全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2009, 36 (11) : 1651 - 1658
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2009 - 04 - 02; 修回日期 : 2009 - 08 - 31
基金项目 : 广西壮族自治区科技厅项目 (桂科能 0511200121C)3 E2mail: wangyihong27@1261com
两个叶绿体基因位点的 DNA条形码在桉属种间鉴
定中的应用
王以红 13 , 陶晓瑜 2 , 刘海龙 1 , 陈晓明 1 , 邱英雄 2
(1广西壮族自治区林业科学研究院 , 南宁 530001; 2浙江大学生命科学学院 , 植物系统与进化实验室 , 杭州 310029)
摘 　要 : 对桉属的 13个样本 (11个种、1个人工杂交种和 1个优良无性系 ) 的 trnH2psbA基因间隔区
的序列进行了比对和分析 , 13个桉属样本的 trnH2psbA长度范围为 538～576 bp, 序列排序的一致性长度为
590 bp。共检测出了 52个变异性状 , 其中 46个变异性状为碱基置换 , 6个性状为插入或缺失。同时 , 对桉
属 11个样本的 rpl22trnH基因间隔区 (大单拷贝与反向重复接头 ) 区域进行了序列分析 , 分析表明 , 11个
桉属样本的 rpl22trnH长度范围为 79～149 bp, 序列排序的一致性长度为 154 bp。共检测出了 19个变异性
状 , 其中 4个性状为插入或缺失 , 15个变异性状为碱基置换。尾叶桉优良无性系的 trnH2psbA和 rpl22trnH
序列与尾叶桉仅 1个位点的碱基置换 ; 与巨尾桉、巨桉进行比较 , 尾叶桉优良无性系的 trnH2psbA序列有
27 bp的插入 , 以上 4个近缘样本在 rpl22trnH区域的序列差异为 12个碱基置换。研究表明 , 通过两个
cpDNA基因位点序列不仅可以将桉属不同种进行区分 , 而且也可以区分尾叶桉优良无性系与尾叶桉。因此 ,
本研究涉及的两个叶绿体基因组位点序列在建立桉树植物种间鉴定的 DNA条形码方面具有潜在的应用价
值。
关键词 : 桉属 ; 叶绿体 DNA; rpl22trnH; trnH2psbA; 鉴定 ; DNA条形码
中图分类号 : S 687; Q 16　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2009) 1121651208
A Two2locus Chloropla st ( cp) D NA Barcode for Iden tif ica tion of D ifferen t
Spec ies in Euca lyptus
WANG Yi2hong13 , TAO Xiao2yu2 , L IU Hai2long1 , CHEN Xiao2m ing1 , and Q IU Ying2xiong2
(1 Guangxi A cadem y of Forestry, N ann ing 530001, Ch ina; 2 L aboratory of System atic and Evolutionary B otany and B iod iversity,
College of L ife Sciences, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, Ch ina)
Abstract: In this study, sequences of trnH2psbA spacer were analyzed for 13 Euca lyptus samp les. The
trnH2psbA spacer of 13 Euca lyptus samp les varied in length from 538 to 576 bp, and were aligned with a con2
sensus length of 590 bp. Fifty2two mutationswere scored in total. Six of these characterswere indels, and 46
characters were substitution. The chlorop last genome of Euca lyptus, like that of most angiosperm s, possesses
inverted repeats ( IR). The rpl22trnH spacer, located at one of two junctions between the IR s and the large
single copy (LSC) regions, was also sequenced from 11 Euca lyptus DNA samp les. Sequences of rpl22trnH
were 79 - 149 bp in size, and were aligned with a consensus length of 154 bp. N ineteen mutations were
scored in total. Four of these characters were indels. W hen compared with E. urophylla, only one mutation
was observed in the rpl22trnH spacer sequences of the elite clone ( GL4 ). However, compared with E.
grand is and E. grand is ×E. urophy lla , GL4 possessed a relatively large ( 27 bp ) insertion in trnH2psbA
intergenic spacer. Moreover, the sequences of rpl22trnH among these four related samp les show single2site
mutations ( 12 in total). Extensive variation was found in the rpl22trnH and trnH2psbA intergenic spacer
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( IGS) regions, suggesting that the sequences in this pair of loci have the potential to discrim inate among the
largest number of species or varieties of eucalyp t for DNA barcoding purposes.
