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Identification of the Pathogen Causing Black SpotD isease of Little Spurflower

瑞典常春藤漆斑病病原鉴定



全 文 :园  艺  学  报  2009, 36 (4) : 553 - 558
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2008 - 11 - 28; 修回日期 : 2009 - 04 - 07
基金项目 : 国家科技基础条件平台建设项目 (2005DKA21201) ; ‘十一五’国家科技支撑计划项目 (2006BAD07B02) ; 科技部科
研院所社会公益研究专项项目 (2004D IB4J153)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: libj@mail1caas1net1cn)
瑞典常春藤漆斑病病原鉴定
贲海燕 1, 2 , 李宝聚 13 , 刘学敏 2 , 石延霞 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 东北农业大学农学院 , 哈尔滨 150030)
摘  要 : 通过病原菌的形态特征、培养性状和致病性测定的方法对引起瑞典常春藤漆斑病的病原菌进
行了分离鉴定 , 采用 PCR技术扩增病菌 rDNA2ITS基因 , 获得一长度为 523 bp的 DNA片段 , 序列测定结果
表明该片段序列与 GenBank已有的露湿漆斑菌序列的同源性达到了 99%。综合两种方法鉴定结果 , 露湿漆
斑菌是引起瑞典常春藤漆斑病的致病菌 , 露湿漆斑菌为该寄主上的真菌新病害。
关键词 : 瑞典常春藤 ; 瑞典常春藤漆斑病 ; 露湿漆斑菌 ; ITS2rDNA测序
中图分类号 : S 682136  文献标识码 : A  文章编号 : 05132353X (2009) 0420553206
Identif ica tion of the Pathogen Causing Black Spot D isease of L ittle Spurflower
BEN Hai2yan1, 2 , L IBao2ju13 , L IU Xue2m in2 , and SH I Yan2xia1
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, China; 2A gronom y College,
N ortheast A gricultural U niversity, Harbin 150030, Ch ina)
Abstract: A pathogenic fungus causing leaf spot of P lectran thus pa rvif lorus was isolated and character2
ized based on the morphological features, cultural characteristics and pathogenicity. By using polymerase
chain reaction ( PCR) technique to amp lify rDNA2ITS of the isolate, we obtained a 523 bp DNA fragment, the
result showed that rDNA2ITS sequences of the isolate and M yrothecium roridum shared 99% homology, which
was compared in National Center for B iotechnology Information (NCB I) GenBank. Synthesized two identifica2
tion results indicated that M yrothecium roridum was the pathogen causing black spot disease of Plectran thus
parvif lorus. This is the first report of M yrothecium leaf spot caused by M yrothecium roridum on Plectran thus
parvif lorus.
Key words: P lectran thus parvif lorus; little spurflower black spot disease; M yrothecium roridum Tode ex
Fr. ; ITS2rDNA sequencing
瑞典常春藤 ( P lectran thus parvif lorus, little spurflower) , 又名吸毒草、澳洲香茶菜 , 是唇形科香茶
菜属多年生草本植物。瑞典常春藤原产于澳大利亚 , 2006年由北京市农业技术推广站引进并开始在
京郊推广种植。2007年 9月 , 作者在北京市大兴区调查病害时发现 , 盆栽瑞典常春藤植株叶片出现
严重的病斑 , 发病叶率高达 40% , 甚至出现整叶枯萎、脱落的现象 , 给种植者带来很大经济损失。
目前国内外还未见此种瑞典常春藤病害的研究报道。为了建立该病害的有效防治方法并为病害流行预
测提供基础资料 , 笔者采集了大量的瑞典常春藤病样 , 分离培养病原物 , 通过观察病原菌形态特征和
培养性状 , 测定致病性 , 结合病原菌基因组 ITS区序列测定结果 , 对其致病菌进行鉴定 , 以明确此种
