全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（12）：2365–2372 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–09–19；修回日期：2011–11–28
基金项目：国家自然科学基金项目（31171923）；国家转基因生物新品种培育重大专项（2008ZX08009-3）；高校博士学科点专项科研基
金项目（20103702110003）；山东省自然科学基金项目（ZR2010CM020）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：hqyang@sdau.edu.cn；Tel：0538-8249304）
平邑甜茶MhVPE基因 ihpRNA干扰载体的构建
及转拟南芥验证
冉 昆 1，杨洪强 1,*，孙晓莉 1，沈 伟 1，姜倩倩 1，李 强 1，刘智新 2
（1 山东农业大学园艺科学与工程学院，作物生物学国家重点实验室，国家苹果工程技术研究中心，山东泰安 271018；
2山东农业大学信息科学与工程学院，山东泰安 271018）
摘 要：根据平邑甜茶液泡加工酶（vacuolar processing enzyme）基因 MhVPE（GenBank 登录号为
FJ891065）cDNA 序列，设计两对含有酶切位点的特异性引物 F1/F2 和 R1/R2，以 pMD-MhVPE 质粒为模
板，分别克隆了用于构建干扰载体的正反义片段 pMD-F 和 pMD-R。将该正反义片段分别插入表达载体
pART27 的相应位置，构建成了含有内含子发夹结构的 ihpRNA 表达载体 pART-RNAi-MhVPE。通过农杆
菌介导，用花序浸泡法转化拟南芥进行验证，经过抗性筛选和 PCR 检测，得到 17 株转基因阳性植株；半
定量 RT-PCR 结果显示所获得的转基因拟南芥植株中 AtVPE 同源基因的表达量明显降低，表明该干扰载
体能够有效抑制 VPE 基因的表达，MhVPE 基因的 ihpRNA 干扰载体构建成功，为进一步鉴定该基因的功
能奠定了基础。
关键词：平邑甜茶；MhVPE；RNA 干扰；ihpRNA；拟南芥
中图分类号：S 661 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）12-2365-08

Construction of ihpRNA Expression Vector of MhVPE Gene from Malus
hupehensis and Verification by Transgenic Arabidopsis thaliana
RAN Kun1，YANG Hong-qiang1,*，SUN Xiao-li1，SHEN Wei1，JIANG Qian-qian1，LI Qiang1，and LIU
Zhi-xin2
（1College of Horticulture Science and Engineering，Shandong Agricultural University，State Key Laboratory of Crop
Biology，National Research Center for Apple Engineering and Technology，Tai’an，Shandong 271018，China；2College of
Information Science and Engineering，Shandong Agricultual University，Tai’an，Shandong 271018，China）
Abstract：Based on the cDNA sequence of MhVPE gene（GenBank accession number：FJ891065）
from Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.，two pairs of specific primers containing different enzyme sites，
named F1/F2 and R1/R2 respectively，were designed. With the template of pMD-MhVPE plasmid
constructed previously，positive-sense strand pMD-F and antisense strand pMD-R were obtained，which
were inserted into specific sites of the expression vector pART27，separately. The RNAi vector of
pART-RNAi-MhVPE containing a hairpin structure was confirmed by the digestion of restriction enzymes.
pART-RNAi-MhVPE vector was then transformed into Arabidopsis thaliana col-0 using the floral dip method

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by Agrobacterium-mediated transformation system to verification its efficacy. Seventeen transgenic plants
were confirmed by kanamycin resistant selection and PCR testing. Semi RT-PCR results suggested that the
expression level of AtVPE homologous gene in transgenic Arabidopsis thaliana was decreased，which
proved that the expression of the targeted gene was inhibited efficiently and the ihpRNA vector of the
MhVPE gene was constructed successfully，building a solid foundation for further study on the function of
vacuolar processing enzyme（VPE）gene.
Key words：Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.；MhVPE；RNA interference；ihpRNA；Arabidopsis thaliana

