全 文 ：园 艺 学 报 2009, 36 (11) : 1635 - 1642
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 27; 修回日期 : 2009 - 06 - 05
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30671319)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: dingjun64@hunau1net)
拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 的亚克隆及其在番
茄中的表达
陈 武 1 , 杨玉婷 1 , 李 颖 2 , 黄三文 2 , 黎定军 13
(1 湖南农业大学生物安全科技学院 , 长沙 410128; 2 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 要 : 从拟南芥 JA tYTAC基因组文库中完整地亚克隆了 FLS2和 LysM 两个抗病基因 , 亚克隆的 DNA
片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子。利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种
‘Moneymaker’, 转基因植株经 PCR 初步筛选后再分别提取总 RNA 进行 RT2PCR, 以验证其是否在
‘Moneymaker’中表达。试验结果表明 , FLS2和 L ysM 均能成功地在 ‘Moneymaker’中表达 , 说明番茄的转
录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录 , 还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含
子。据此推测 , 拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份 , 这为探索在这两个物种间
R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。
关键词 : 拟南芥 ; 番茄 ; FLS2; LysM ; 亚克隆 ; 表达
中图分类号 : S 64112 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2009) 1121635208
Sub2clon ing of A rabidopsis FLS2 and L ysM Gene and The ir Expression in
Tran sgen ic Toma toes
CHEN W u1 , YANG Yu2ting 1 , L I Ying 2 , HUANG San2wen 2 , and L ID ing2jun 13
(1 College of B io2safety Science and Technology, Hunan A gricu ltura l U niversity, Changsha 410128, China; 2 Institu te of V egeta2
bles and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina)
Abstract: FLS2 and L ysM genes, two recep tor2like kinases (RLKs) genes, containing their own p ro2
moters, introns and transcrip tion term inators were sub2cloned from A rabidopsis TAC library, and then were
transformed into‘Moneymaker’by A grobacterium 2mediated app roach. Transgenic p lants were identified by
polymerase chain reaction ( PCR ). RT2PCR was performed to analyze two genespi exp ression in transgenic
p lants. The results illustrated that both FLS2 and L ysM genes can be transcribed with the recognition of p ro2