致病菌的种类。
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1 材料与方法
111 试材
病害标本采集 : 2007年 9月 14日 , 调查北京市大兴区蜂鸟花卉市场的温室花卉病害 , 发现 3号
温室内盆栽瑞典常春藤叶部出现褐色近圆形病斑 , 且发生严重。采集此种发病叶片 , 并对典型发病症
状进行描述和数码照相。
试验用的瑞典常春藤植株购自北京中蔬大森林花卉市场。
112 病原菌的分离及鉴定
常规切片镜检 : 挑取寄主典型病斑上的子实体 (即分生孢子盘 ) 进行切片镜检 , 若未产生分生
孢子 , 则将病部常规保湿培养数天 , 待子实体成熟后再进行切片镜检 , 观察描述病原菌的形态特征。
初分离 : 采用组织分离培养法。选取典型发病植株的叶片 , 切取 4 mm ×4 mm病健交界处的组
织 , 先后分别置入 75%酒精 3~5 s和 011%升汞 3 m in进行表面消毒 , 灭菌水漂洗 3次 , 接种于 PDA
培养基平板上 , 26 ℃黑暗条件下培养。3 d后用无菌钩挑取菌落边缘菌丝至 PDA平板上进行纯化 ,
观察菌落形态及颜色 , 5 d后将纯化的病原菌转置 PDA斜面上低温保存。
113 致病性测定
将分离纯化后的病原菌转至 PDA平板上 , 于 26 ℃黑暗条件下培养 7 d后 , 用无菌水洗出孢子配
制成孢子浓度为 1 ×106个 ·mL - 1的孢子悬浮液 , 采用喷雾法接种于 10株盆栽瑞典常春藤的叶片和茎
部 (每盆 1株 , 每株瑞典常春藤 15片叶左右 ) , 接种量以雾滴均匀覆盖叶片表面且不流淌为度。设
清水喷雾为空白对照。接种后放置于 26~28 ℃的塑料棚内保湿 (光照强时棚上覆盖黑纱 ) , 每天观
察并记录发病情况。
114 病原菌 rD NA2ITS序列测定
11411 菌株培养  
菌丝的培养收集 : 将试管斜面菌种转入 PDA培养基平板上 26 ℃活化 2~3 d; 将经高温湿热灭菌
的玻璃纸平铺到 PDA培养基平板上 , 再将活化后的病原菌用无菌接种钩转移到玻璃纸上面 , 每皿转
入 5 mm见方的小菌块 3~4块 , 共两板 ; 在 26 ℃, 黑暗条件下培养 1周左右 (菌丝生长充足 ) , 在
无菌操作工作台中用灭菌小铁勺刮下菌丝 , 并用锡箔纸包好。
菌丝抽提干燥 : 将锡箔纸包好的菌丝用真空抽提干燥仪进行干燥。每次干燥 4 h, 共干燥 2次 ,
然后于 - 20 ℃保存备用。
11412 菌株基因组 DNA提取  
将干燥后的菌丝放入 115 mL灭菌离心管中 , 加入液氮 , 用研磨棒研磨菌丝至粉末 , 加入 600μL
CTAB提取液 (CTAB 20 g·L - 1 , NaCl 114 mol·L - 1 , EDTA 20 mmol·L - 1 , Tris 100 mmol·L - 1 ) , 置
于 65 ℃水浴 30 m in, 每隔 10 m in震荡 1次 , 使其充分抽提 ; 抽提后于 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心 10
m in, 取上清液 , 加入等体积的水饱和酚 , 用摇床轻摇 10 m in后 , 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心 10 m in,
小心抽取上清液 , 加入等体积的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇 (25 ∶24 ∶1) , 轻摇 10 m in, 12 000 r·m in - 1、4 ℃
离心 10 m in后 , 小心抽取上清液 , 加入等体积的氯仿 ∶异戊醇 (24 ∶1) , 轻摇 10 m in, 12 000 r·
m in - 1、4 ℃离心 10 m in后 , 取上清液 , 加入等体积或 2 /3体积的预冷异戊醇 , 产生白色的絮状沉淀 ,
轻摇 , 12 000 r·m in - 1、4 ℃离心 10 m in后 , 弃上清液 , 用 75%的酒精冲洗沉淀 2~3次 , 风干后溶
解于 50μL 1 ×TE中 , 保存于 - 20 ℃备用。
11413  ITS区段 PCR扩增  
用真菌生物核糖体 DNA通用引物 ITS1和 ITS4进行 PCR扩增 , 引物为 ITS1 ( 5′2TCCGTAGGT2
GAACCTGCGC23′) , ITS4 (5′2TCCTCCGCTTATTGATATGC23′) , 由上海生工生物工程服务有限公司合
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成。
反应体系为 50μL, 其中含模板 DNA 1μL, 10 mmol·L - 1 dNTP 6μL, 10 mmol·L - 1引物 Ⅰ和引
物 Ⅳ各 1μL, 10 ×Buffer 5μL, 215 U·μL - 1 Taq DNA聚合酶 115μL, 用 ddH2 O补足 50μL, 轻摇使
其充分混匀。体系中不加菌株 DNA提取物 , 用 ddH2 O补足 50μL的为阴性对照。
PCR扩增程序为 : 94 ℃预变性 4 m in; 94 ℃变性 1 m in, 56 ℃退火 1 m in, 72 ℃延伸 1 m in, 35
个循环 ; 72 ℃终延伸 10 m in, 扩增产物于 4 ℃保藏。
取 PCR扩增产物 2μL在 1 ×TAE缓冲液中用 1%琼脂糖凝胶电泳 20 m in, 经 EB染色后置于紫外
照射仪上观察结果并照相。
将回收的 DNA样品送到中国农业科学院作物研究所测序中心进行测序。所得序列提交到 National