Key words: Euca lyptus; chlorop last DNA; rpl22trnH; trnH2psbA; identification; DNA barcoding
通过短的同源 DNA序列鉴定植物或动物种类被称为 DNA条形码 (DNA barcoding) , 基于 DNA
barcoding技术进行鉴定和分类的研究已成为生物分类学研究中引人注目的新方向和研究热点 (Mar2
shall, 2005; Pennisi, 2007)。该技术在动物种类鉴定中已得到广泛的应用 , 所采用的标准片段是线
粒体 CO l基因中约 650 bp长的一段 (Hajibabaei et al. , 2007)。在植物中 , 由于线粒体基因组进化速
率较慢 , 因此 , 叶绿体基因组的 DNA序列 ( cpDNA ) 是建立植物 DNA条形码的最佳选择 ( Kress et
al. , 2005)。大多数被子植物 cpDNA有两个反向重复序列 ( inverted repeat sequence, IR ) , 两个 IR
之间为大单拷贝区 ( large single copy region, LSC) 和小单拷贝区 ( small single copy region, SSC)。在
LSC和 IR之间有两个连接区域 , Shinozaki等 (1986) 定义为 JLA和 JLB。其中 , JLA两侧的 2个基因间
隔区 ( Intergenic spacer) ( rpl22trnH、 trnH2psbA) 由于片段的缺失和插入而呈现较高的进化速率 , 在
检测种间单倍型变异方面具有潜在的应用价值 (Vaillancourt & Jackson, 2000)。近年来 , 尽管不同学
者提出了不同的片段组合方案 , 但在植物 DNA条形码的研究方面还未获得一致的标准片段 (Holling2
sworth, 2008)。植物 DNA条形码的建立不仅有利于快速、准确地识别和鉴定物种 (Lahaye et al. ,
2008) , 同时 , 在观赏林木品种的鉴定、中药材真伪识别等方面也将发挥重要的作用 (陈士林 等 ,
2007)。与其他 DNA分子鉴定技术 , 如 RFLP、RAPD、AFLP、AP2PCR、基因芯片技术等相比 , DNA
条形码技术的重复性与准确率更高 , 操作也更为简便。
桉树是包括桃金娘科 (Myrtaceae) 的杯果木属 (A ngophora )、桉树属 ( Euca lyptus) 和伞房属
(Corym bia) 的众多树种的统称 , 共有 808个种和 137个亚种或变种 , 原产地为澳大利亚和印度尼西
亚及附近的几个岛屿 ( Eldridge et al. , 1993)。桉树的一些种类适应性广 , 抗逆性强 , 繁殖容易 , 是
重要的生态和经济树种。迄今为止 , 我国引种的桉树已有 300多种 , 进行过育苗造林的有 200多种 ,
引种的范围遍及中国大部分地区。我国学者还通过杂交育种试验选育了巨尾桉 ( E. grand is ×E.
