全 文 :园 艺 学 报 2011,38(6):1197–1204 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期:2010–12–21;修回日期:2011–05–11
基金项目:国家自然科学基金项目(30972023);中国博士后科学基金项目(20090451280);辽宁省重点实验室项目(LS2010148)
* E-mail:hmbh@sina.com
兰州百合鳞茎可溶性酸性转化酶活性检测体系
的建立
孙红梅*,何 玲,王微微,王春夏,李天来
(沈阳农业大学园艺学院,设施园艺省部共建教育部重点实验室,辽宁省设施园艺重点实验室,沈阳 110866)
摘 要:为深入研究百合鳞茎蔗糖代谢生理机制,以兰州百合(Lilium davidii var. unicolor)鳞茎外
层鳞片为试材,研究了不同种类和 pH 值的缓冲液、反应时间和反应温度对可溶性酸性转化酶(Soluble acid
invertase,SAI,EC 3.2.1.26)活性的影响,建立了 SAI 活性的最佳检测体系。结果表明,最适提取缓冲
液为 pH 8.0 的 Hepes-NaOH;最佳反应缓冲液为 pH 4.8 的 HAc-K3PO4,最适反应温度为 40 ℃,最适反
应时间为 30 min。
关键词:百合;鳞茎;可溶性酸性转化酶;提取条件;反应条件
中图分类号:S 682.2 文献标识码:A 文章编号:0513-353X(2011)06-1197-08
Establishment of Detection System for Soluble Acid Invertase Activity in
Lilium davidii var. unicolor Bulb
SUN Hong-mei*,HE Ling,WANG Wei-wei,WANG Chun-xia,and LI Tian-lai
(College of Horticulture,Shenyang Agricultural University,Horticulture Key Laboratory of Ministry of Education,Key
Laboratory of Protected Horticulture of Liaoning Province,Shenyang 110866,China)
Abstract:In order to make a thorough study in sucrose-metabolizing mechanism of lily bulblet,the
exterior scales of Lilium davidii var. unicolor bulb were used in present study to explore the effects of
buffers with different sorts and pH values,reaction durations and reaction temperatures on SAI activity.
Then SAI activity detection system was established. The results indicated that the optimal extraction and
reaction buffers were Hepes-NaOH(pH 8.0)and HAc-K3PO4(pH 4.8),respectively. And SAI has an
optimum reaction duration and temperature of 30 min and 40 ℃.
Key words:lily;bulb;soluble acid invertase;extraction condition;reaction condition
可溶性酸性转化酶(Soluble acid invertase,SAI,EC 3.2.1.26)是蔗糖代谢的关键酶,存在于植
物细胞的液泡中,催化蔗糖水解成还原糖,在高等植物蔗糖积累与分配过程中起着重要调控作用(刘
慧英和朱祝军,2002;史国安 等,2009)。在百合鳞茎中,蔗糖不仅是可以直接利用的可溶性糖的
主要形式,而且是鳞茎内部碳水化合物长距离运输的主要形态(孙红梅 等,2005;郑慧俊 等,2006),
系统研究蔗糖代谢对于明确百合鳞茎的发育机理、生产优质种球具有重要意义。因此,建立百合鳞
茎中 SAI 检测体系,不仅是研究鳞茎中蔗糖代谢的基础,也是系统研究鳞茎发育机理的关键。
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早在 1913 年,Michaelis 和 Mentens 就对植物转化酶进行了研究(潘秋红,2003)。目前 SAI 已
经在多种植物如苹果(Pan et al.,2005)、番茄(Konno et al.,1993;Ohyama et al.,1994)、竹(Liu
