全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（6）：1180–1184 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–01–20；修回日期：2011–05–03
基金项目：国家科技支撑计划项目（2007BAD45B01，2007BAD45B04）；云南省自然科学基金项目（2007C121M）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：wjh0505@gmail. com）
百合疫病病原鉴定及其 PCR 检测
杨秀梅 1，瞿素萍 1，王丽花 1，刘晓侠 2，彭绿春 1，王继华 1,*
（1 云南省农业科学院花卉研究所，云南省花卉育种重点实验室，昆明 650205；2浙江嘉兴学院生化学院，浙江嘉兴
314001）
摘 要：对从百合疫病病株上分离得到的病原菌进行了形态特征观察、致病性测定及核糖体 DNA-ITS
序列分析。结果表明，该菌为疫霉属真菌，与 GenBank 中烟草疫霉 ITS 序列的同源性为 98% ~ 99%。结
合病原菌 PCR 检测结果，进一步证实其为烟草疫霉菌（Phytophthora nicotianae）。这是烟草疫霉菌侵染云
南切花百合的首次报道。
关键词：百合；疫病；病原鉴定；PCR 检测
中图分类号：S 682.2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）06-1180-05

Identification and PCR Detection of Phytophthora Blight of Lily
YANG Xiu-mei1，QU Su-ping1，WANG Li-hua1，LIU Xiao-xia2，PENG Lü-chun1，and WANG Ji-hua1,*
（1Flower Research Institute，Yunnan Academy of Agriculture Sciences，Yunnan Key Laboratory for Flower Breeding，
Kunming 650205，China；2Biochemical College of Jiaxing University，Jiaxing，Zhejiang 314001，China）
Abstract：The pathogen causing lily Phytophthora blight was isolated from diseased plants with
typical symptoms on basal stems. The fungi was identified as Phytophthora nicotianae according to
morphological characteristics，pathogenicity and the sequence of ribosomal DNA-ITS. The sequence of
ribosomal DNA-ITS of isolate P1 was showed a sequence identity of 98%–99% with Phytophthora
nicotianae published in GenBank. PCR detection using P. nicotianae–specific primers indicated that the
pathogen was P. nicotianae. This is the first report of Phytophthora blight of lily in Yunnan.
Key words：lily；Phytophthora blight；pathogen identification；PCR detection

百合疫病是由疫霉属真菌引起的一类病害，在天气潮湿或多雨季节发生，植株发病率 10% ~
15%，严重时可达 30%以上，导致植株成片死亡，严重影响切花产量和质量。百合疫病是目前云南
切花百合的主要病害之一，随着百合种球贸易和二代球种植，该病有逐年加重的趋势。
已报道百合疫病的病原主要为烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）和恶疫霉（Phytophthora
cactorum）。中国广州和甘肃兰州地区发生的百合疫病病原均为烟草疫霉（P. nicotianae）（徐秉良和
马书智，2005）。Bakonyi 等（2001）报道百合疫病的病原为烟草疫霉。为明确云南百合种植基地
百合疫病的病原类型，作者进行了病原菌形态特征、致病性及核糖体 DNA-ITS 序列分析，为该病防
治及抗性品种选育研究提供一定的理论依据。


6 期 杨秀梅等：百合疫病病原鉴定及其 PCR 检测 1181

1 材料与方法
1.1 病原菌的分离和纯化
2009 年 7 月，作者从云南省玉溪市百合种植基地采集症状典型的百合疫病病株，采用常规组织
分离法在 10% V8 选择性培养基上分离，25 ℃黑暗条件下培养，待长出菌落后对病原菌进行纯化，
获得的菌株于 10% V8 平板培养基上室温保存（郑小波，1997）。10% V8 选择性培养基的配方为：