urophy lla)、尾赤桉 ( E. urophylla ×E. cam aldu lensis)、尾细桉 ( E. u rophy lla ×E. tereticorn is) 等
人工杂交种 (祁述雄 , 2003)。然而 , 由于桉树种类多 , 而且种间存在自然与人工杂交现象 , 种间及
品种间鉴定有时非常困难 (O ttewell et al. , 2005) , 因此 , 有必要建立桉树种类的 DNA条形码。近年
来 DNA序列分析方法已经被成功地应用于桉树的系统分类和进化的研究 (McKinnon et al. , 1999;
Steane et al. , 2002)。
本研究中通过对桉属不同种类、尾叶桉优良无性系的两个叶绿体 DNA位点 ( rpl22trnH 和 trnH2
psbA基因间隔区序列 ) 进行序列分析 , 旨在探讨利用选择的两个 cpDNA基因位点序列作为桉树植物
DAN条形码的可行性。
1　材料与方法
111　植物材料
试验所用的材料为 ‘广林 4号 ’ (广西壮族自治区林业科学研究院近年来培育的尾叶桉优良无性
系 )、巨尾桉、巨桉、尾叶桉及其近缘种 (表 1)。于 2006年 6月采集新鲜叶片 , 硅胶彻底干燥。
DNA序列分析在浙江大学生命科学学院植物系统进化与生物多样性实验室完成。
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　11期 王以红等 : 两个叶绿体基因位点的 DNA条形码在桉属种间鉴定中的应用 　
表 1　供试桉树样本及其在 rp l22trnH和 trnH2psbA区域检测的单倍型 ( haplotypes)
Table 1　The Euca lyptus u rophylla elite clone and rela ted spec ies in Euca lyptus and iden tif ied haplotypes
for the rp l22trnH and trnH2psbA in tergen ic spacer ( IGS) reg ion s
优良无性系和种类
Elite clones and species
样品采集地点或来源文献
Locality or references
trnH2psbA单倍型
Hap lotypes for trnH2psbA rpl22trnH单倍型Hap lotypes for rpl22trnH
广林 4号 GL4 ( Eucalyptus urophylla) 广西林科院 Guangxi Academy of Forestry H1 Hap1
尾叶桉 E. urophylla 广西林科院 Guangxi Academy of Forestry H1 Hap2
巨尾桉 JWA 广西林科院 Guangxi Academy of Forestry H2 Hap3
( Eucalyptus grandis ×E. urophylla)
巨桉 E. grandis 广西东门林场 Guangxi Dongmen Forest Farm H2 Hap4
赤桉 E. cam aldulensis 广西东门林场 Guangxi Dongmen Forest Farm H6 Hap5
窿缘桉 E. exserta 广西东门林场 Guangxi Dongmen Forest Farm H3 Hap6
圆角桉 E. teleticornis 广西东门林场 Guangxi Dongmen Forest Farm H4 Hap7
蓝桉 E. globulus 广西东门林场 Guangxi Dongmen Forest Farm Hap8
斜叶桉 E. obliqua Vaillancourt & Jackson (2000) Hap9
阿彻桉 E. archeri Vaillancourt & Jackson (2000) Hap10
山桉 E. dalrym pleana Vaillancourt & Jackson (2000) Hap11
蜜味桉 E. m elliodora Vaillancourt & Jackson (2000) H5
大花序桉 E. cloeziana Vaillancourt & Jackson (2000) H7
弹丸桉 E. pilu laris AF190384 H8
E. erythrocorys AF190382 H9
棱角桉 E. tetragona AF190381 H10
剥皮桉 E. deglupta AF190379 H11
112　D NA提取
称取 011 g干叶 , 用凝胶 Fastp rep (B io101, USA ) 粉碎 , CTAB法 (Doyle, 1991) 提取每个样
本总 DNA , 用 110%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 , DNA的纯度和浓度通过紫外吸收法测定。
113　叶绿体基因组的部分基因片段的序列扩增、纯化和测序
采用通用 引 物 : rpl2, 5′2GATAATTTGATTCTTCGTCGCC23′; trnH, 5′2CGGATGTAGCCAAGTG2
GATC23′( Goulding et al. , 1996) 扩增 rpl2和 trnH间的基因间隔区。采用通用引物 : psbA, 5′2GT2
TATGCATGAACGTAATGCTC23′; trnH, 5′2CGCGCATGGTGGATTCACAATCC23′( Sang et al. , 1997) 扩
增 psbA与 trnH间的基因间隔区。
