全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (6) : 885 - 890
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 01 - 19; 修回日期 : 2009 - 05 - 11
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30771760 )3 E2mail: xup insan@ sina1com
百合无症病毒 CP基因的克隆及其 RNA i载体的构
建
徐品三 13 , 尹雅蕾 1 , 李玉花 2
(1 大连理工大学环境与生命学院 , 辽宁大连 116024; 2 东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 150040)
摘 　要 : 以感染百合无症病毒 (LSV) 的百合叶片总 RNA为模板 , 利用反转录聚合酶链式反应 (RT2
PCR) 扩增出了 876 bp的 LSV CP基因 , 经 B last比对发现该片段与 GenBank上发表的 LSV CP基因序列高度
同源 , 同源率 98% , 由该序列推导出的氨基酸序列相似性达到 98%。应用 Gateway技术将扩增的片段通过
BP反应连接到入门载体 pDONR201, 并进行序列测定 , 再通过 LR反应将目的片段插入到 RNA i植物表达载
体 pH7GW IW G2 (Ⅱ) , 成功构建了适合农杆菌介导的百合转化的 RNA i载体。
关键词 : 百合 ; 无症病毒 ; CP基因 ; 克隆载体 ; RNA干扰 ; Gateway技术
中图分类号 : S 68212; Q 785　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 0620885206
C lon ing of L ily sym ptom less virus C P Gene and Con struction of Its RNA i
Vector
XU Pin2san13 , YIN Ya2lei1 , and L I Yu2hua2
(1 School of Environm enta l and B iological Science and Technology, D alian U niversity of Technology, D alian, L iaon ing 116024,
Ch ina; 2 College of L ife Sciences, N ortheast Forestry U niversity, Harbin 150040, Ch ina)
Abstract: A fragment of 876 bp of L ily sym ptom less virus (LSV ) CP gene cDNA sequence was amp lified
by reverse transcrip tion polymerase chain reaction ( RT2PCR ) from the total RNA infected lily leaves. The
B last result showed that the sequence p resented a very high match with the LSV CP genes in the GenBank and
its homology was 98%. The am ino acid sequence was 98% homologus. U sing Gateway technology, a entry
clone vector (pDONR201) was constructed through the way of BP cloning and a RNA interference (RNA i)
transformation vector (pH7GW IW G2) was constructed through the way of LR cloning. The RNA i vector was
obtained and could be transformed into lily by A grobacterium tum efaciens.
Key words: lily; L ily sym ptom less virus; CP gene; cloning vector; RNA interference; Gateway tech2
nology
百合无症病毒 (L ily sym ptom less virus, LSV ) 属于香石竹潜隐病毒属 (Carlavirus) , 是严重影响
百合生产的主要病毒之一 (Memelink, 1990; 明艳林 等 , 2005)。随着百合产业的发展 , 该病毒病的
发生日益严重 , 给百合种植业造成极大的经济损失 (A sjes, 2000)。