et al.,2006)、柿(Iwatsubo et al.,1992)、烟草(武忠亮,2007)、甘薯(唐云明 等,1996)、大豆
(张振清和夏叔芳,1984)、甘蔗(Altaf et al.,2008)、薄荷(郭小路 等,2008)、一串红(杜泓璇,
2009)、接骨草(褚波 等,2005)、柑(唐云明,1995)和梨(Hashizume et al.,2003)中被分离纯
化,关于该酶的生化特性、基因结构与功能(Elliott et al.,1993;Xu et al.,1995;Tymowska & Kreis,
1998a)以及表达与调控(Roitsch et al.,1995;Ehness & Roitsch,1997;Tymowska & Kreis,1998b)
等方面的研究均取得了重要进展。然而,目前关于百合鳞茎 SAI 的研究尚少,Shin 等(2002)参照
其他植物中 SAI 的活性测定方法对低温处理过程中东方百合和亚洲百合试管鳞茎的 SAI 活性进行了
测定;Legnani 等(2010)参照其研究小组 1998 年对麝香百合花器官中 SAI 的研究方法,对缺氧及
低氧条件下贮藏的亚洲百合种球 SAI 活性进行了测定。但针对百合鳞茎的高效稳定的 SAI 活性检测
体系尚未建立,并且百合鳞茎富含多糖和酚类物质,上述物质对 SAI 的提取和活性检测有较大干扰。
影响 SAI 活性检测的因素主要有缓冲液种类及 pH 值、反应温度和反应时间。由于不同作物 SAI 检
测方法中上述因素的水平各不相同,本试验中在前人所用的 SAI 测定条件基础上(Shin et al.,2002;
潘秋红,2003;成善汉 等,2004;Ordόñez et al.,2005;邱文伟,2005;Xiong et al.,2008;苑智
华 等,2008;周生茂,2009;Legnani et al.,2010),以兰州百合鳞茎外层鳞片为试材,研究了 SAI
的提取和测定条件,建立了 SAI 活性检测体系,旨在为深入研究百合鳞茎蔗糖代谢生理机制奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2009 年 4—10 月在沈阳农业大学园艺科研基地进行。选取兰州百合(Lilium davidii var.
unicolor)质量为(23 ± 1)g,无病虫害和其它损伤的独头鳞茎种植,将花蕾在透色即将开放时摘除,
常规栽培管理。分别在栽种期(A)、出苗期(B)、展叶期(C)、现蕾期(D)、开花期(E)、花后
20 d(F)、花后 40 d(G)、植株半枯期(H)和植株枯萎期(I)取样。每次取鳞茎 5 个,由外至内
1 ~ 2 层的鳞片作为外部鳞片,混合取样,迅速液氮冷冻,于–80 ℃保存备用。
1.2 不同取样时期供试材料的筛选
母鳞茎作为百合萌发阶段的代谢源,其外部鳞片是代谢更为活跃的部位(孙红梅 等,2005)。
因此,分别取各时期的外部鳞片各 1 g,各加入 0.3 g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP),5 mL Tris-HCl 缓冲液
(pH 7.5),在冰浴条件下迅速研磨,4 层纱布过滤,4 ℃下 12 000 r · min-1 离心 20 min,取上清液
转入透析袋,用稀释 10 倍的提取缓冲液(不含 PVP)透析 20 h(0 ~ 4 ℃),即得粗酶液。
SAI 活性测定参照姜晶等(2007)的方法,以提前杀死酶活的酶液为对照。
1.3 提取缓冲液的选择
配制 pH 值为 7.0、7.2、7.5、7.8 和 8.0 的 Tris-HCl、Hepes-NaOH 缓冲液以及 pH 值为 4.5、4.8、
5.0、5.2 和 5.5 的 HAc-NaAc 缓冲液,进行 SAI 粗酶液提取。
1.4 测定条件的选择
根据 L16(44)正交表,对不同反应缓冲液、pH 值、反应时间和反应温度进行 4 因素 4 水平的
试验设计(表 1)。
6 期 孙红梅等:兰州百合鳞茎可溶性酸性转化酶活性检测体系的建立 1199
1.5 测定条件的优化
根据试验结果分别对反应 pH 值、反应温度进一步优化,将反应 pH 值设置为 4.0、4.2、4.5、4.8
和 5.2,5 个水平;反应温度设定为 37 ℃、40 ℃、45 ℃和 50 ℃ 4 个水平,进行完全试验(表 4)。
采用统计软件 SPSS16.0 进行数据分析。
2 结果与分析
2.1 试验材料的选择
由图 1 可知,栽种期的外层鳞片的 SAI 活性最高,故选此时期的外层鳞片为本研究的试材。
图 1 兰州百合鳞茎发育过程中外部鳞片 SAI 活性变化
A. 栽种期;B. 出苗期;C. 展叶期;D. 现蕾期;E. 开花期;F. 花后 20 d;G. 花后 40 d;H. 植株半枯期;I. 植株枯萎期。
Fig. 1 Changes of SAI activity in exterior scales of Lilium davidii var. unicolor bulb during bulb development