液泡加工酶（vacuolar processing enzymes，VPEs）是一种位于植物液泡中的半胱氨酸蛋白酶，
属于豆类天冬氨酸蛋白内切酶（legumain）家族成员，对天冬氨酸和天冬酰胺残基羧基端的肽键具
有底物专一性（Hatsugai et al.，2006）。最初认为 VPEs 主要负责种子液泡中大多数蛋白质的加工成
熟（Shimada et al.，2003；Gruis et al.，2004），后来发现 VPEs 具有类似动物胱天蛋白酶（cysteine-
containing aspartate-specific proteases，caspases）的功能，能够调控细胞程序性死亡（programmed cell
death，PCD）（Hara-Nishimura et al.，2005；Lam，2005）；此外，还发现 VPE 参与植物超敏反应
（hypersensitive response，HR）和气孔运动（Zhang et al.，2010）的调节，并能够控制番茄果实中
糖的积累（Ariizumi et al.，2011），显示液泡加工酶对植物的生长发育和环境适应性具有重要的调节
作用。平邑甜茶是中国特有的苹果砧木资源，但目前人们对液泡加工酶在平邑甜茶等苹果砧木根系
中的功能还不清楚。
RNA 干扰（RNA interference，RNAi）技术是通过反向遗传学手段研究植物基因功能的有效手
段。所谓 RNA 干扰是指生物体内的双链 RNA（dsRNA）在 mRNA 水平上使特定基因表达关闭或沉
默的过程（Fire et al.，1998）。在研究中，通过表达载体将 dsRNA 转入目标植物体内，载体中插入
的反向重复序列转录为 mRNA 后，通过自我互补形成发夹 RNA（hairpin RNA，hpRNA），降解目
标植物同源基因编码的 mRNA，从而使目标基因的表达受到抑制；如果在反向重复序列间加入一段
功能性内含子，形成含内含子发卡结构的 RNA（intron splicing hpRNA，ihpRNA），则会进一步提高
对靶基因表达的抑制效果（Wesley et al.，2001；McGinnis，2010）。本研究中根据 RNA 干扰的原理，
构建了平邑甜茶 MhVPE 基因的 ihpRNA 表达载体，并将目的表达框转化拟南芥进行验证，可以降
解拟南芥中 VPE 同源基因的 mRNA，从而达到抑制基因表达的效果，为进一步在拟南芥中鉴定
MhVPE 基因的功能及在平邑甜茶中进行转化鉴定工作奠定基础，以期最终揭示液泡加工酶在苹果砧
木生长发育及环境适应中的作用。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验于 2010—2011 年在山东农业大学园艺科学与工程学院山东省果树生物学重点实验室进行。
拟南芥为哥伦比亚野生型（Arabidopsis thaliana col-0），克隆载体 pMD18-T simple vector 购自 TaKaRa
公司，用于构建干扰载体的质粒 pKANNIBAL 和 pART27 由澳大利亚 CSIRO Plant Industry 惠赠（构
建质粒图谱见图 1），大肠杆菌菌株 DH5α、农杆菌菌株 GV3101 及用于扩增的克隆载体 pMD-MhVPE
为本研究室保存。DNA Marker DL2000 plus 和 Taq DNA 聚合酶购自北京全式金生物科技有限公司，
限制性内切酶和 T4 DNA 连接酶等购自 TaKaRa 和 NEB 公司，质粒小提试剂盒和胶回收试剂盒为
Biomiga 产品。
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图 1 pART27-RNAi-MhVPE 表达载体的结构示意图
RB：右边界；35S pro：CaMV 35S 启动子；Sense：正向插入片段；pdk intron：pdk 内含子；Anti-sense：反向插入片段；OCS ter：OCS 终止子；
NOS pro：NOS 启动子；NPTⅡ：新霉素磷酸转移酶基因；NOS ter：NOS 终止子；LB：左边界。
Fig. 1 Structure map of pART27-RNAi-MhVPE expressing vector
RB：Right border；35S pro：CaMV 35S promoter；Sense：Fragment in sense orientation；Anti-sense：Fragment in anti-sense orientation；
OCS ter：OCS terminator；NOS pro：NOS promoter；NPTⅡ：Neomycin phosphotransferase gene；NOS ter：
NOS terminator；LB：Left border.
1.2 引物设计
根据本实验室之前得到的平邑甜茶 MhVPE（GenBank 登录号为 FJ891065）基因 cDNA 的保守
序列，应用 Primer Premier 5.0 软件设计引物（表 1），扩增片段长度为 417 bp。序列分析表明，拟南
芥 AtVPE（GenBank 登录号为 NM_119448）基因中所对应序列与该片段的同源性高达 73%，因此该
干扰载体转化拟南芥后应该会引起同源基因表达的抑制。其中，F1/F2 引物用于 MhVPE 基因正向片
段的扩增，R1/R2 引物用于 MhVPE 基因反向片段的扩增。AtVPE-1/AtVPE-2 引物用于拟南芥 AtVPE
基因片段的扩增；18S rRNA-1 和 18S rRNA-2 引物用于拟南芥 18S rRNA 基因片段的扩增。PDK1/ PDK2
引物用于 pdk 内含子片段的扩增；NPT1/NPT2 引物用于 NPTⅡ片段的扩增。
表 1 引物序列及 PCR 扩增基因片段
Table 1 Primer sequence and the amplified fragments
引物名称 Primer name 引物序列（5′–3′） Primer sequences 扩增产物长度/bp Fragment size