目前国内外百合脱毒一般采用茎尖培养、热处理以及抗病毒药剂处理等 (Nyland, 1969; 赵祥云
等 , 1993; Xu & N iim i, 1999) , 但这些方法治标不治本 , 脱毒种球在栽培过程中很容易再感染 , 难
以从根本上根治病毒 (徐品三 等 , 2003)。
在转基因抗病育种方面 , 将病毒外壳蛋白和复制酶基因导入植物可在一定程度上增强对病毒的抗
性 , Pham (1998) 将 LSV外壳蛋白基因转入龙牙百合 ‘白雪皇后 ’ ( Snow Queen) 的愈伤组织 , 诱
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导分化得到 LSV抗性植株。
RNA干扰 (RNA i) 介导的病毒抗性是近年发展起来的一种新的抗病毒基因工程策略 , 具有抗病
性强 , 抗性持久 , 生物安全性高等优点 ( van den Boogaart et al. , 2001) , 通过双链 RNA介导诱发的
高效特异性降解同源 mRNA的现象 (Bass, 2000; Sharp , 2001)。利用 RNA i技术创制抗病毒转基因植
物已取得了很好的效果 (W aterhouse et al. , 1998; W ang et al. , 2000; Zhu et al. , 2004) , 但仍未有利
用 RNA i技术创制抗 LSV百合转基因植物的报道。
作者通过克隆百合无症病毒外壳蛋白基因 , 应用 Gateway技术构建了用于农杆菌转化的 CP基因
RNA i植物表达载体 , 旨在通过 RNA i方法将病毒外壳蛋白基因反向重复序列导入百合 , 使其转录产生
RNA的双链发卡环结构 , 产生对侵入病毒的抗性 , 为抗 LSV百合转基因品种的培育奠定基础。
1　材料与方法
111　材料与试剂
感染 LSV的卷丹百合病叶 2007年取自大连。大肠杆菌 DH5α为大连理工大学植物基因工程实验
室保存。
克隆载体 pMD192T vector购于大连 TaKaRa公司。采用 Gateway技术构建的商业化目的载体
pH7GW IW G2 (Ⅱ) 由东北林业大学生命科学学院惠赠。RNA 提取试剂 TR Izol、RNA 反转录试剂、
DNA聚合酶以及引物等均为大连 TaKaRa公司产品。Gateway BP reaction试剂盒、Gateway LR reaction
试剂盒购于美国 Invitrogen公司。引物由大连 TaKaRa公司合成 , 编号及序列见表 1。
表 1　引物序列
Table 1　Sequence of pr im ers
编号 Number 序列 Sequence 作用 Action
LSV CP1 F 5′2ATGCAATCAAGACCAGCACA23′ 获得 LSV CP基因全长
R 5′2TCATCCATTATTTGCGTA23′ To get full2length LSV CP gene
LSV CP2 F 5′2AAAAAGCAGGCTGGCAGGCCCACACCCAGT23′ 扩增保守片段
R 5′2AGAAAGCTGGGTGGGCACCGCTCCATTCTTA23′ To amp lify conservative fragment
attB F 5′2 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT23′ 获得适合 Gateway技术 RNA i载体的目的片段
R 5′2GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT23′ To obtain fragment being suitable for the RNA i
vector of Gateway technology
35S F 5′2GACGCACAATCCCACTATCC23′ LR反应阳性克隆 PCR检测
R 5′2GCTCAACACATGAGCGAAAC23′ PCR identification for LR reaction
112　L SV C P基因的克隆
采用 TR Izol法提取感病百合叶片总 RNA , 溶解于经 DEPC处理过的灭菌超纯水中。根据已报道
的 LSV序列 ( GenBank登录号为 NC005138) 设计引物 LSV CP1。
在 20μL反应体系中加入 1μg总 RNA作模板 , 50 pmol LSV CP1 R为引物 , 在 AMV逆转录酶作
用下合成 cDNA 第 1链 , 其热循环程序为室温放置 10 m in, 42 ℃ 60 m in后冰上放置 2 m in, 反转录合
成 cDNA。
取 5μL cDNA产物 , 补加引物 LSV CP1后进行 PCR扩增。扩增条件为 : 94 ℃变性 30 s; 55 ℃复
性 45 s, 72 ℃延伸 1 m in, 30个循环 ; 72 ℃后延伸 10 m in。
PCR产物用 112%琼脂糖凝胶进行电泳 , 试剂盒回收目标条带并克隆到 pMD192T vector, 再对克