moters, the sp licing of introns and exons by tomato transcrip tion system. It can be deduced that the transcrip2
tion mechanism s of A rabidopsis and tomato could be conservative to some extent. This study p rovides a theoret2
ical base for understanding functional conservation of R genes between A rabidopsis and tomato.
Key words: A rabidopsis tha liana; tomato; FLS2 ; L ysM ; sub2cloning; exp ression
RLKs ( recep tor2like kinases, RLKs) 是一类位于细胞膜上接受外界信息并激活下游信号转导的蛋
白激酶类受体 , 在植物的发育与防卫反应过程中起着重要的作用 (D ievart & Clark, 2004)。拟南芥中
至少有 610个编码 RLKs的基因 , 占拟南芥基因组中编码蛋白质基因总量的 215%。RLKs与动物的
Raf激酶家族和丝氨酸受体激酶均起源于苏氨酸 /丝氨酸受体家族 , 它们结构上的共同特点是都由信
号转导序列、单跨膜区和细胞质内的激酶结构域组成 ( Shiu & B leekcer, 2001)。目前已经从拟南芥、
番茄、水稻等植物中分别克隆了少量编码 RLKs抗病蛋白的基因 : FLS2 ( Gomez & Boller, 2000)、
园 艺 学 报 36卷
L ysM (W an et al. , 2008) 和 EF2Tu ( Zipfel et al. , 2006) ; L eFLS2 ( Silke et al. , 2007) 和 O sFLS2
( Takai et al. , 2008)。
本试验中亚克隆了两个拟南芥 RL K基因 : FLS2和 L ysM。FLS2识别丁香假单胞杆菌番茄致病型
( Pseudom onas syringae pv. tomato, pst) 的鞭毛蛋白 ( flagellin) N端一段长 22个氨基酸的保守多肽
( Gomez & Boller, 2000) , 鞭毛蛋白在很多物种中都能特异激活植物的基本防卫反应。 pst既能侵染拟
南芥 , 也能危害番茄 , 是这两个远缘物种的共同病害 ; 番茄中存在一个 FLS2的同源基因 L eFLS2 , L e2
FLS2 (Robatzek et al. , 2007) 特异性识别大肠杆菌鞭毛蛋白的保守多肽 flg15, 但不能识别 pst的鞭
毛蛋白中的保守多肽 flg22; 几丁质是真菌细胞壁的组成成份 , L ysM 在拟南芥中是真菌几丁质诱导的
抗病信号途径中的关键基因 , 该基因被突变阻断了几丁质诱导的抗病信号途径 (W an et al. , 2008) ,
将 L ysM 转化番茄 , 可以研究其在番茄中是否也参与真菌几丁质诱导的抗病信号转导途径。作者将这
两个基因分别转化番茄品种 ‘Moneymaker’, 以研究其是否在番茄中表达 , 为利用拟南芥的抗病基因
进行番茄的抗病分子辅助育种进行有价值的探索。
1 材料与方法
111 试验材料
11111 大肠杆菌菌株
大肠杆菌 ( E1coli DH10B ) , 根癌农杆菌 (A. tum efaciens) 菌株 LBA4404和植物表达载体 pB IN2
PLUS均为中国农业科学院蔬菜花卉研究所生物技术室功能基因组保存 ; 供转基因的番茄材料为
‘Moneymaker’, 由中国农业科学院蔬菜花卉研究所王孝宣博士提供 ; 拟南芥 JA tYTAC基因组文库购
自 John Innes Centre Laboratory (英国 )。PCR所需的各种试剂和质粒小量提取试剂盒均购自天根生物
公司 (北京 ) ; 胶回收试剂盒 (Q IAquick Gel Extraction Kit)、 PCR产物纯化试剂盒 (Q IAquick PCR
purification Kit) 和质粒大量提取试剂盒 (Q IAGEN M idi 100) 均购自 Q IAGEN; T4连接酶购自 NEB;
TR IZOL购自 Invitrogen。
11112 大肠杆菌和根癌农杆菌所用的培养基及抗生素
