全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (12) : 1741 - 1748
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 06 - 10; 修回日期 : 2009 - 09 - 18
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30871700) ; 西北农林科技大学拔尖人才支持计划项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: fwm64@ sina1com)
阔叶猕猴桃果实 Ga lDH cDNA克隆及其在大肠杆
菌中的表达
尚增振 , 王小华 , 马锋旺 3 , 梁 东
(西北农林科技大学园艺学院 , 陕西杨凌 712100)
摘 　要 : 以猕猴桃属植物中果实维生素 C含量最高的阔叶猕猴桃 (A ctin id ia latifolia Merr. ) 果实为试
材 , 经 RT2PCR扩增获得约 110 kb的 L -半乳糖脱氢酶 cDNA片段。生物信息学分析表明 , 该 cDNA片段长
为 997 bp, 最大开放阅读框为 960 bp, 可编码 319个氨基酸残基 , 命名为 A lGalDH , GenBank登录号为
EU525846, 核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与已知其它植物 GalDH核苷酸、氨基酸序列间的同源性分别
在 76%和 70%以上 , 且具有醛酮还原酶的保守结构域。构建了其原核表达载体 pET2A lGalDH并转化大肠杆
菌 BL21, 经 011 mmol·L - 1 IPTG诱导 , 获得具有较高活性的表达融合蛋白 6 ×H is2A lGalDH。经 N i2H is亲和
磁珠分离纯化 , 获得单一的融合目的蛋白条带 , 测定其酶活为 120 pmol·m in - 1 ·mg- 1。
关键词 : 阔叶猕猴桃 ; GalDH; 克隆 ; 原核表达
中图分类号 : S 66314; Q 78　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1221741208
C lon ing of L 2ga lactose D ehyrogena se Gene from A ctin id ia la tifo lia M err. and
Its Expression in E1coli
SHANG Zeng2zhen, WANG Xiao2hua, MA Feng2wang3 , and L IANG Dong
(College of Horticu lture, N orthw est A & F U niversity, Yangling, Shaanxi 712100, Ch ina)
Abstract: U sing fruits of A ctin id ia la tifolia Merr. with the highest content of vitam in C in A ctin id ia as
materials, the fragment of L2galactose dehydrogenase ( GalDH) gene designated A lGalDH ( GenBank accession
No. EU525846 ) was amp lified by reverse transcrip tion polymerase chain reaction ( RT2PCR ) and then
cloned. B ioinformatics analysis indicated that the length of cDNA was 997 bp , which contained an open read2
ing frame of 960 bp and encoded a p rotein of 319 am ino acid residues. The homology analysis demonstrated
that A lGa lDH shared high sim ilarities of nucleotides and deduced am ino acids with those in other p lants over
76% and 70% respectively. The form s of A lGalDH included one A ldo2keto reductases conversed domains.
The A lGa lDH was then successfully subcloned into pET232a ( + ) to construct its p rokaryotic exp ression vector
pET2A lGalDH. After transformation into E1coli BL21, the fusion p rotein (6 ×H is2A lGalDH) was p roduced at
a high level induced by 011 mmol·L - 1 IPTG. One single band of p rotein with the H is2tag was purified by N i2
H is B ind Resin and then used as the temp late to analyze the enzyme activity which showed 120 pmol·
m in - 1 ·mg- 1.