F1 F：GGAATTCCCTGCAAATGACAACT 417
F2 R：GGGGTACCCATCTGCTCCTGTGT
R1 F：CCCAAGCTTCATCTGCTCCTGTGT 417
R2 R：GCTCTAGACCTGCAAATGACAACT
PDK1 F：GTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAA 304
PDK2 R：ATTACAAGCAGATTGGAATT
NPT1 F：ATACCGTAAAGCACGAGGAAG 484
NPT2 R：CTGAAGCGGGAAGGGACT
AtVPE-1 F：GGGAAGGTTGTGGATAG 574
AtVPE-2 R：TTGAAGGTGGCTTTAGTG
18S rRNA-1 F：AGTTGAACCTTGGGATGG 442
18S rRNA-2 R：AGCGGAGTCCTATAAGCA
1.3 MhVPE 基因正、反义片段的克隆及序列测定
以含有 MhVPE 基因完整开放阅读框的 pMD-MhVPE（本实验室构建）质粒为模板，以 F1/F2
引物扩增正向插入片段。PCR 反应体系为 25 μL，反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s；58 ℃ 50 s；
72 ℃ 35 s；30 个循环；72 ℃ 10 min。以 pMD-MhVPE 为模板，以 R1/R2 引物扩增反义片段，PCR
反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s；53 ℃ 50 s；72 ℃ 35 s；30 个循环。
PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收，连接入克隆载体 pMD18-T simple vector，转化 E. coli DH5α
感受态细胞，重组子经 PCR 和酶切鉴定后由北京博尚生物技术有限公司测序。正、反义基因片段重
组子分别命名为 pMD-F 和 pMD-R。
1.4 MhVPE 基因 ihpRNA 表达载体的构建及鉴定
重组子pMD-F和pKANNIBAL分别用EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，目的条带切胶回收后，用T4 DNA
连接酶于 16 ℃连接，然后转化 E. coli DH5α 感受态细胞。重组子用 F1/F2 引物进行 PCR 鉴定，并
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图 3 pMD-F（1）和 pMD-R（2）酶切鉴定
Fig. 3 Identification of recombinant vectors pMD-F（1）and
pMD-R（2）
M：DL2000 plus marker.
用 EcoRⅠ和 KpnⅠ双酶切鉴定后测序，命名为 pKA-F。对重组子 pMD-R 和 pKA-F 用 HindⅢ和
XbaⅠ双酶切，目的条带切胶回收后用 T4 DNA 连接酶连接，转化 E. coli DH5α 感受态细胞。重组子
用 HindⅢ和 XbaⅠ双酶切鉴定后测序，命名为 pKA-F-R。对重组子 pKA-F-R 和 pART27 载体用 NotⅠ
单酶切，目的条带切胶回收，用 T4 DNA 连接酶连接，转化 E. coli DH5α 感受态细胞。重组子用
NotⅠ单酶切及 XhoⅠ和 XbaⅠ双酶切鉴定，命名为 pART-RNAi-MhVPE。
1.5 农杆菌介导的拟南芥转化及鉴定
采用 CaCl2 冻融法将重组子 pART-RNAi-MhVPE 转化入农杆菌 GV3101 感受态细胞，菌液涂布
于含有壮观霉素（Spec）和利福平（Rif）的 LB 固体培养基上，28 ℃培养 2 d，挑取单菌落进行 PCR
鉴定。然后进行农杆菌的扩大培养，利用花序浸泡法（Zhang et al.，2006）转化拟南芥。
拟南芥种子收获后，种植于含有卡那霉素（Kan）的 MS 培养基上，按照 Harrison 等（2006）
的方法进行转基因拟南芥的抗性初步筛选。之后采用 Kasajima 等（2004）的方法快速提取抗性苗叶
片基因组 DNA。依次用 3 对引物：①F1/F2，②PDK1/PDK2，③NPT1/NPT2 扩增目的片段。PCR
扩增程序分别为：①94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，58 ℃ 50 s，72 ℃ 35s；30 个循环；②94 ℃ 5 min；
94 ℃ 50 s；43 ℃ 50 s；72 ℃ 35 s，30 个循环；③94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s；50 ℃ 50 s；72 ℃
35 s；30 个循环。用天根新型植物基因组 DNA 提取试剂盒（DP320）提取所获得的阳性植株叶片
DNA，用上述引物再次鉴定。
1.6 拟南芥 RNA 提取及半定量 RT-PCR
拟南芥叶片总 RNA 用北京全式金生物技术公司的 TransZol 提取。再用 DNase（RNase free）处
理总 RNA 并确定无基因组 DNA 污染后，用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa Code：
D6110A）反转录得到 cDNA。以拟南芥 18S rRNA 基因为半定量 RT-PCR 的内标。
2 结果与分析
2.1 正、反义片段的克隆及重组子的鉴定
以 pMD-MhVPE 质粒为模板，分别用 F1/F2 引物进行正向插入片段扩增，R1/R2 引物进行反向
插入片段扩增，扩增产物长度均为 417 bp（图 2）。重组质粒 pMD-F 和 pMD-R 分别用 EcoRⅠ和 Kpn
Ⅰ及 HindⅢ和 XbaⅠ双酶切，均可切下 417 bp 的目的片段（图 3），且测序结果正确，说明载体 pMD-F
和 pMD-R 构建成功。


