12 h 检测不到表达的 Northern blot 结果不符。究其原因，认为主要有两点：其一，植物材料不同，
基因虽同源却不完全相同，因此表达模式上可能存在差异；其次，用来检测基因表达的方法不同，
可能导致结果的差异。

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