Key words: A ctin id ia la tifolia Merr. ; L2galactose dehydrogenase; GalDH; cloning; p rokaryotic exp res2
sion
在高等植物维生素 C合成的 L -半乳糖途径 ( Sm irnoff - W heeler途径 )中 , L - 半乳糖脱氢酶 (L2
galactose dehydrogenase, GalDH) 直接在 C1位氧化 L -半乳糖形成维生素 C生成的直接底物 L - 半乳
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糖 - 1, 4 - 内酯 , 其表达量的变化直接影响维生素 C含量 , 是维生素 C生物合成的关键限速酶之一
(W heeler et al. , 1998; Sm irnoff & W heeler, 2000)。其编码基因已成为应用植物基因工程技术进行转
基因植物中维生素 C含量调控的重要靶点之一 ( Ishikawa et al. , 2007; Zhang et al. , 2007)。目前 , 已
从葡萄、水稻、大麦、烟草 (NCB IBLASTN 检索获知 )、拟南芥 ( Gatzek et al. , 2002)、菠菜 (M ieda et
al. , 2004)和苹果 (肖妮娜 等 , 2007) 等多种植物中克隆到编码 GalDH的完整基因或部分片段。
近年来 , 植物维生素 C生物合成与代谢过程逐步被人们所了解和重视 ( Keller et al. , 1999;
Sm irnoff & W heeler, 2000; Janik et al. , 2003) , 但大多数研究集中于烟草、拟南芥、水稻和马铃薯等
一年生模式植物 , 而多年生果树上的研究很少。阔叶猕猴桃 (A ctin id ia la tifolia Merr. ) 鲜果中维生素
C含量为 6171～21140 mg·g- 1 , 是猕猴桃属植物中维生素 C含量最高的种 , 具有很高的开发利用和
研究价值 (黄宏文 等 , 2000)。作者拟从阔叶猕猴桃果实中克隆 GalDH cDNA的完整编码框并进行生
物信息学分析 , 将其亚克隆至原核表达载体 pET232a ( + ) 中 , 在大肠杆菌 BL21中检测该蛋白的表
达与否及其活性 , 为进一步研究该酶在阔叶猕猴桃等植物体内蛋白水平的表达检测和揭示阔叶猕猴桃
果实高维生素 C含量的合成与积累机制奠定基础。
1　材料与方法
111　植物材料
阔叶猕猴桃 (A ctin id ia la tifolia Merr. ) 果实于 2008年 7月 15日采自西北农林科技大学园艺学院
果树种质资源圃 , 采后于液氮中速冻 , 置于 - 70 ℃超低温冰箱保存备用。
112　RNA操作与阔叶猕猴桃 Ga lD H cD NA克隆
果实总 RNA的提取采用 Chang等 ( 1993) 改良 CTAB 2L iCl法 ; cDNA 第一链合成参考 TaKaRa
PrimeScrip tTM reverse transcrip tase使用说明进行操作。根据已报道或登录的其他植物 GalDH cDNA序列
[美味猕猴桃 ‘海沃德 ’(AY176585) , 葡萄 ‘Shiraz’( EF554359) , 和苹果 ‘皇家嘎啦 ’ (AY264803)
等 ] 设计一对简并引物 , 其中上游引物 GalDHF为 : 5′2AA (A /C) CC (C /T) AAAC (A /T/C) ATGACAA
(C /G) C23′, 下游引物 GalDHR为 : 5′2ATTAGCAGCCACTTCACAAAG23′。以合成的 cDNA第一链为模
板进行 PCR扩增 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃变性 45 s, 5815 ℃退火 45 s, 72 ℃延伸 115 m in, 36个
循环 ; 72 ℃终延伸 10 m in。从 112%的琼脂糖凝胶中切胶回收扩增特异性片段 , 与 pMD192T vector相
连并转化 E1coli DH5α, 提取阳性克隆质粒且用 PCR扩增或双酶切鉴定后 , 由上海生工生物工程技术
有限公司测序。
113　阔叶猕猴桃 Ga lD H cD NA的生物信息学分析
根据所测得的核苷酸序列 , 利用 DNAStar软件中的 EditSeq程序分析其序列 , 由 ORF Finder ( ht2
tp: ∥ www1ncbi1nlm1nih1gov/gorf /gorf1htm l ) 分 析 开 放 阅 读 框 ; 利 用 BLAST 软 件 ( http: ∥
www1ncbi1nlm1nih1gov /BLAST) 分析核苷酸和氨基酸的同源性 ; 采用 ExPASy的 ProtParam Tool ( ht2
tp: ∥www1expasy1ch / tools/p rotparam1htm l) 分析编码氨基酸理化性质 ; 用 TMp red Server软件预测跨
膜结构 ; 通过 ExPASy Proteom ics Server ( http: ∥www1expasy1ch / ) 系统中的软件在线预测其功能性位
点、二级结构 ; 用 Signal P 310 Server ( http: ∥www1cbs1dtu1dk / services/Signal P) 进行蛋白质序列中
信号肽的预测分析 ; 用 ZIP Server ( http: ∥2zip1molgen1mpg1de / index1htm l) 软件进行亮氨酸拉链结