1 L 培养基中含 V8 蔬菜汁 100 mL，CaCO3 0.2 g，琼脂 18 g，抑制剂为氨苄青霉素 100 mg，青霉素
50 mg，多菌灵 10 mg。抑制剂在培养基灭菌冷却至 45 ℃时加入，摇匀后倒成平板。
1.2 病原菌形态特征观察
菌落观察：供试菌株接种在 10% V8 琼脂平板培养基上，25 ℃培养 3 d 后用打孔器打取菌丝块，
接种在 10% V8 平板培养基中央，置于 25 ℃恒温箱中培养，观察菌落形态，测量菌落直径，计算生
长速率。
孢子囊观察：将菌丝块接种到盛有 V8 液体培养基的三角瓶中，25 ℃、黑暗条件下静置培养 3 d。
倒去培养液，加入无菌水重新悬浮菌丝团，每瓶中加入 6 ~ 8 滴土壤浸出液，置于 25 ℃、黑暗条件
下培养。以后每隔 24 h 换 1 次水，并滴加土壤浸出液，48 h 后观察游动孢子囊产生情况（郑小波，
1997）。
1.3 致病性测定
百合品种‘西伯利亚’植株长出 4 ~ 5 片叶时，采用菌丝块接种法进行接种。将在 10% V8 琼脂
平板培养基上培养 5 d 的疫霉菌丝块贴于百合植株茎基部，用脱脂棉蘸无菌水覆于接种点上保湿 24
h。接种植株置于 25 ℃温室中生长，观察发病情况（郑小波，1997）。以灭菌水为对照，每处理接
种 5 株，3 次重复。
1.4 核糖体 DNA-ITS 序列分析
参考 CTAB 法（王源超 等，2000）提取菌株 P1 的 DNA。
PCR 扩增采用真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS）通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCT
GCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCG CTTATTGATATGC-3′）。PCR 反应体系为：10 × PCR buffer 2.5 µL，
2.5 mmol · L-1 dNTP 2.5 µL，20 pmol · L-1 的 ITS1 和 ITS4 引物各 0.5 µL，5 U Taq 酶 0.3 µL，模板
DNA 20 ng，最后加 ddH2O 补足至 25 µL。扩增反应程序为：94 ℃预变性 4 min；94 ℃变性 30 s、
56 ℃退火 50 s、72 ℃延伸 1 min，35 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min。
序列测定委托大连宝生物工程有限公司进行。测序后，将菌株 P1 rDNA ITS 序列与 GenBank 核
酸数据库中相关菌株进行同源性比较。进一步利用软件 DNAMAN 和 MEGA 建立疫霉菌第Ⅱ组不同
种的系统发育树。
1.5 病原菌的 PCR 检测
百合疫病病株总 DNA 提取方法参照传统的 CTAB 法（吴学尉 等，2009）。
采用烟草疫霉特异性引物 PNIC1-ITS3 进行病原的 PCR 检测。引物序列为 PNIC1：5′-ATTCAA
AAGCCAAGCCACCG-3′，ITS3：5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′。PCR 反应体系为 25 µL：
10 × PCR buffer 2.5 µL，2.5 mmol · L-1 dNTP 2.5 µL，20 pmol · L-1 的引物各 0.5 µL，5 U Taq 酶 0.5 µL，
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模板 DNA 20 µL，加 ddH2O 补足至 25 µL。扩增反应程序为：94 ℃预变性 1 min；94 ℃变性 15 s，
55 ℃退火 15 s，72 ℃延伸 15 s，30 个循环；最后 72 ℃延伸 6 min。PCR 产物用 1.5%琼脂糖凝胶电
泳检测（Tooley et al.，1997）。
2 结果与分析
2.1 病原菌的致病性
采用菌丝块接种法接种百合植株幼苗，5 d 后接种点产生形状不规则的水浸状坏死斑，随着病
情发展，病斑面积不断扩大，最终整株死亡（图 1）。采集病株进行病原分离，再次获得与原分离
菌一致的病原菌，根据柯赫氏法则，证实分离菌为百合疫病菌。
图 1 百合疫病接种症状
Fig. 1 Symptoms of Phytophthora blight of lily
2.2 病原菌的形态特征
分离菌株 P1 在 V8 平板培养基上生长较快，25 ℃黑暗条件下生长速度为 10.2 mm · d-1。如图 2
所示，气生菌丝白色，无隔，生长旺盛。菌落均匀一致，边缘整齐。菌丝块在水中产生大量孢子囊，
孢子囊脱落或不脱落。孢子囊光滑，倒梨形、卵圆形或近球形，大小为 30 ~ 62 µm × 21 ~ 46 µm，
具有明显的乳突。厚垣孢子间生或顶生，球形到卵圆形，光滑。根据形态学鉴定结果，初步判断分
离得到的病原菌为疫霉菌（Phytophthora spp.）。
图 2 疫霉菌的形态特征
a：孢子囊；b：菌丝；c：厚垣孢子。
Fig. 2 Morphological characteristics of Phytophthora spp. isolated from lily
a：Sporangium；b：Hyphae；c：Chlamydospore.