用于培养 E1coli DH10B的 LB培养基不用添加任何抗生素 ; 含 50 mg·L - 1卡那霉素的 LB用于培
养电激转化 pB INPLUS重组质粒的 DH10B。含 50 mg·L - 1利福平的 LB用于培养 LBA4404; 电激转化
pB INPLUS重组质粒后的 LBA4404的培养基需另加 50 mg·L - 1卡那霉素。拟南芥 JA tY克隆用含 25
mg·L - 1卡那霉素的 LB培养。
11113 番茄组织培养所用培养基及试剂
MS基本培养基和反式玉米素核苷 ( Zeatin) 购自 Sigma公司 , 琼脂粉和特美汀 ( Timentin) 购自
Duchefa公司 , 卡那霉素 ( Kan) 购自 Am resco, 0122μm细菌过滤器购自 M illipore, 其它试剂为国产
分析纯。
1 /2MS: MS基本培养基 212 g·L - 1 , 蔗糖 30 g·L - 1 , 琼脂粉 7 g·L - 1 , pH 518;
M0: MS基本培养基 414 g·L - 1 , 蔗糖 30 g·L - 1 , 琼脂粉 7 g·L - 1 , pH 518;
M1: M0 + Zeatin 2 mg·L - 1 + Timentin 200 mg·L - 1 + Kan 50 mg·L - 1 ;
M2: M0 + Zeatin 1 mg·L - 1 + Timentin 200 mg·L - 1 + Kan 50 mg·L - 1 ;
M3: M0 + IBA 015 mg·L - 1 + Timentin 100 mg·L - 1 + Kan 30 mg·L - 1。
培养基中所加的植物生长调节剂和抗生素均经过滤除菌 , 待培养基冷却至 60 ℃以下凝固之前加
入 , 充分摇匀后再倒入培养皿中。
112 试验方法
11211 E1coli DH10B及农杆菌菌株 LBA4404感受态细胞的制备
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11期 陈 武等 : 拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 的亚克隆及其在番茄中的表达
两种细菌感受态细胞的制作及电激转化均参照电激转化仪 (M icroPulserTM , B io2Rad) 所附说明进
行。
11212 拟南芥 JA tY克隆质粒的提取与不完全酶切
FLS2和 L ysM 分别位于拟南芥克隆 JA tY76D19和 JA tY63F09中。挑取这两个 JA tY克隆活化、摇
菌培养。质粒提取参照试剂盒所附说明进行。质粒浓度用不同浓度的λDNA ( TaKaRa) 定量 , 选用
B am HⅠ的同尾酶 S au3AⅠ不完全酶切 , 100μL的反应体系中包括 7μg TAC质粒 (50～70μL ) , 012
U限制性内切酶 S au3AⅠ, 10μL 10倍反应液 , 加 ddH2 O补至 100μL。37 ℃, 15 m in (两个质粒的
适宜反应时间稍有不同 )。反应结束后立即加入 10μL上样缓冲液以终止反应并立即电泳 , 电泳结束
后用胶回收试剂盒回收 8～12 kb大小的片段 , 操作按试剂盒所附说明书进行。回收片段用λDNA精
确定量后保存于 - 20 ℃备用。
另取 5μgλDNA, 按上述方法不完全酶切并回收 8～12 kb大小的片段 , 定量后保存于 - 20 ℃备
用。
11213 pB INPLUS载体的制备及去磷酸化
含 pB INPLUS质粒的宿主菌的活化及质粒大量提取按照试剂盒所附说明书进行。载体用限制性内
切酶 B am HⅠ完全酶切 , 100μL的反应体系中含 : 质粒 40μL, 10 ×酶切反应液 10μL, B am HⅠ 5
μL, 灭菌水 45μL。轻弹管壁混匀 , 瞬间离心后 37 ℃水浴 3 h。反应结束后用 PCR产物纯化试剂盒
回收酶切产物 , 吸取 1μL电激转化 E1coli DH10B , 37 ℃, 150 r·m in - 1恢复培养 1 h后涂布于含卡那
霉素的 LB平板过夜培养。
每μg完全酶切的载体分别用 015、016、017 U的去磷酸化酶 (C IP) 处理 , 37 ℃处理 1 h, 反应
体系参照该酶所附说明进行。反应结束后用 PCR纯化试剂盒回收质粒。将上述经过处理的质粒分别
与按方法 11212所得的λDNA片段连接过夜 , 10μL反应体系包括 : 1μL连接反应液 , 1μL T4连接
酶 , 2μL去磷酸化载体 , 3μLλDNA , 3μL ddH2 O, 反应结束后均在 4 ℃对 ddH2 O透析脱盐 1 h, 然