A. Planting stage;B. Plantlet stage;C. Leaf unfolding stage;D. Visible bud stage;E. Anthesis stage;
F. 20 d after anthesis;G. 40 d after anthesis;H. Half withered;I. Withered stage.
2.2 不同提取缓冲液对 SAI 活性影响
由图 2 可知,提取缓冲液 Hepes-NaOH pH 8.0 提取的 SAI 活性最高,与缓冲液 Tris-HCl pH 7.2、
Tris-HCl pH 8.0、NaAc-HAc pH 4.5、NaAc-HAc pH 5.5 提取的 SAI 活性之间无显著差异,但显著高
于其它缓冲液,故确定 pH 8.0 的 Hepes-NaOH 作为 SAI 的提取缓冲液。
图 2 提取缓冲液对 SAI 活性影响
大、小写字母分别表示 0.01(P < 0.01)和 0.05(P < 0.05)水平的差异显著性。下同。
Fig. 2 Effects of different extraction buffers on SAI activities
The capitals and lowercases mean significant difference at 0.01 and 0.05 level,respectively. The same below.
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2.3 不同反应条件对 SAI 活性的影响
方差分析结果表明,各因素对 SAI 活性影响主次顺序为:反应温度 > 反应时间 > 反应缓冲液 >
反应 pH 值,其中反应缓冲液、反应时间及温度对 SAI 活性的影响达到极显著水平,反应 pH 值对
SAI 活性影响达到显著水平。
各因素显著性测验结果表明(表 2),以 HAc-K3PO4、Mes-NaOH 及 CA-KH2PO4 为缓冲液所测
得的 SAI 活性无显著性差异,但极显著高于 HAc-NaAc 缓冲液,其中当缓冲液为 HAc-K3PO4 时,
SAI 有最高酶活性,故确定反应缓冲液为 HAc-K3PO4。在 pH 4.5、pH 4.8 下测得的酶活性无显著性
差异,其中 pH 4.5 时酶活性较高且均显著高于 pH 5.2、pH 5.5 的酶活性,因此本试验进一步设置了
较低的 pH 值,以期挑选出最佳的反应 pH 值。在 40 ℃下测得的酶活性极显著高于 25、30 和 35 ℃
下的酶活性,40 ℃是所设温度的上限,为挑选出更优的反应温度,进行了较高温度的选择试验。反
应 30 min 的 SAI 活性极显著高于其它反应时间的酶活性,故选择 30 min 作为最佳反应时间。
在多因素正交试验中,由于发生了主效和互作的混杂,故必须对各处理组合进行显著性测验,
结果表明(表 1),组合 11(HAc-K3PO4、pH 5.2、30 min、40 ℃)测得的 SAI 活性极显著高于其他
组合,此时反应 pH 值为 5.2,因此,需对 SAI 的反应 pH 值进一步优化。
表 1 不同反应条件对 SAI 活性的影响
Table 1 Effects of reaction conditions on SAI activity
处理编号
Treatment No.