Center for B iotechnology Information (NCB I) 核酸数据库 , 通过 B last程序 , 将 rDNA2ITS序列与 Gen2
Bank中的核酸序列进行对照 , 确定病原菌种的分类地位。
2 结果与分析
211 瑞典常春藤漆斑病症状
观察发现病原菌主要侵染危害叶片 , 初期叶面及叶背均出现近圆形或不规则的水浸状小斑点 , 病
斑两面均稍有凹陷 (图 1, A)。
随着小斑点的逐渐扩展 , 病斑颜色加深 ; 湿度较大时 , 病斑呈水浸状。发病的典型症状是近圆形
病斑 , 直径 1~6 mm, 边缘颜色较深 , 中央灰白色至褐色 , 病健交界明显 , 病斑有明显凹陷 (图 1,
B)。
发病后期 , 圆形病斑相互连接 , 整片叶子变黑、皱缩 , 叶柄萎蔫 , 湿度大时病斑上长有白色的小
颗粒 (图 1, C) , 为病原菌的分生孢子盘 , 整片叶子极易从叶柄处脱落 (图 1, D)。
图 1 露湿漆斑菌的危害症状、特征性状及致病性测定结果
A. 初期发病症状 ; B. 典型症状———小圆斑 ; C. 后期病斑上长有白色小颗粒即分生孢子盘 ; D. 发病后期病叶萎蔫 , 易脱落 ;
E. 分生孢子梗 ; F. 分生孢子 ; G. 培养性状 ; H. 致病性测定结果 , a: 接种发病植株 (叶片萎蔫、脱落 ) ; b: 对照 , 未发病。
F ig. 1 The damage sym ptom s, tra it character and determ ined results of M yrothecium roridum Tode ex Fr.
A. Initial symp tom; B. Typ ical symp tom with small round spot; C. Leaf lesions with white acervuli in late stage;
D. D iseased leaves wilting and leaves falling off in late stage; E. Conidiophores; F. Conidium; G. Culture character;
H. Determ ined results of the pathogen, a: Symp tom of diseased leaves after inoculating; b: Control, no disease.
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212 病原菌的形态特征及培养性状
分生孢子座浅杯状 , 座状 , 直径 011~115 mm, 无刚毛。分生孢子梗单生或丛生 , 顶端帚状分
枝 , 轮生 3~7个产孢瓶梗 (图 1, E)。产孢细胞无色 , 细长 , 棍棒状 , 顶端稍膨大 , 孔口小 , 无明
显围领 , 11~16μm ×115~210μm。分生孢子杆状 , 长椭圆形 , 两端顿圆 , 但基部略呈平截 , 光滑 ,
无色 , 成堆时呈墨绿色或黑色 , 埋藏于粘液中 , 大小为 419~715μm ×113~210μm, 含 2~3个油球
(图 1, F)。
在 PDA上 , 25 ℃黑暗条件下培养。菌丝初为白色 , 绒毛状 , 菌落背面淡黄色 , 菌落以圆形向四
周扩展 , 培养 5 d左右 , 菌落上长有分生孢子座 , 常被大量的墨绿色的胶黏分生孢子团覆盖 (图 1,
G) , 菌落背面颜色加深变为蔷薇褐色。
根据病原菌的形态特征及培养性状 , 参阅专著 (张忠义 等 , 1986; 陆家云 , 2001) 及吴文平
(1991) 对漆斑菌属 4个种的研究 , 鉴定该致病菌为露湿漆斑菌 (M yrothecium roridum Tode ex Fr. )。
213 致病性测定结果
将露湿漆斑菌孢子悬浮液喷雾接种于盆栽瑞典常春藤叶片和茎上 , 接种后 3 d开始发病 , 初发病
率为 60%。5 d时出现典型症状 , 与温室内自然发病症状一致。在高温高湿时形成不规则的黑色大
斑 , 病斑上有近圆形的白色小颗粒 , 即分生孢子盘 , 条件适宜时分生孢子盘中会释放出大量的墨绿色
的胶黏孢子团 , 即露湿漆斑菌的分生孢子。接种后 7 d发病已经很严重 , 发病率达 90%以上 , 叶片极
易脱落 , 脱叶率 40%左右 (图 1, H, a) ; 茎部没有发病。对照植株生长良好 , 未见发病 (图 1, H,
b)。试验结果表明 , 病菌在植株叶片内潜育期较短 , 发病迅速。
分离培养接种发病植株的病原菌 , 与接种病原菌形态一致 , 证明露湿漆斑菌是引致瑞典常春藤发
病的致病菌。
214 病原菌分子鉴定结果
扩增病菌 ITS2rDNA基因 , 获得一长度为 523 bp的 DNA片段 (图 2)。序列测定结果表明 , 供试
菌株基因组 ITS2rDNA序列与 NCB I库内的露湿漆斑菌 ( GenBank登录号为 EF15100211) 同源性达到
了 99% , 据此确认致病菌为露湿漆斑菌。该菌为半知菌亚门 (Deuteromycotina) , 丝孢纲 (Hyphomy2
cetes) , 瘤座孢目 ( Tuberculariales) , 瘤座孢科 ( Tuberculariaceae) , 漆斑菌属 (M yrothecium Tode ex
L ink)。
图 2 PCR扩增产物检测结果
1: 分离得到的病原菌 ; CK: 阴性对照。
F ig. 2 D etection prof ile of D NA fragm en t after PCR
1: Isolated fungus; CK: Negative control.