构的分析。用 ClustalX 210和 MEGA 310进行多序列比对和进化树构建 , 并进行进化树分析。
114　阔叶猕猴桃 G a lD H 基因原核表达载体的构建
根据 pMD2A lGa lDH的核苷酸序列和 pET232a ( + ) 载体上的多克隆位点设计一对引物并引入
B am HⅠ和 XhoⅠ酶切位点 , 其中上游引物为 GalDHPF: 5′2AAGGATCCATGACAACCCTAGACCTC23′,
下游引物为 GalDHPR: 5′2CGCCTCGA GTCAAATTTGTTGTATACC23′(下划线为内切酶识别位点 )。以
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　12期 尚增振等 : 阔叶猕猴桃果实 GalDH cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达 　
稀释质粒 pMD2A lGa lDH为模板进行 PCR, 扩增条件为 : 94 ℃预变性 5 m in; 94 ℃变性 30 s, 62 ℃退
火 30 s, 72 ℃延伸 1 m in, 37个循环 ; 72 ℃终延伸 10 m in。凝胶电泳后回收特异性扩增片段 , 与
pMD192T Simp le vector相连 , 由上海生工生物工程技术有限公司测序以鉴定插入的序列及其读码框准
确性。然后用 B am HⅠ和 XhoⅠ双酶切并回收相应片段 , 与经相同内切酶酶切的 pET232a ( + ) 空载
体进行定向连接 , 获得重组表达质粒 pET2A lGalDH , 用 PCR扩增或双酶切两种方法鉴定 , 以确保所构
建重组表达载体的正确性。
115　重组载体 pET2A lG a lD H 的诱导表达
将重组表达载体 pET2A lGa lDH和空载体 pET232a ( + ) 分别转化 E1coli BL21, 挑取阳性克隆 , 接
种于含氨苄青霉素 (Amp) 100μg·mL - 1的 LB液体培养基。37 ℃振荡培养过夜 , 再按 1 ∶200比例
接种于同样的培养基中 , 培养至 OD600为 016～110时 , 分别加入 0101、0105、0110、0150、1100
mmol·L - 1等不同浓度 IPTG, 诱导一定时间后取样、离心并收集菌株。蛋白上样前处理过程为 : 4
℃, 12 000 r·m in - 1离心 2 m in, 弃上清液 , 沉淀用菌液体积 10%的 1 ×SDS凝胶上样缓冲液重悬 ,
混匀后沸水浴煮沸 5 m in, 冰浴 2 m in, 最大转速离心 1 m in, 取 20μL上清液进行 SDS2PAGE电泳
( Sambrook & Russell, 2001) 分析其蛋白表达情况。为获得可溶性蛋白 , 分别于 15和 28 ℃下诱导 24
h后离心并收集菌株 , 弃上清液 , 加入菌液体积 20%的 Lysis buffer [ 50 mmol·L - 1 Tris2HCl ( pH
810)、2 mmol·L - 1 EDTA·Na2、1 mmol·L - 1 DTT、200 mmol·L - 1 NaCl、10%甘油和 015% Triton
X2100 ] 重悬菌体 , 再加溶菌酶 (终浓度为 1 mg·mL - 1 ) , 冰上静置 30 m in, 用超声破碎仪进行破
碎 , 然后离心 , 分别取上清液 (可溶性蛋白 ) 和沉淀进行 SDS2PAGE分析。
116　表达蛋白纯化与体外酶活性测定
在最佳的诱导表达条件下大量诱导表达目的蛋白 , 参考 Promega公司的 MagneH isTM Protein purifi2
cation system使用说明进行融合目的蛋白的纯化。2 mL菌液纯化洗脱所得上清液合并并加入其 215倍
体积预冷无水乙醇 , - 20 ℃沉淀过夜 , 离心并用洗脱液体积 10%的 1 ×SDS上样缓冲液重悬沉淀 ,
样品的上样前处理与检测同总蛋白。取部分菌体细胞于液氮中研磨 , 后转移至 50 mmol·L - 1 Tris2HCl
(pH 715, 含 20%甘油 , 1 mmol·L - 1 EDTA·Na2和 2 mmol·L - 1 DTT) , GalDH酶活性的测定参考
Gatzek等 (2002) 使用的方法进行。
2　结果与分析
211　阔叶猕猴桃 Ga lD H cD NA的克隆和鉴定
以提取的阔叶猕猴桃果实总 RNA为模板进行 RT2PCR扩增 , 获得了一条约为 110 kb的特异性条
带 , 与预期值相符 (图 1) , 回收该片段并克隆至 pMD192T vector中 , 获得重组质粒 pMD2A lGalDH ,
将鉴定正确的菌液进行序列测定。
图 1　pMD 2A lGa lDH 酶切和 PCR电泳鉴定
M: Tiangen DNA marker Ⅲ; 1, 2: A lGalDH RT - PCR扩增产物 ; 3, 4: B am H Ⅰ、KpnⅠ酶切鉴定 pMD2A lGalDH。
F ig. 1　 Iden tif ica tion of pMD 2A lGa lD H by enzyma tic d igestion and PCR am plif ica tion
M: Tiangen DNA marker Ⅲ; 1, 2: RT2PCR amp lified p roducts for A lGalDH;
3, 4: pMD2A lGalDH identification digested with B am H Ⅰ /KpnⅠ.