后各取 2μL连接产物电激转化 E1coli DH10B, 涂布于含 X2gal/ IPTG的 LB平皿培养 , 根据蓝 /白菌落
的多少评价去磷酸化效果的好坏。选择去磷酸化效果最好、连接效率最高的载体与 FLS2和 L ysM 不
完全酶切回收的片段连接。
11214 目的片段与载体的连接及电激转化
连接参照 T4连接酶所附说明书进行。载体与目的片段的摩尔比为 1∶3～5, 10μL的连接体系包
括 : 连接反应液 1μL, T4连接酶 1μL, 载体 20 ng, 目的片段 85 ng, ddH2 O 3μL。16 ℃连接过夜 ,
连接产物透析脱盐后取 2μL电激转化 E1coli DH10B。
11215 引物设计及阳性克隆的筛选
用在线工具分析 FLS2和 L ysM 的启动子 ( PROSCAN Version 117, http: ∥www - bimas1cit1nih1
gov /molbio /p roscan / )。分别选择目的基因启动子前 1 kb 设计 LR 引物 (启动子前 ) ; 同时根据
www1arabidop sis1org上的数据 , 选择这两个基因 3′末端 (终止密码子 ) 下游 1 kb的序列分别设计 RS
引物 (终止子后 )。扩增目的基因的特异引物来自 http: ∥www1catma1org/; 本文所用的 PCR引物见
表 1。
选用 Sau3AⅠ不完全酶切拟南芥 JA tY克隆 , 单酶切产生两个相同的粘性末端 , 无法使插入片段
定向连接。因此 , 利用 PCR方法筛选阳性克隆时存在 4种可能的组合方式 : M 13 F + RF, M 13 F
+ LR , M 13R + RF和 M 13R + LR , 上述引物组合退火温度的计算方法为两者的 Tm 值之和的平
均值减 4或 5。
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园 艺 学 报 36卷
表 1 本试验所用的 PCR和 RT2PCR引物
Table 1 Pr im ers used for PCR and RT2PCR
引物名称
Primer name
引物序列 (5′- 3′)
Primer sequence (5′- 3′)
产物长度 / bp
Production size
退火温度 /℃
Tm
FLS2 MS ATCCGGGGTGTTCAAAAA 156 52
FLS2 MR GCGGCTGATCCAAGAATAATCA
FLS2 LR TTTAGGCGATCATCTCATA
FLS2 RS GTGACCGCGTTGCTCACGT
LysM MS TGGCGGAATTAGGGAAAG 160 52
LysM MR TACCGGCCGGACATAAGA
LysM LR AAGATGAAGGTGGTGCTAA
LysM RS TTCGTTTGTCCATTATTTGT
M 13F GTTTTCCCAGTCACGAC
M 13R CAGGAAACAGCTATGAC
FLS22RNA2S CAGCCTTCGAGGGTACAA 331 /237 52
FLS22RNA2R CCCCGAGTTCCATATCAA
LysM 2RNA2S CGCAAGATTATAGACCCG 414 /172 50
LysM 2RNA2R TCCAACATCCCAATTTCC
11216 重组质粒稳定性的验证
为了验证重组质粒在 DH10B 和 LBA4404中的稳定性 , 分别从 DH10B 中提取重组质粒 pB IN2
PLUS: : FLS2和 pB INPLUS: : L ysM , 电激转化 LBA4404感受态细胞 , 再分别从 LBA4404提取质粒电
激转化 DH10B并提取质粒。最后将按上述方法得到的质粒分别用限制性内切酶 EcoRⅠ和 X baⅠ双酶
切 , 1%的琼脂糖凝胶电泳检测其带型的一致性。将经过验证的含重组质粒的 LBA4404划线培养 , 挑
单菌落接种于 LB液体培养基培养 , 当 OD600达 016～018时 3 500 r·m - 1离心 10 m in收集菌体 , 用 20
mL液体 MS培养基悬浮漂洗后离心收集菌体 , 再用 20 mL液体 MS悬浮 , 加入乙酰丁香酮至终浓度为
200μmol·L - 1 , 用于子叶侵染。
11217 农杆菌介导的番茄的遗传转化
番茄的遗传转化参照 Sun等 (2006) 的方法。
11218 转基因植株 RNA的提取及 RT2PCR
选择转基因植株的幼嫩叶片 , 用 TR IZoL法 ( Invitrogen, Cat. 10296010) 提取转基因植株的总