聚合酶链式反应 ( PCR ) 在 GeneAmp PCR System 9700 PCR仪 ( Perkin2Elmer, USA ) 上进行。
反应体系为 50μL, 内含 5μL的 10 ×buffer ( TaKaRa) , dNTPs (012 mmol·L - 1 ) , MgCl2 (2 mmol·
L - 1 ) , 100μg·mL - 1 BSA (牛血清白蛋白 ) , Taq DNA聚合酶 (2U ) , 引物各为 715 pmol, 5μL 50%
的甘油 , 20 ng基因组 DNA。
PCR扩增条件 : 90 ℃预变性 5 m in, 然后进行 35个循环 : 94 ℃变性 1 m in, 46～55 ℃复性 1
m in, 72 ℃延伸 1 m in; 循环结束后 72 ℃延伸 4 m in。扩增产物经上海生工生物工程技术服务有限公
司 UN IQ210纯化试剂盒进行纯化后 , 送上海英骏生物技术有限公司的 AB I337型自动测序仪 ( PE Ap2
p lied B iosysterm, USA) 直接测序。为保证所测序列的准确性 , 分别对每一样品的序列进行正向、反
向测序。
114　数据的统计分析方法
本研究中所测得的 DNA序列采用 Sequencer ( ver. 410 Gene Code, Ann A rbor, M I) 和 Clustal X
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(115 b) ( Thomp son et al. , 1994) 进行排序 , MacClade 410 (Maddison &Maddison, 2000) 进行差异
位点的比对和分析。
2　结果与分析
211　桉树 cpD NA trnH2psbA非编码序列的分析结果
利用 Sang等 (1997) 的通用引物对整个基因组 DNA进行扩增 , 扩增得到了单一条带 , 片段大小
约为 500～600 bp之间 (图 1)。
序列分析结果表明 , 尾叶桉优良无性系广林 4号 ( GL4)、巨尾桉、巨桉、尾叶桉及其 10个近缘
种类的 trnH2psbA基因间隔区的序列长度为 538～576 bp, 经过排序后的一致性长度为 590 bp (图 2)。
共检测出了 52个变异性状 , 其中 6个为 Indel (插入或缺失 ) , 包括两个大片段的插入 (分别位
于 394～419 bp之间和 535～546 bp之间 ) 和 4个 1～5 bp的插入或缺失。46个变异性状为碱基置换
( substitution) , 其中 18个变异性状为信息位点 , 28个变异性状为 Singleton (图 2)。在 46个碱基置换
( substitution) 类型中 , 23个为转换 ( transition) , 23个为颠换 ( transversion)。
如表 1所示 , 13个样本共检测了 11种单倍型 (Hap lotype) , 其中 , GL4与尾叶桉共有一种单倍
型 (H1) , 巨尾桉和巨桉共有一种单倍型 (H2) , 其它种类的单倍型为特有单倍型 (H3～H11)。
GL4、尾叶桉、H4 (圆角桉 ) , H6 (赤桉 ) 有一个 27 bp ( TAGAAAAATGTTACTCATAATTAAGT)
的插入 (图 2) , 插入片段起始的 13 bp碱基序列 (ATAGAAAAATGTT) 与该插入片段末端后的起始
13 bp的碱基序列一致 (位置 : 422～434 bp 之间 )。因此 , 这个插入片段可能是临近片段经复制
( dup lication) 而产生。H9 ( E. ery throcorys) 与 H10 (棱角桉 E. tetragona) 在 536～547之间有一个
12 bp的插入。从图 2中可以看到 , GL4与巨尾桉以及巨桉相比 , 除了碱基置换以外 , 有一个 27 bp
的大片段的插入。
图 1　cpD NA引物 rpl22trnH和 trnH2psbA对供试桉树样本的扩增结果
1、9: 广林 4号 ; 2、10: 尾叶桉 ; 3、11: 巨尾桉 ; 4、12: 巨桉 ; 5、13: 赤桉 ;
6、14: 窿缘桉 ; 7、15: 圆角桉 ; 8: 蓝桉 ; M: Marker。
F ig. 1　PCR prof iles of the rela ted spec ies in Euca lyptus w ith two cpD NA pr im ers ( rp l22trnH and trnH2psbA)
1, 9: GL4; 2, 10: E. urophylla; 3, 11: E. grandis ×E. urophylla; 4, 12: E. grandis;
5, 13: E. cam aldulensis; 6, 14: E. exserta; 7, 15: E. teleticornis;
8: E. globulus. M: DNA marker.
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图 2　13个桉树样本的 trnH2psbA区域序列排序结果
上面数字代表核苷酸位置 , 连字符表示排序空位。
F ig. 2　A lignm en t of the sequences from the trnH2psbA in 13 Euca lyptus sam ples
Above numbers rep resent nucleotide position, and hyphens rep resent gap s inserted for alignment.