隆片段进行测序分析。
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　6期 徐品三等 : 百合无症病毒 CP基因的克隆及其 RNA i载体的构建 　
113　RNA i目标区段选择及引物设计
以 LSV CP mRNA序列 ( GenBank登录号为 FJ456352) 作 B last分析 , 比较与其它基因的同源性。
选择 470 bp之间的区域作为 RNA干涉区段 , 使用 p rimer 3程序在线设计引物 , 并在正向引物和反向
引物两端分别加上 attB1和 attB2位点序列 , 设计最终引物 LSV CP2。
114　利用 Ga teway技术构建 RNA i载体
BP反应 : 在 115 mL离心管中加入以下反应体系 (总体积 2010μL ) : attB2PCR p roduct (约 150
ng) 110μL, pDONRTM vector (150 ng) 110μL, 5 ×BP clonaseTM reaction buffer 410μL, BP clonaseTM
enzyme m ix 410μL, TE buffer pH 810 10μL。短暂离心后将混合体系 25 ℃水浴 12 h以上 , 加入 2μL
Proteinase K solution, 37 ℃温育 10 m in, 终止 BP反应。
取 210μL反应体系用热激法转化 DH5α感受态细胞。将全部转化细胞均匀涂布在含 50 mg·L - 1
卡那霉素的 LB固体培养基上。37 ℃培养 16 h后 , 挑取克隆用含有 50 mg·L - 1卡那霉素的 LB液体培
养基培养过夜 , 然后取 2μL菌液作 PCR扩增 , 将有扩增产物且片段大小正确的克隆进行测序。取测
序结果正确的阳性克隆菌液提取质粒作为入门载体克隆 , 紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测质粒
的浓度和纯度。
LR反应 : 在 115 mL离心管中加入以下反应体系 (总体积 20μL ) : Entry clone ( 100～300 ng)
1μL, pH7GW IW G2 (Ⅱ) (300 ng) 1μL, LR clonaseTM enzyme m ix 410μL, 5 ×LR clonaseTM reaction
buffer 410μL, TE buffer pH 810 10μL。混匀后短暂离心 , 将混合体系置 25 ℃水浴 12 h以上 , 加入 2
μL Proteinase K solution, 37 ℃温育 10 m in, 终止 LR反应。
取 210μL反应体系用热激法转化 DH5α感受态细胞。将全部转化细胞均匀涂布在含 50 mg·L - 1
壮观霉素的 LB固体培养基上。37 ℃培养 16 h后 , 挑取克隆用含 50 mg·L - 1壮观霉素的 LB液体培养
基培养过夜。
2　结果与分析
211　总 RNA的提取及 L SV C P基因的克隆与序列分析
取少量感病百合的叶片作为样品 , 采用 TR Izol法提取总 RNA (图 1)。
图 1　百合叶片 RNA提取
M: DL 2000 DNA marker; 1、2: 百合叶片提取的 RNA。
F ig. 1　Extracted RNA from lily leaves
M: DL 2000 DNA marker; 1, 2: RNA from lily leaves.
以反转录产物为模板 , 用特异引物 LSV CP1扩增出百合无症病毒 CP基因片段 (图 2) , 将此片段
克隆到 pMD192T载体上。测序结果表明基因长 876 bp, 编码 291个氨基酸序列。经 B last分析比对表
明本研究所克隆的 LSV CP基因片段与所登录的 LSV CP mRNA序列有 98%的同源性。
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图 2　琼脂糖电泳检测 RT2PCR扩增产物
M: DL 2000 DNA marker; 1、2: RT2PCR产物。
F ig. 2　The electrophoresis of RT2PCR product
M: DL 2000 DNA marker; 1, 2: RT2PCR p roduct.
212　目标区段基因的克隆
用所设计的引物 LSV CP2, 以百合叶片 cDNA为模板进行 PCR扩增 , 扩增产物经纯化后克隆到
pMD192T上 , PCR检测为阳性的克隆菌 (图 3)。测序鉴定结果与设计的目的序列完全一致 , 获得用
于 RNA i构建的目的序列。
图 3　RNA i目标区段的 PCR扩增
M: DL 2000 DNA marker; 1、2: PCR产物。
F ig. 3　The PCR am plif ica tion of target gene
M: DL 2000 DNA marker; 1, 2: PCR p roduct.