反应缓冲液
Reaction buffer pH
反应时间/min
Reaction duration
反应温度/℃
Temperature
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity
1 HAc-NaAc 4.5 30 25 24.99 gF
2 HAc-NaAc 4.8 40 30 20.60 hG
3 HAc-NaAc 5.2 50 35 17.23 iG
4 HAc-NaAc 5.5 60 40 23.55 gFG
5 Mes-NaOH 4.5 40 40 41.03 cC
6 Mes-NaOH 4.8 30 35 45.99 bB
7 Mes-NaOH 5.2 60 30 14.36 jH
8 Mes-NaOH 5.5 50 25 14.99 jH
9 HAc-K3PO4 4.5 50 30 16.11 jH
10 HAc-K3PO4 4.8 60 25 14.36 jH
11 HAc-K3PO4 5.2 30 40 50.35 aA
12 HAc-K3PO4 5.5 40 35 37.77 dC
13 CA-KH2PO4 4.5 60 35 31.72 eDE
14 CA-KH2PO4 4.8 50 40 32.83 eD
15 CA-KH2PO4 5.2 40 25 18.74 hiG
16 CA-KH2PO4 5.5 30 30 28.72 fE
表 2 反应条件各因素显著性测验
Table 2 Significance test of reaction condition factors
因素
Factor
水平
Level
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity
因素
Factor
水平
Level
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity
HAc-K3PO4 29.65 aA 25 19.95 cC
Mes-NaOH 29.09 aA 30 18.27 cC
CA-KH2PO4 28.00 aA 35 33.18 bB
缓冲液
Buffer
HAc-NaAc 21.59 bB
温度/℃
Temperature
40 36.94 aA
pH 4.5 28.46 a 时间/min 30 37.51 aA
4.8 28.44 a Duration 40 29.53 bB
5.2 25.17 b 50 20.29 cC
5.5 26.26 b 60 21.00 cC
6 期 孙红梅等:兰州百合鳞茎可溶性酸性转化酶活性检测体系的建立 1201
2.4 反应条件的优化
由表 3 可知,在各反应温度下测得的 SAI 活性之间无显著性差异,但以 40 ℃下的酶活性最高,
故选择 40 ℃作为最适反应温度;当反应 pH 值为 4.0 和 4.2 时,在不同温度下测得的酶活性均为 0,
pH 4.5 和 pH 4.8 测得的 SAI 活性无显著性差异,但均极显著高于 pH 5.2 的酶活性,其中以 pH 4.8
的酶活性最高,故为最佳反应 pH 值。
对各处理所测得的 SAI 活性进行显著性分析(表 4),组合 1、组合 2、组合 4、组合 5、组合 7、
组合 10、组合 11 所测得的 SAI 活性之间无显著性差异,其中组合 5(40 ℃、pH 4.8)所测得 SAI
活性最高,与其他组合差异显著,这与显著性测验所得的结果一致。
表 3 反应温度和 pH 值对 SAI 活性影响的显著性测验
Table 3 Significance test of different temperature and pH value on SAI activity
温度/℃
Temperature
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity pH
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity
37 19.28 a 4.5 21.25 aA
40 21.53 a 4.8 21.53 aA
45 19.32 a 5.2 19.94 bB
50 19.68 a
表 4 反应温度和 pH 值对 SAI 活性的影响
Table 4 Effects of different temperature and pH value on SAI activity
处理编号
Treatment No.
温度/℃
Temperature pH
酶活性/(μmol · h-1 · g-1FW)
SAI activity
1 37 4.5 20.02 abAB
2 37 4.8 21.32 abAB
3 37 5.2 16.51 bB
4 40 4.5 21.67 abAB
5 40 4.8 24.06 aA
6 40 5.2 18.33 bAB