图 2 MhVPE 基因正义（s）和反义（a）片段 PCR 产物
Fig. 2 PCR products of sense（s）and anti-sense（a）fragments
of MhVPE gene
M：DL2000 plus marker.
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图 6 pART-RNAi-MhVPE 酶切鉴定
Fig. 6 Identification of recombinant vector pART-RNAi-MhVPE
M：DL2000 plus marker.
2.2 pKA-F 及 pKA-F-R 质粒重组子鉴定
以 pKA-F 质粒为模板，以 F1/F2 引物进行 PCR 扩增，得到 417 bp 条带，与预期结果一致（图
4，A）。重组质粒 pKA-F 用 EcoRⅠ和 KpnⅠ双酶切，在 417 bp 处得到目的条带（图 4，B），表明
pKA-F 载体已构建成功。重组质粒 pKA-F-R 分别用 EcoRⅠ/KpnⅠ和 HindⅢ/XbaⅠ双酶切，均在 417
bp 处有目的条带（图 4，C），表明 pKA-F-R 载体构建成功。

图 4 pKA-F 质粒 PCR 产物鉴定（A）与 pKA-F 质粒（B）、pKA-F-R（C）的酶切鉴定
Fig. 4 PCR products of pKA-F（A）plasmid and identification of recombinant vector pKA-F（B），pKA-F-R（C）
M：DL2000 plus marker；1–5：PCR products of pKA-F；6,7：pKA-F digested by EcoRⅠ/KpnⅠ；
8：pKA-F-R digested by EcoRⅠ/KpnⅠ；9：pKA-F-R digested by HindⅢ/Xba.
2.3 pART-RNAi-MhVPE 质粒重组子的鉴定
以 pART-RNAi-MhVPE 重组子为模板，以 F1/F2 引物进行 PCR 扩增，电泳检测为 417 bp 的目
的条带（图 5）。若载体构建成功，用 XhoⅠ/XbaⅠ对质粒进行双酶切后将得到 1 650 bp 左右的目的
条带，用 NotⅠ单酶切后将得到 3 800 bp 左右的条带（图 6），可见 ihpRNA 载体 pART-RNAi-MhVPE
已经构建成功。