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3 讨论
传统真菌系统分类是以形态学特征为主要依据 , 尤其是子实体的形态和结构被用作分类鉴定的典
型性状。按照这一方法并遵循柯赫氏法则 , 本试验中将分离培养、回接 , 得到的病原菌通过显微镜观
察 , 参阅张忠义等 (1986)、Daughtrey (1995)、陆家云 (2001) 和吴文平 (1991) 的相关文献 , 比
对菌体特征 , 初步鉴定瑞典常春藤叶斑病的致病菌为露湿漆斑菌。
以形态结构为基础的分类系统在一定程度上受人为因素和外界环境的影响 , 不能充分反映物种的
进化和种群间的亲缘关系 ; 有时欲获得其有性或无性器官需较长时间 , 有些种类则不易甚至不能形成
繁殖结构 , 这给分类鉴定带来诸多不便 (刘伟成 , 1995)。要克服这些不足 , 就必须从更深刻的层次
上去分析和研究 , 以找到更真实可靠的证据。因此 , 一些分子生物学方法已发展成为用于鉴定许多真
菌性病害的重要手段 (Cano et al. , 2004; 杨腊英 等 , 2006; 付娟妮 等 , 2007)。 rDNA2ITS是介于
18S rDNA、518S rDNA和 28S rDNA之间的区域 , 已有研究表明 ITS在真菌的种间存在着丰富的变异 ,
而在种内不同菌株间却高度保守 , 可以为真菌的系统发育和分类鉴定提供丰富的遗传信息 (Culebras
et al. , 2000; 陈剑山和郑服丛 , 2007)。
本研究中采用传统真菌形态学鉴定和 rDNA2ITS序列分析相结合的方法 , 对引致瑞典常春藤漆斑
病的病原菌进行了鉴定 , 两种方法鉴定结果相互印证 , 更具说服力。
露湿漆斑菌 (M. roridum Tode ex Fr. ) 寄主范围广泛 , 能侵染危害多种经济作物 ( Raut &
Moghe, 1980; 堵鹤鸣和浦冠勤 , 1988; 田立道和李雪明 , 1993)。露湿漆斑菌对花卉作物危害的相
关报道和记载也屡见不鲜 , Strider (1983) 记录了 8种寄主植物感染此病原菌 , Chase ( 1987) 记载
了 23个属的观叶寄主植物能够被其侵染危害 , 其中有 8个属的寄主植物发病严重。Mangandi等
(2007) 发现了由露湿漆斑菌引起的鼠尾草叶斑病 , 此种病害在美国是首次报道。Daughtrey ( 1995)
描述了露湿漆斑菌在不同的寄主上所表现的症状极为相似 , 并且记录了此种病原真菌分生孢子大小
(415~1018μm ×113~217μm, 平均大小为 712μm ×118μm ) , 本试验中从瑞典常春藤上分离到的
致病菌与其描述相一致。目前国内外还没有关于瑞典常春藤病害的研究报道 , 该属植物 (香茶菜属 )
的病害记录也仅有 3种 (Hansford, 1961; Cybertrufflepis, 2008) , 因此露湿漆斑菌为该寄主新的致病真
菌。
瑞典常春藤漆斑病在北京大兴区、山东省青州市等地发生严重 , 给种植者造成严重的损失。我们
在病菌接种试验中发现 , 在温湿度适宜的条件下 , 露湿漆斑菌侵入迅速 , 危害严重 , 发病率在 90%
以上 , 脱叶率 40%左右。
瑞典常春藤为北京市新引进花卉品种 , 不适宜的栽培管理方法是造成漆斑病发生危害严重的重要
原因 , 本病原鉴定结果为制定合理的栽培管理方法以及瑞典常春藤漆斑病的防治措施提供了重要基础
资料 , 也为其它病害病原真菌的鉴定提供了有益的参考。
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