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212　A lG a lD H 的生物信息学分析
21211　核苷酸序列分析 　测序结果表明 , 该 cDNA长为 997 bp, 含有 960 bp的完整开放阅读框 , 5′
端有 12 bp的非翻译序列 , 3′端含有 25 bp的非编码序列 (图 2)。该基因与 GenBank中已登录的美味
猕猴桃 ‘海沃德 ’GalDH基因 (A ctin id ia deliciosa ‘Hayward’, AY176585) 核苷酸序列的同源性最
高 , 为 9718% , 与葡萄 (V itis vin ifera ‘Shiraz’, EF554359 )、菠菜 ( S pinacia oleracea, AB160990 )、
苹果 (M a lus dom estica‘Royal Gala’, AY264803)、拟南芥 (A rabidopsis tha liana, NM119525) 和水稻
(O ryza sa tiva, DQ456875) 等植物该基因的同源性均在 76%以上 , 因此本研究所克隆的为阔叶猕猴桃
GalDH基因 , 命名为 A lGalDH , GenBank登录号为 EU525846。
21212　理化性质分析　A lGalDH核苷酸序列可编码 319个氨基酸残基 , 带正电荷的氨基酸 (赖氨酸
Lys和精氨酸 A rg) 有 29个 , 带负电荷的氨基酸 (天冬氨酸 A sp和谷氨酸 Glu) 有 36个 , 分别占编码
总氨基酸的 9109%和 11128%。用 ExPASy的 ProtParam Tool软件预测该基因所编码的蛋白质分子量为
341351 kD , 理论等电点 (p I) 值为 5136, 分子式为 C1531 H2440 N402 O474 S9。 Prosite分析结果表明 , A l2
GalDH包含有 4个 N2糖基化位点 (单划线 )、5个蛋白激酶 C磷酸化位点 (双划线 )、9个酪蛋白激酶
Ⅱ磷酸化位点 (斜体 ) 和 5个 N -端十四 (烷 ) 酞化位点 (含边框 ) 等功能性位点 (图 2)。
图 2　阔叶猕猴桃 Ga lD H cD NA序列和推导的氨基酸序列
ATG为起始密码子 ; TGA 为终止密码子 ; 预测的蛋白质功能性位点用阴影标出且以不同的形式表示有差异的作用位点。
F ig. 2　Ga lD H cD NA of A ctin id ia la tifolia M err. and its deduced am ino ac id sequences
ATG indicates the start codon; TGA indicates the stop codon; Predicted functional sites are p resent in shade with different form s.
21213　氨基酸序列与进化树分析 　氨基酸序列比对结果 (图 3) 表明 , A lGalDH基因的氨基酸序列
(A. la tifolia , ACB11586) 与美味猕猴桃 ‘海沃德 ’的氨基酸序列 (A. deliciosa, AAO18639) 长度一
致且同源性最高 , 为 9410% , 与葡萄 (V. vin ifera ABQ41113)、苹果 (M. dom estic, AAP21783)、菠
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　12期 尚增振等 : 阔叶猕猴桃果实 GalDH cDNA克隆及其在大肠杆菌中的表达 　
菜 (S. oleracea , BAD32687)、拟南芥 (A. tha liana NP195093)、烟草 (N. langsdorff ii ×N. sanderael,
ABB17078)、水稻 (O. sa tiva , EEC69282) 和大麦 ( H. vu lgare, ABE41792) 等植物的同源性均为
70%以上 (7112% ～8513% )。在不同植物中同源性表现为属内同源性很高 , 属间相对较低的特点。
图 3　阔叶猕猴桃与相关物种的 Ga lD H氨基酸序列同源性进化分析
括号内为 GenBank登录号 , 数字显示为基于作图标准的进化树中每支的长度。
F ig. 3　Phylogenetic tree ana lysis of the deduced am ino ac id sequences hom olog of
A ctin idia la tifo lia M err. Ga lD H w ith rela ted other plan t spec ies
The GenBank accession numbers are indicated in brackets, the numbers showed the branch length.