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图 3 P1 菌株的 ITS 扩增产物
Fig. 3 PCR amplification of the rDNA ITS1 and ITS4 regions
from P1 strain
2.3 病原菌 rDNA-ITS 序列分析
为进一步鉴定该疫霉菌，克隆并分析了菌
株 P1 的 rDNA-ITS 序列。PCR 扩增产物经 1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约 850 bp 的片
段（图 3）。经测序，该序列全长为 835 bp
（GenBank 登录号：GU299778）。将菌株 P1
的核糖体 DNA-ITS 基因在 GenBank 中进行同
源性比较，发现与其同源性最高的 100 个 ITS
序列菌株全部为烟草疫霉菌，P1 与它们的同源
性为 98% ~ 99%。
进一步利用软件DNAMAN和MEGA建立
疫霉菌第Ⅱ组不同种的系统发育树（图 4），
结果菌株 P1 与 GenBank 中 P. nicotianae（登录号：GU902246）的遗传距离最近，位于系统发育树
的同一分支，证实分离得到的病原菌为烟草疫霉（P. nicotianae）。
图 4 P1 菌株与疫霉菌第Ⅱ组不同种基于 ITS 序列的系统发育树
Fig. 4 Phylogenetic tree of isolate P1 and species of Phytophthora groupⅡbased on sequences of ITS region
2.4 病原菌的 PCR 检测
PCR检测结果（图5）表明，烟草疫霉特异性引物PNIC1-ITS3分别从菌株P1及感病植株DNA中
扩增出长度约为455 bp的特异性目的片段。结合菌株形态学特征及ITS-DNA序列分析，进一步证实
分离得到的病原菌为烟草疫霉（P. nicotianae）。
图 5 P1 菌株的 PCR 检测结果
M：Marker；1：菌株P1；2：感病植株；3：空白。
Fig. 5 The detection result of P1 strain by PCR
M：Marker；1：P1 strain；2：Diseased plant；3：Blank.