RNA , 方法参照该试剂所附说明书。反转录 (Reverse transcrip tion) 参照 M 2MLV反转录酶所附说明书
进行。PCR程序为 : 94 ℃, 2 m in; 94 ℃, 20 s; X ℃ (退火温度参照表 1) , 20 s; 72 ℃, 15 s; 72
℃, 2 m in, 45个循环。回收 RT2PCR扩增的片段测序 , 用 DNAMAN (Multip le A lignment) 程序分别
分析测序结果、FLS2和 L ysM 的基因组 DNA序列和 cDNA序列的异同。
2 结果与分析
211 载体与不完全酶切片段的连接
载体粘性末端去磷酸化的目的是为了防止载体自连。试验发现 , 每μg载体用 016 U C IP处理。
处理后与回收的不完全片段连接效果最好 , 表现为阳性克隆 (白斑 ) 多。随机选择阳性克隆提取质
粒 , 用限制性内切酶 EcoRⅠ和 X baⅠ酶切 , 结果表明连接片段均大于 7 kb, 可以用于后续试验。
212 利用 M 13R /F与 L R /RS的引物组合筛选阳性克隆
Sau3AⅠ是 4个位点的限制性内切酶 , 理论上每 256个碱基就会出现一个酶切位点。为了确保启
动子和终止子均完整存在的阳性克隆不被漏选 , 将 pB INPLUS载体上的通用引物 M13F /R分别与启动
子前和终止子后的引物 (LR和 RS) 进行组合 PCR; 采用上述引物组合筛选阳性克隆 , 成功地亚克
隆了包含各自完整启动子和终止子的 FLS2和 L ysM。
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11期 陈 武等 : 拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 的亚克隆及其在番茄中的表达
213 重组质粒 pB INPL US: : FL S2和 pB INPL US: : L ysM 在农杆菌中的稳定性检测
由于插入的外源基因片段较长 , 可能会导致插入片段在宿主菌内重组或丢失 , 本试验利用 EcoR
Ⅰ /XbaⅠ双酶切的方法检测插入片段是否完整。结果表明 , 从 E1coli DH10B和农杆菌菌株 LBA4404
中提取的质粒酶切带型一致 , 说明重组载体中插入的外源 DNA片段在两个宿主菌中都未发生重组或
缺失 , 可用于随后的农杆菌介导的遗传转化 (图 1)。
图 1 2个重组质粒在 E1coli D H10B和 A1 tum efaciens stra in L BA4404中的稳定性验证
F ig. 1 The stab ility test of pB INPL US: : FLS2 and pB INPL US: : L ysM
in E1coli D H10B and A. tum efaciens stra in L BA4404
214 FLS2和 L ysM 转化番茄 ‘M oneymaker’
通过 PCR筛选 , 分别从转 FLS2 (图 2) 和 L ysM (图 3) 基因的番茄植株中扩增出相应的 DNA片
段 , 说明上述两个基因均成功地转化番茄品种 ‘Moneymaker’。拟南芥的 FLS2基因在番茄中有一个
直系同源基因 L eFLS2 , 该基因特异性识别大肠杆菌的鞭毛蛋白的一个肽段 ( fls15) , 但可能由于 PCR
引物扩增的目的序列不是二者的保守序列 , 所以在番茄 ‘Moneymaker’中未扩增出相应的条带 ; 而
L ysM 基因可能在番茄中也有同源序列存在 (目前未见相关报道 ) , 因此在未转基因的番茄 ‘Mon2
eymaker’中扩增出了两条非常弱的非特异性条带 (图 3)。
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215 FLS2和 L ysM 都能在番茄中表达
抗病基因在植物体内为低丰度组成性表达 , 当受到病原菌的诱导后其表达丰度随即上升。为了获
得足够的 PCR产物 , 将反转录后 PCR的扩增循环数增加至 45个。转基因植株的总 RNA中存在痕量
的基因组 DNA, 可以用作比较该基因的内含子被剪切后序列长度的变化。FLS2基因只含有一个长度
为 85 bp的内含子 , 在这个内含子两侧的外显子上设计 RT2PCR引物 , 该引物从基因组 DNA上扩增出
长度为 331 bp的片段 , 当以 cDNA为模板时其扩增片段长度为 237 bp (图 4)。L ysM 基因由 12个外