213　BP反应后阳性克隆 PCR检测
将 attB2PCR产物连接到入门载体后 , 挑取 5个克隆菌提取质粒后用 LSV CP2的一对引物 PCR扩
增。电泳检测结果表明 , 样品 4为假阳性 (图 4) , 其他为阳性克隆 , 大小合适 , 表明 RNA干扰区段
正确插入到入门载体中 , 得到正确的入门克隆。
图 4　BP反应后克隆 PCR扩增检测
M: DL 2000 DNA marker; 1～5: BP反应阳性克隆 ; 6: 对照。
F ig. 4　PCR iden tif ica tion for BP reaction
M: DL 2000 DNA marker; 1 - 5: Positive clone of BP reaction;
6: Negative control.
214　L R反应后阳性克隆 PCR检测
为检测 RNA干涉区段是否同时正确插入到目的载体的 2个位点 , 用 attB 2R和 attB 2F (图 5, A ) ,
35S2R和 35S2F (图 5, B) , attB2F和 35S2R (图 5, C) 引物扩增所挑取的克隆菌液 , 琼脂糖凝胶电
泳检测扩增产物。结果表明 , 所挑取的 3个克隆均能同时被引物扩增 (图 5) , 表明所得的克隆均为
阳性克隆。
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　6期 徐品三等 : 百合无症病毒 CP基因的克隆及其 RNA i载体的构建 　
图 5　L R反应后克隆 PCR扩增检测
M: DL 2000 DNA marker; 0: 对照 ; 1～3: LR反应阳性克隆 ; A: 用 attB2R和 attB2F为引物扩增挑取的克隆菌 ;
B: 用 35S2R和 35S2F为引物扩增挑取的克隆菌 ; C: 用 attB2F和 35S2R为引物扩增挑取的克隆菌。
F ig. 5　PCR iden tif ica tion for L R reaction
M: DL 2000 DNA marker; 0: Negative control; 1 - 3: Positive clone of LR reaction; A: PCR identification
with attB2R and attB2F; B: PCR identification with 35S2R and 35S2F;
C: PCR identification with attB2F and 35S2R.
3　讨论
RNA i技术在抗病毒研究中倍受关注 , 并取得了显著成绩。百合无症病毒病在我国的发生日益严
重 , 阻碍了我国百合种球国产化进程 , 探索一种高效根治百合病毒病的方法已成为燃眉之急。在本试
验中 , 作者设计利用 RNA i技术进行百合抗病毒基因工程的研究 , 首次构建了适合农杆菌介导的百合
转化的 LSV CP基因介导的 RNA i载体 , 对今后百合的抗病毒工程研究具有重大现实意义。
近年来 RNA i技术以其高效、特异及操作简便等特性已经成为基因功能研究中一项有力的工具。
但不同的转化系统、不同的应用形式也可能产生不同的效果。在设计、构建表达双链 RNA的重组质
粒时 , 质粒中包含的基因片段长度或两片段之间的间隔长度都可能影响 RNA的构象 , 从而影响 RNA i
的效果。
dsRNA 诱导的植物病毒抗性是依赖于 dsRNA剂量的 , 在构建植物 RNA干扰的表达载体时 , 应当
考虑到启动子的影响 , 启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要的影响。虽然 CaMV35S启动子是
应用较为广泛的启动子 , 但其在如水稻 , 小麦等禾本科植物中的表达强度比在双子叶植物中的低 , 这
样在构建准备转化禾本科植物的表达载体时 , 可用 Ubiquitin启动子等以获得较高的干扰程度。
利用 Gateway技术构建的载体是一种二元载体 , 因此能直接用于农杆菌介导的植物转化 , 从而为
利用 RNA干涉技术大规模、高通量的研究植物特异和未知基因功能打开方便之门。在具体的实验操
作中 , 经过 BP反应一般使 attB 2PCR产物的量多于供体载体 , 便于 RNA干涉区段插入到载体中。而
采用 LR反应一般目的载体量稍大。
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