7 45 4.5 22.61 abAB
8 45 4.8 19.58 bAB
9 45 5.2 15.78 bB
10 50 4.5 20.71 abAB
11 50 4.8 21.19 abAB
12 50 5.2 17.15 bB
3 讨论
目前对于 SAI 的提取缓冲液,大多数研究者(Shin et al.,2002;潘秋红,2003;成善汉 等,
2004;邱文伟,2005;苑智华 等,2008;周生茂,2009)选用的是 Hepes-NaOH、Tris-HCl 缓冲液,
且 pH 值均在 7.0 ~ 8.0 之间,Ordόñez 等(2005)和 Xiong 等(2008)选用了 HAc-NaAc 缓冲液,其
pH 值在 SAI 最适反应范围(pH 3.8 ~ 5.5)内。本研究中对 3 种提取缓冲液 Hepes-NaOH(pH 7.0 ~ 8.0)、
Tris-HCl(pH 7.0 ~ 8.0)、HAc-NaAc(pH 4.5 ~ 5.5)进行试验比较,最终确定 pH 8.0 的 Hepes-NaOH
为百合鳞茎 SAI 的最适提取缓冲液,说明百合鳞茎的 SAI 活性在中性偏碱的环境里比较稳定。
本试验中所确定的 SAI 最适反应缓冲液为 HAc-K3PO4,最适反应时间为 30 min。研究发现随着
反应时间的延长,酶活性呈急剧下降的趋势,可能由于时间延长,反应底物消耗殆尽,生成的产物
不再增加,从而使单位时间内计算的生成产物量减少。
SAI 最适 pH 值范围在 3.8 ~ 5.5 之间,大多数植物的 SAI 最适 pH 值为 4.5 ~ 5.0(Liu et al.,2005;
1202 园 艺 学 报 38 卷
Altaf et al.,2008;郭小路 等,2008;杜泓璇,2009;高旭 等,2010)。本研究表明,百合鳞茎中
SAI 的最适反应 pH 值为 4.8,介于大多数植物的最适 pH 值范围内,但远低于甜菜块根的 pH 5.5(曾
宪彬 等,1993)。当反应 pH 值为 4.0 和 4.2 时,测得百合鳞茎 SAI 活性为 0。武忠亮(2007)对烟
草叶片中 SAI 进行研究,认为 pH 4.0 为其最适反应 pH 值,褚波等(2005)认为接骨草叶中 SAI 同
工酶Ⅲ在 pH 3.9 ~ 4.2 活性最大,说明不同作物的 SAI 对 pH 的敏感度不同,反应缓冲液 pH < 4.5
使百合鳞茎中 SAI 迅速失活。
百合鳞茎中 SAI 最适反应温度为 40 ℃,与高旭等(2010)对苹果、梨和桃果实研究的结果相
同,高于甜菜块根的 SAI 最适温度 35 ℃(曾宪彬 等,1993),但低于大多数植物的 SAI 最适温度,
如大豆叶片 60 ℃(张振清 等,1984)、接骨草叶片 48 ~ 52 ℃/50 ~ 55 ℃(褚波 等,2005)、烟草
叶片 45 ℃(武忠亮,2007)、甘蔗茎 55 ℃(Altaf et al.,2008)、薄荷叶 55 ℃(郭小路 等,2008)、
一串红叶 55 ~ 60 ℃(杜泓璇,2009)等。说明不同植物 SAI 对温度的敏感度存在一定的差异。本
研究中兰州百合鳞茎 SAI 的最适反应温度远高于 Shin 等(2002)、Legnani 等(2010)分别测定亚洲
百合、东方百合以及麝香百合鳞茎中 SAI 所用的 25 ℃和 30 ℃,其中 Shin 的测定方法参照了其他
植物,而 Legnani 则参照了麝香百合花器官 SAI 的测定方法。由于百合花器官和地下变态器官的糖
类物质含量以及成分差别甚远,且不同百合品系之间也存在较大差别,因此建立百合及不同品系百
合鳞茎 SAI 活性检测体系十分重要。
本试验中初步建立了百合鳞茎 SAI 检测体系:取鳞片 1 g,加入 0.3 g PVP,5 mL pH 8.0
Hepes-NaOH 缓冲液,在冰浴条件下迅速研磨,4 层纱布过滤,4 ℃下 12 000 r · min-1 离心 20 min,
取上清液,转入透析袋,用稀释 10 倍的提取缓冲液(不含 PVP)透析 20 h(0 ~ 4 ℃),即得粗酶
液。于 25 mL 试管中加入 0.6 mL 0.1 mol · L-1 HAc-K3PO4 缓冲液(pH 4.8)和 0.2 mL 0.1 mol · L-1 蔗
糖,再加入 0.2 mL 粗酶液,40 ℃条件下反应 30 min,用 3,5–二硝基水杨酸法测定生成的还原糖含
量,以提前杀死酶活的酶液为对照,酶的活性单位用 μmol · h-1 · g-1FW 表示。
SAI 作为蔗糖代谢中的关键酶,其活性受多种因素的影响,除以上条件外,金属离子、鳞茎本
身的发育状况、各种矿质元素的含量等,直接或间接对 SAI 活性造成影响,要充分了解百合鳞茎中
SAI 性质,还需进一步对其酶学性质进行研究。
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