显子和 11个内含子组成 , 在其中一个内含子两侧设计 RT2PCR引物 , 该引物从基因组 DNA上扩增出
长度为 412 bp的片段 , 以 cDNA为模板时其扩增片段为 172 bp (图 5)。
为了进一步验证这两个基因的转录产物是否与其在拟南芥中的一致 , 分别回收 RT2PCR扩增的目
的片段进行测序 , 将所得序列分别与 FLS2和 L ysM 的基因组 DNA序列、 cDNA序列进行比对 (图 6
和图 7) , 结果表明 , FLS2和 L ysM 在番茄中的转录产物与其 cDNA序列 (拟南芥中 ) 完全一致 (两
个基因的所有序列信息均来自 www1arabidop sis1org)。
图 6 FLS2基因在番茄中的表达序列与其基因组序列及 cD NA序列的比对分析
F ig. 6 Sequence a lignm en t of RT2PCR products from tran sgen ic toma to: : FLS2,
genom ic sequence and cD NA sequence of FLS2 from A rabidopsis
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11期 陈 武等 : 拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 的亚克隆及其在番茄中的表达
图 7 L ysM 基因在番茄中的表达序列与其基因组序列及 cD NA序列的比对分析
F ig. 7 Sequence a lignm en t of RT2PCR products from tran sgen ic toma to: : L ysM ,
genom ic sequence and cD NA sequence of L ysM from A rabidopsis
3 讨论
拟南芥与番茄分属十字花科和茄科 , 它们早在 1 500万年前即已分化 , 甚至还早于单、双子叶植
物的分化 ( Gandolfo et al. , 1998)。但 Ku等 ( 2000) 的研究表明 , 这两个远缘物种的基因组之间存
在共线性关系 ; 进一步的研究发现 , 这两个物种中存在大量的直系同源基因 , 在新陈代谢、蛋白质合
成、细胞信号转导和病害防卫等方面起着保守的作用 ( Fulton et al. , 2002; W u et al. , 2006)。
本试验中亚克隆的拟南芥 FLS2和 L ysM 基因均包含它们天然的启动子、终止子和内含子。与其
他试验中应用花椰菜花叶病毒 35S启动子 (CaMV 35S) 等组成性表达的启动子不同。本试验的设计
有两个特点 : (1) 在 CaMV 35S的驱动下 , 外源 R基因在受体植株内高丰度组成性表达 , 导致转基因
植株的生理和代谢异常 , 株形矮化、产量和品质降低 ; R基因自身的启动子在基因组内为低丰度的组
成性表达 , 当其被源自病原菌的特异效应子激活后 , 其表达丰度随即升高 , 因此利用 R 基因本身的
启动子有利于其在受体植物中特异性应答病原菌的激活而表达 , 避免使用 CaMV 35S等启动子造成受
体植物的生理和代谢异常 ( Sarah & Paul, 2005)。 (2) 利用抗病基因的 cDNA进行功能鉴定可以避免
因为物种间转录机制的差异而导致转基因沉默现象的发生 , 而利用包含内含子的基因组序列 , 除了研
究基因的功能外 , 还可以研究供体和受体物种在 mRNA加工机制上的保守与差异。
本试验中利用 RT2PCR分析了拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 在转化番茄后的表达情况 , 结果表
明 , 这两个基因都能在转基因番茄植株中表达。经测序验证 , 两个基因在番茄中内含子的剪切、外显
子的连接与其在拟南芥中的完全一致。番茄的转录系统能识别拟南芥抗病基因 FLS2和 L ysM 的启动
子和内含子 , 说明这两个远缘物种在基因的转录水平上存在相对保守的机制。这为探索这两个物种间
R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。
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在后续试验中 , 将进一步验证 FLS2和 L ysM 在转基因番茄中是否存在部分转录、外显子重排和
移码等情况 , 并在此基础上进行抗病功能的鉴定。
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