21214　跨膜结构分析　用 TMp red Server软件预测 , 发现在 N末端从第 12～34和 203～221个氨基酸
处有两个从膜外向膜内的跨膜螺旋结构 , 总分分别为 620和 769, 而在 148到 168个氨基酸处有一个
从膜内向膜外的跨膜螺旋结构 , 总分为 1 140 (大于 500为有意义的跨膜区 ) (图 4)。
图 4　A lG a lDH 跨膜结构预测
潜在跨膜区用水平线标注 , o和 i分别代表所跨膜外侧和内侧。
F ig. 4　Pred iction of tran sm em brane reg ion A lG a lDH
Potential transmembrane regions were marked with horizontal line above the p rofile. o and
i rep resented outside and inside way of the membrane respectively.
21215　推导的蛋白质二级结构预测分析 　将所克隆的 A lGalDH cDNA所推导的氨基酸序列输入 HNN
secondary structure p rediction软件 , 分析结果见图 5。如图 5所示 , A lGalDH的二级结构 , 是由其分布
在整个蛋白内的α -螺旋结构、大量的无规则卷曲和少量的扩展链结构等组成 , 其中α - 螺旋结构有
117个 , 占 36168% , 而扩展链和无规则卷曲分别占 16161%和 46171%。
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图 5　阔叶猕猴桃 Ga lD H的蛋白二级结构预测
h, e, c分别表示α - 螺旋、扩展链和无规则卷曲氨基酸残基。
F ig. 5　Secondary structure pred iction of the Ga lD H prote in from A ctin idia la tifo lia M err.
h, e, c rep resents alpha helix, extended strand and random coil am ino acid residues respectively.
21216　其它预测结果　用 ExPASy中的 ScanProsite对 A lGalDH编码的氨基酸序列进行功能域预测 , 发
现 A lGalDH的 10～302氨基酸片段具有醛酮还原酶 (A ldo2keto reductases, AKR s) 的保守结构域。此
基因所编码的蛋白无信号肽且无亮氨酸拉链结构。
213　阔叶猕猴桃 G a lD H 基因原核表达载体的构建
以稀释重组质粒 pMD2A lGa lDH为模板 , 采用 GalDHPF和 GalDHPR为引物 PCR扩增获得到一条
约 110 kb的片段 , 与设计结果相符 (图 6)。PCR回收纯化该片段并克隆到 pMD192T Simp le vector中 ,
经测序鉴定以确保 A lGalDH基因编码区序列的正确性。经 B am HⅠ和 X hoⅠ双酶切回收后 , 定向连接
到与经相同内切酶酶切的 pET232a ( + ) 空载体上 , 获得原核表达质粒 pET2A lGa lDH。该重组载体在
原核表达强启动子 T7驱动下 , 可用于在大肠杆菌中高效表达含组氨酸 (H is) 标签的融合蛋白。
图 6　pET2A lGa lD H 双酶切和 PCR鉴定
1: pMD2A lGalDH PCR扩增产物 ; M: TaKaRa DL2000; 2: pET2A lGalDH B am HⅠ /X hoⅠ双酶切。
F ig. 6　 Iden tif ica tion of pET2A lG a lDH by double2enzyma tic d igestion and PCR am plif ica tion
1: PCR amp lified p roduct from pMD2A lGalDH; M: TaKaRa DL2000; 2: pET2A lGalDH digested with B am HⅠ /XhoⅠ.