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3 讨论
由于疫霉属真菌形态变异大，一些分类、鉴定的依据不太稳定，因此疫霉菌的分类与鉴定是真
菌中最困难的属之一（郑小波，1997）。传统的鉴定方法主要以形态特征和生理生化指标作为疫霉
菌分类鉴定的主要依据，但此方法受多种外界因素的影响，具有很大的不确定性，特别是培养物不
典型或不产孢时，使得鉴定工作更加困难。因此，根据 DNA 水平的差异进行真菌鉴定或系统发育
的研究越来越得到重视。人们发现 ITS 区具有丰富变异特点，常常将这一可变区作为真菌菌种和分
离物鉴定的可靠依据之一，现已广泛应用于镰刀菌（Fusarium spp.）、疫霉菌（Phytophthora spp.）
等病原真菌的分类鉴定（张正光 等，2005）。
由于疫霉菌在培养基上生长较慢，经常被镰刀菌（Fusarium spp.）等真菌的生长所掩盖，因此
有必要结合分子生物学方法进行鉴定。本研究中对百合疫霉菌核糖体 DNA-ITS 序列进行分析，分离
菌 DNA-ITS 序列与烟草疫霉的同源性达 98% ~ 99%，结合形态学特征，将分离菌株鉴定为烟草疫霉
菌（P. nicotianae），为该病的防治和抗病品种选育研究提供了一定的理论依据。
烟草疫霉（P. nicotianae）寄主范围很广，我国已报道的寄主有 60 余种，除可侵染烟草、黄瓜、
番茄、辣椒等多种农作物外，还可侵染百合、月季、长春花、一品红等多种树木花卉（郑莹 等，2008）。
据报道，东方百合品种‘Stargazer’、亚洲百合品种‘London’、铁炮百合品种‘Georgia’都极易感
染烟草疫霉菌（Jee & Kim，1998；Bakonyi et al.，2001）。目前流行的百合品种及野生种质资源是否
存在抗病资源，以及烟草疫霉菌不同菌株间的致病力分化都有待进一步研究。

References
Bakonyi J，Nagy Z，Vajna L. 2001. Phytophthora nicotianae causes blight of lily in Hungary. The British Society for Plant Pathology，50 (6)：795.
Jee Hyeong-jin，Kim Wan-gyu. 1998. Unrecorded Phytopthora diseases of flowering plants caused by Phytophthora nicotianae in Korea. The Plant
Pathology Journal，14 (5)：452–457.
Tooley P W，Bunyard B A，Carras M M，Hatziloukas E. 1997. Development of PCR primers from internal transcribed spacer region 2 for detection
of Phytophthora species infecting potatoes. App Environ Microbiol，63 (4)：1467–1475.
Wang Yuan-chao，Zhang Zheng-guang，Zheng Xiao-bo. 2000. Use ITS regions of rRNA gene as an additional characteristic in identification of
Phytoththora boehmeriae and P. cactorum. Mycosystema，19 (4)：485–491. (in Chinese)
王源超，张正光，郑小波. 2000. 核糖体基因 ITS 作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究. 菌物系统，19 (4)：485–491.
Wu Xue-wei，Cui Guang-fen，Wu Li-fang. 2009. Identification of ISSR in lily hybrids. Acta Horticulturae Sinica，36 (5)：749–754. (in Chinese)
吴学尉，崔光芬，吴丽芳. 2009. 百合杂交后代 ISSR 鉴定. 园艺学报，36 (5)：749–754.
Xu Bing-liang，Ma Shu-zhi. 2005. Screening of media and identification of pathogen causing lily blight. Acta Phytophylacica Sinica，32 (3)：
287–290. (in Chinese)
徐秉良，马书智. 2005. 百合疫病病原菌的鉴定及培养基的筛选. 植物保护学报，32 (3)：287–290.
Zhang Zheng-guang，Guo Cheng-bao，Wang Yuan-chao，Zheng Xiao-bo. 2005. Identification and ITS sequence analysis of the pathogens causing
root rot of Gerbera jamesonii in Nanjing area. Acta Phytopathologica Sinica，35 (5)：392–396. (in Chinese)
张正光，郭成宝，王源超，郑小波. 2005. 非洲菊根腐病病原的鉴定与 ITS 序列分析. 植物病理学报，35 (5)：392–396.
Zheng Xiao-bo. 1997. Phytophthora and its research technology. Beijing：China Agriculture Press. (in Chinese)
郑小波. 1997. 疫霉菌及其研究技术. 北京：中国农业出版社.
Zheng Ying，Duan Yu-xi，Chen Li-jie. 2008. Studies on the pathogen of sponge gourd wilt in Shenyang. Plant Protection，34 (5)：27–31. (in Chinese)
郑 莹，段玉玺，陈立杰. 2008. 沈阳地区丝瓜疫病病原菌研究. 植物保护，34 (5)：27–31.