2.4 转基因拟南芥的筛选及鉴定
用花序浸泡法转化哥伦比亚野生型（col-0）拟南芥，将收获的种子消毒后播于含有 50 μg · mL-1
卡那霉素的 MS 培养基上，在 22 ℃下依次进行 6 h 光照、48 h 黑暗、24 h 光照处理，78 h 后即可筛
选得到抗性苗（图 7 所示，图中箭头所示生长茁壮，叶片浓绿的即为抗性苗）。
取抗性苗叶片进行快速 DNA 提取，以其为模板，依次用引物 NPT1/NPT2、F1/F2 和 PDK1/PDK2
扩增 NPTⅡ基因片段（484 bp）、靶基因序列（417 bp）和 pdk 内含子序列（304 bp），进行 PCR 检
测。3 次 PCR 检测同为阳性的抗性苗即可确定为转基因植株，目前共得到 17 株转基因拟南芥阳性
植株。从中随机取 6 株转基因阳性植株，用天根新型植物基因组 DNA 提取试剂盒提取叶片基因组
图 5 pART-RNAi-MhVPE 质粒 PCR 产物（1，2）鉴定
Fig. 5 PCR products of pART-RNAi-MhVPE plasmid（1，2）
M：DL2000 plus marker.
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DNA，以上述引物再次进行 PCR 确定（图 8），结果表明这 6 个阳性株系均转 pART-RNAi-MhVPE
载体成功。

图 7 转化子拟南芥的卡那霉素抗性快速筛选
图中箭头所示叶片浓绿的为抗性苗。
Fig. 7 Rapid selection of kanamycin-resistant Arabidopsis thaliana transformants
The kanamycin-resistant seedlings，showed with arrowhead，have green leaves.


图 8 部分转基因拟南芥中 NPTⅡ（A）、正向插入片段（B）和 pdk 内含子序列（C）检测
1 ~ 6：阳性植株。
Fig. 8 PCR products of NPTⅡ gene（A），sense fragment（B）and pdk intron fragment（C）in transgenic Arabidopsis thaliana
1–6：Positive plants.

2.5 转基因拟南芥的半定量 RT-PCR 分析
取上述 6 个阳性拟南芥植株及野生型植株叶片，提取总 RNA 后反转录为 cDNA，以此为模板，
以拟南芥AtVPE基因和18S rRNA基因各自的特异性引物AtVPE-1/AtVPE-2和18S rRNA-1/18S rRNA-2
进行 PCR 扩增。半定量 RT-PCR 结果（图 9）显示，6 株转基因植株（1 ~ 6）中 AtVPE 基因的表达量

图 9 转基因拟南芥的半定量 RT-PCR 分析
WT：野生型；1 ~ 6：阳性植株。
Fig. 9 Semi-quantitative RT-PCR analysis of transgenic Arabidopsis thaliana（1–6）and non-transgenic Arabidopsis thaliana（WT）
WT：Wild type；1–6：Positive plants.
12 期 冉 昆等：平邑甜茶 MhVPE 基因 ihpRNA 干扰载体的构建及转拟南芥验证 2371