212　桉树无性系及其近缘种 cpD NA的 rp l22trnH序列的分析结果
利用 Goulding等 (1996) 的通用引物对整个基因组 DNA进行扩增 , 扩增得到了单一条带 , 片段
大小约为 100 bp (图 1)。序列分析结果表明 , 尾叶桉优良无性系广林 4号以及巨尾桉、巨桉、尾叶
桉及其 7个近缘种类的 rpl22trnH区域的长度范围为 79～149 bp, 经过排序后的一致性长度为 154 bp
(图 1)。共检测出了 19个变异性状 , 其中 18个变异性状发生在 rpl2和反向重复片段 ( IR) 的末端的
基因间隔区 , 有一个大片段的插入发生在 LSC与 IR之间的接头区域 (JLA : 140～145 bp之间 )。15个
变异性状为碱基置换 ( substitution) , 其中 4个变异性状为信息位点 , 11个变异性状为 Singleton。在
Indel (缺失或插入 ) 类型中 , 有 2个为大片段的插入 , 2个为大片段的缺失 , 2个单碱基的缺失。15
个碱基置换 ( substitution) 类型中 , 4个为转换 ( transition) , 11个为颠换 ( transversion)。阿彻桉
表 2　尾叶桉优良无性系及其近缘种类 rp l22trnH区域差异序列位点
Table 2　Chloropla st D NA sequence polym orph ism s detected in rpl22trnH reg ion s of 11 Euca lyptus sam ples
材料 Samp les 2 12 14 15 18 21 23 29 35 36 49 59 60 68 78 127 128 140
广林 4号 GL4 A C C G C G A T A T A A 1a A 0 T 1c 0
尾叶桉 E. urophylla . . . . . . . . . . . . . . . G . .
巨尾桉 JWA . . . . G . . . . G . T . . . . . .
巨桉 E. grandis T T T T G . . A . G . T . . . . . .
窿缘桉 E. exserta T T . . T C G . G . . . . . . . . .
圆角桉 E. teleticornis . . . . G . . . . . . . . . . . . .
赤桉 E. cam aldulensis . T . . . . . . . . . . . . . . . .
蓝桉 E. globulus . . . . . . . . . . . . . T . . . .
斜叶桉 E. obliqua . . . . . . . . . . C 0 0 0 . . 0 1d
阿彻桉 E. archeri . . . . . . . . . . . . . T 1b . . .
山桉 E. dalrym pleana . . . . . . . . . . . . . T . G . .
　　注 : 上 面 数 字 表 示 核 苷 酸 位 置 ; 以 下 为 插 入 片 段 , 1a , TTAATTAT; 1b , TTATTATTCAAAAATAGGAGTAATTAAT2
CAAAAATAGGAGTAATTAAT; 1c , GGAGTAATTAAT; 1d , CGAAT。
　 　 Note: Above numbers rep resent the position of nucleotide: 1a , TTAATTAT; 1b , TTATTATTCAAAAATAGGAGTAATTAAT2
CAAAAATAGGAGTAATTAAT; 1c , GGAGTAATTAAT; 1d , CGAAT.
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(E. archeri) 有一个最大片段的插入 (48 bp) (图 3, 表 2) , 在这个插入片段中 , 2个重复出现的 14 bp
( TAGGAGTAATTAAT) 的插入片段序列与 IR末端的 14 bp的序列一致。因此 , 这个插入片段可能是
IR末端序列经复制 ( dup lication) 而产生。斜叶桉 ( E. obliqua ) 在 IR区域出现 2个大片段的缺失。
蓝桉 ( E. g lobu lus) 在 LSC与 IR之间的接头区域 (JLA ) 有 5 bp碱基插入。其它种类之间的 DNA序
列差异为碱基置换。尾叶桉优良无性系与尾叶桉有一个位点差异 , 即 GL4在 127 bp处为 T, 而尾叶
桉则为 G。通过这个位点差异就可以把尾叶桉优良无性系与尾叶桉区分开来 (图 3, 表 2)。尾叶桉优
良无性系与巨尾桉以及巨桉之间分别有 3个和 8个位点的碱基置换。11个样本共检测了 11种单倍型
(Hap lotype) (表 2, 图 3)。
图 3　11个桉树样本的 rpl22trnH区域的序列排序结果
所有样本的 JLA接头区域、 IR区域以及 LSC区域被标出。
上面数字代表核苷酸位置 , 连字符表示排序空位。
F ig. 3　A lignm en t of the sequence from the rp l22trnH reg ion in 11 Euca lyptus sam ples
The positions of the JLA junction (JLA ) , the IR and the large single2copy (LSC) region were then extrapolated for all samp les.