214　A lG a lD H 基因的诱导表达与 SD S2PAGE分析
将重组表达载体 pET2A lGalDH转入 E1coli BL21后 , 选用不同浓度的 IPTG诱导其表达。SDS2PAGE
电泳结果发现能够表达一条约 5510 kD的特异融合蛋白 , 且在 011 mmol·L - 1的 IPTG浓度下 37 ℃诱导 5
h蛋白的表达量最高 , 而含空白对照 pET232a ( + ) 载体所表达的蛋白中没有此带 (图 7, A)。
215　A lG a lD H 重组表达蛋白的纯化与酶活性测定
重组表达载体 pET2A lGa lDH表达工程菌 E1coli BL21在 15 ℃下用 011 mmol·L - 1浓度的 IPTG诱导
其表达 24 h后收集菌体 , 参考 Promega公司的 MagneH isTM Protein purification system进行融合目的蛋白
的纯化和浓缩 , 经 SDS2PAGE电泳检测可见约 5510 kD的单一条带 (图 7, B )。为进一步验证其表达
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产物功能 , 分别测定转化 pET2A lGalDH和 pET232a ( + ) 的 E1coli BL21细胞中 GalDH酶活性 , 结果
发现转化 pET2A lGalDH的细胞产物能够特异性地表现出 120 pmol·m in - 1 ·mg- 1的酶活性 , 而转化
pET232a ( + ) 的对照组未检测到该酶活性。
图 7　 pET2A lGa lDH 表达产物的 SD S2PAGE分析与纯化检测
M: TaKaRa低分子蛋白分子标准 ; A, 2: 转化 pET232a ( + ) 经 IPTG诱导 5 h的总蛋白 ;
1, 3～7: 转化 pET2A lGalDH经 0、0101、0105、0110、0150、1100 mmol·L - 1
IPTG诱导 5 h的总蛋白 , 箭头所指 (泳道 5) 为最佳 IPTG浓度 ; B , 1、3分别为转化 pET2A lGalDH和
pET232a ( + ) 在 15 ℃经 0110 mmol·L - 1 IPTG诱导的总蛋白 , 2: 纯化的融合 Trx2A lGalDH目的蛋白即箭头所指。
F ig. 7　SD S2PAGE ana lysis and detection of pur if ied products of the expressed products from pET2A lGa lDH
M: TaKaRa low p rotein molecular weight standard; A, 2: Total p roteins of E1 coli BL21 transformed by pET232a ( + )
after induction at 5 h by IPTG; 1, 3 - 7: Total p roteins of E1 coli BL21 transformed by pET2A lGalDH after induction at 5 h
with 0、0101、0105、011、015、110 mmol·L - 1 IPTG respectively, the arrow ( lane 5) indicates the op timal concentration of IPTG;
B, 1, 2: Total p roteins of E1 coli BL21 transformed by pET2A lGalDH or pET232a ( + ) induced for 24h under 15 ℃ respectively,
3: Purified exp ressed target fusion p rotein of Trx2A lGalDH , which the arrow indicates.
3　讨论
维生素 C水平高低是衡量农作物产品品质的重要指标之一 (Davey et al. , 2000) , 同时对植物抗
氧化﹑生长发育调节与信号转导等方面具有重要的生理作用 ( Sanmartin et al. , 2003; Ishikawa & Shi2
geoka, 2008)。对高等植物维生素 C生物合成途径研究 (Conklin, 2001; Agius et al. , 2003; Lorence et
al. , 2004) 表明 , 维生素 C可能存在碳链倒位、邻酮醛糖、L -半乳糖、肌醇及糖醛酸转变等多种途
径共存 , 但主要以 L - 半乳糖途径 ( Sm irnoff—W heeler途径 ) 合成维生素 C (安华明 等 , 2004;
Wolucka & Montagu, 2007)。本研究中从高维生素 C含量的阔叶猕猴桃果实中克隆得到维生素 C合成
调控关键酶之一的 GalDH cDNA编码区全长 , 为进一步开展其他植物维生素 C合成与代谢调控基因工
程等相关研究奠定了基础。
GalDH已从豌豆幼苗中得到纯化 (W heeler et al. , 1998) , 该酶是一个可溶性酶 , 在豌豆线粒体
中没有检测到该酶活性。Gatzek等 (2002) 发现在超量表达 A tGa lDH基因的转基因烟草株系中 , 最
高的 GalDH活性比野生型增加了 315倍 , 但其叶片抗坏血酸含量并没有增加。转反义 A tGalDH基因
的拟南芥株系 GalDH活性只有野生型的 30% , 并且在强光照条件下叶片抗坏血酸含量降低 , 证实 L
-半乳糖的生成受光调控。M ieda等 (2004) 从菠菜叶片中纯化得到 GalDH, 并克隆了菠菜 GalDH全
长 cDNA, 在 E1coli中诱导表达其表达产物具有 GalDH活性 , 简单动力学特征分析表明 , GalDH没有
调节特性。Southern B lot结果显示该基因在菠菜基因组中只有一个拷贝 , 且其活性受维生素 C的反馈
抑制。
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本研究构建了 A lGalDH基因原核表达载体 pET2A lGa lDH , 经 011 mmol·L - 1 IPTG诱导 , 在 E1coli
BL21中成功地表达了含 H is标签的重组融合蛋白 , 为进一步通过免疫家兔制备该蛋白的多克隆抗体 ,
研究 GalDH在阔叶猕猴桃等植物体内蛋白水平的表达状况和调控机制与揭示阔叶猕猴桃果实高维生
素 C含量的合成与积累机制奠定了基础。
References
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