相对于非转基因的野生型拟南芥（WT）都有所降低，其中株系 6 几乎检测不到基因的表达，这表
明该干扰载体转入拟南芥后能够引起拟南芥同源基因 AtVPE 表达量的降低，从而实现抑制基因表达
的目的。
3 讨论
RNA 干扰现象自被发现以来，就广泛用于植物基因功能的分析与验证，在作物遗传改良方面显
示出了巨大的应用潜力。目前在植物研究领域，RNAi 介导的方法主要包括正义 RNA 介导的共抑制、
反义 RNA 介导的基因抑制、病毒介导的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）及 hpRNA
介导的基因沉默（曾晓珊 等，2007）。研究表明，用反义抑制和共抑制方法介导的转录后基因沉默
（Post-transcriptional gene silencing，PTGS）效率在 0 ~ 30%，而 hpRNA 结构则能显著提高 RNA 沉
默的效率至 55%甚至更高（Wesley et al.，2001）。因此，hpRNA 介导的基因沉默因其效率高，干扰
作用持久，可稳定遗传给后代等优点成为近年来 RNAi 研究的热点。
研究表明，若在靶基因的反向重复序列间加入一段有功能的内含子序列（转录后可被剪切），
使其在植物体内转录形成 ihpRNA 发夹结构，与 hpRNA 相比，沉默效果可从 55%提高到 90%（Smith
et al.，2000；Wesley et al.，2001）。ihpRNA 结构可以说是目前沉默效率最高的一种途径，因此本研
究在构建的 RNAi 表达载体的正义和反义片段中间插入 pdk 内含子序列作为功能性内含子，以期最
大限度的抑制基因的表达，通过反向遗传学手段研究该基因的功能。此外，RNAi 载体构建过程中，
干扰片段的长度和在靶基因中的位置将影响 RNAi 的效率和效果（张恭 等，2007）。因此必须选取
合适的靶基因片段，包括选取片段的长度、是否为保守区及与靶基因的同源性等。植物 ihpRNA 结
构中构成发夹结构的臂序列的选择具有可塑性，一般为 90 ~ 900 bp，甚至全长 cDNA 序列都会表现
出 RNA 干扰效应（张恭 等，2007）。虽然通常认为 hpRNA 载体设计时，靶基因序列应选择基因保
守区，但采用靶基因的 5′-UTR 片段（Stoutjesdijk et al.，2002）以及用 3′-UTR 序列的反向重复片
段连接于目的基因片段（Brummell et al.，2003）构建载体转化时，植株仍可表现出基因表达抑制现
象。将靶基因保守区域包含在干扰片段内，可能会同时沉默该家族基因，选择非保守区域则会提高
沉默单个基因的效率和特异性（张恭 等，2007）。
本研究中选择 417 bp 的基因保守区域用于构建 ihpRNA 载体，扩增的正反向插入片段在 35S 强
启动子和 OCS 终止子的控制下，可以高效表达，而且不存在插入方向问题，无论正反，都能在植物
体内形成具有发夹结构的 ihpRNA。ihpRNA 能够同时诱导与外源基因同源的内源性基因沉默，
DNAMAN6.0 软件比对平邑甜茶和拟南芥 VPE 基因序列，二者在核苷酸水平上的一致性为 73.01%，
氨基酸水平的一致性为 73.69%，具有较高的同源性。因此，将平邑甜茶 MhVPE 基因的 ihpRNA 干
扰载体转化入拟南芥后，应当能够引起拟南芥内源 AtVPE 同源基因的沉默。而本研究随机选取 6 株
阳性植株进行 RT-PCR 分析显示，转基因拟南芥中 AtVPE 同源基因的转录产物均比野生型明显减少，
这证明了该干扰载体的确引起了拟南芥 AtVPE 基因的沉默，同时也表明能够有效抑制 VPE 基因表
达的 ihpRNA 干扰载体已经构建成功。在此基础上，如果进一步分析鉴定转基因拟南芥植株的表型
特征，同时将该干扰载体转化平邑甜茶以及将 VPE 过表达载体转化拟南芥 vpeko 缺失突变体，通过
分析比较 VPE 基因的过表达、干扰表达及缺失突变对表型及抗性的影响等，将有助于最终揭示
MhVPE 基因的功能。
另外，本研究中首次将转基因拟南芥的快速抗性筛选（Harrison et al.，2006）和快速 DNA 提取
结合起来（Kasajima et al.，2004），完成抗性筛选只需 78 h，与传统的抗性筛选长达 2 ~ 3 周相比，
大大节省了时间和工作量。尽管快速提取 DNA 的缓冲液中存在 EDTA 等抑制 PCR 的成分，会造成
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部分假阳性和假阴性，但可以通过设计引物和试验重复加以克服。笔者用天根基因组 DNA 提取试
剂盒提取 6 株阳性株系的基因组 DNA 后再次进行了 PCR 鉴定，结果表明所筛选出的阳性植株均含
有相应的目的条带，说明本研究中所采用的筛选方法可行，且具有省时、省力、经济并可靠的效果。

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