Above numbers and hyphens rep resent gap s inserted for alignment and nucleotide position, respectively.
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3　讨论
叶绿体 DNA序列片段的非编码区 , 由于受环境选择压力小 , 进化速率快 , 具有相对较高的核苷
酸替换率 , 被用于探讨种间或种内的亲缘关系和鉴定的研究 ( Shaw et al. , 2007 )。有研究表明 ,
rpl22trnH、 trnH2psbA序列在烟草属 (N icotiana ) 不同种间也存在较高的变异性 ( Goulding et al. ,
1996)。尽管 , trnH2psbA被多数学者建议作为显花植物种间鉴别的 DNA条形码 (Chase et al. , 2005,
2007) , 但 rpl22trnH序列变异并没有被广泛研究。本研究 trnH2psbA的序列分析表明 , 尾叶桉优良无
性系与尾叶桉之间的 trnH2psbA序列完全一致 , 但与巨尾桉以及巨桉相比 , 除了碱基置换以外 , 有 27
bp大片段的插入。巨尾桉是巨桉 (母本 ) 和尾叶桉 (父本 ) 的人工杂交种 , 巨尾桉与巨桉的 trnH2
psbA序列一致 , 也反映了桉树叶绿体遗传与大多数被子植物一样为母系遗传。 rpl22trnH的测序分析
表明 , rpl22trnH序列在桉属种间变异较大 , 尾叶桉优良无性系与巨尾桉以及巨桉之间分别有 3个和 8
个位点的差异。尾叶桉优良无性系与尾叶桉之间有一个碱基置换。通过这个位点差异我们就可以把广
林 4号与尾叶桉区分开来。因此 , 本研究结果表明 , rpl22trnH基因间隔区在桉树种间的变异比 trnH2
psbA要大。Payn等 (2007) 利用 rpl22trnH序列分析方法对印度尼西亚及附近的几个岛屿尾叶桉谱系
地理进行了研究 , 与该研究检测出的叶绿体单倍型 ( hap lotype) 种类进行比较分析发现 , 本试验中检
测的尾叶桉优良无性系与尾叶桉的两种单倍型在印度尼西亚及其附近几个岛屿的不同自然群体中有分
布。由此可知 , 从尾叶桉不同分布点的自然群体中进行取样与引种将有利于加快良种选育。
综上所述 , 通过叶绿体 DNA的 JLA区域两侧的 rpl22trnH与 trnH2psbA基因间隔区序列的比较 , 可
以对本研究中所有的桉属种类 (包括 1个优良无性系 ) 进行区分 (表 1)。因此 , 桉树叶绿体 DNA的
rpl22trnH与 trnH2psbA基因间隔区可以作为桉树苗木市场种间鉴定的 DNA条形码。然而 , 由于桉树有
808个种和 137个亚种或变种 , 这两个基因间隔区序列组合是否在桉树所有的种类均存在差异 , 值得
进一步研究。同时 , 尽管不同的学者 ( Kress & Erickson, 2007; Fazekas et al. , 2008; Lahaye et al. ,
2008) 提出了不同叶绿体序列片段组合 ( rbcL + trnH2psbA , m atK + a tpF2a tpH + psbK2ps6J, m a tK +
a tpF2a tpH + trnH2psbA ) 作为整个陆地植物鉴定的 DNA条形码 , 但本研究的结果显示 , 叶绿体 DNA
的 JLA区域附近的 rpl22trnH在构建整个陆地植物 DNA条形码方面或许具有潜在的应用价值 , 值得进一
步研究。
References
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