全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (3) : 664～666
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 06 - 22; 修回日期 : 2005 - 08 - 303 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: m liu@ genetics1ac1cn)
农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立
王爱菊 1 　张凤美 1 　鹿金颖 1 　赵祥云 2 　贾　旭 1 　刘　敏 13
(1 中国科学院遗传与发育生物学研究所生物技术重点实验室 , 中国科学院研究生院 , 北京 100101; 2 北京农学院园林
系 , 北京 102206)
摘 　要 : 通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法 , 建立了凝望星空百合 (L ilium ‘Star Gazer’) 愈伤组织
和西伯利亚百合 (L ilium ‘Siberia’) 叶片的遗传转化体系。试验结果表明 : 以愈伤组织和叶片为受体 , 均
能取得较理想的转化效果 ; 根癌农杆菌 OD600介于 015～110时 , 能获得较高的转化率 ; 40 mg·L - 1的潮霉
素对愈伤组织和叶片有很好的筛选效果 ; 在共培养培养基中 , 去除 NH4 NO3对提高百合转化效率有极显著
的效果。对转基因百合进行 PCR检测 , 结果表明 gus基因已整合到百合基因组中。
关键词 : 百合 ; 根癌农杆菌 ; 遗传转化 ; PCR
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0320664203
Establishm en t of A grobac te rium 2m ed ia ted Tran sforma tion System of L ily
W ang A iju1 , Zhang Fengmei1 , Lu J inying1 , Zhao Xiangyun2 , J ia Xu1 , and L iu M in13
( 1 Key Laboratory of P lant B iotechnology, Institu te of Genetics and D evelopm ental B iology, Chinese A cadem y of Sciences, Graduate
U niversity of Chinese A cadem y of Sciences, B eijing 100101, Ch ina; 2D epartm en t of Gardens, B eijing A gricultural College, B eijing
102206, Ch ina)
Abstract: W e established genetic transformation system of lily callus (L ilium‘Star Gazer’) and leaves
(L ilium‘Siberia’) mediated by A grobacterium tum efaciens. Experimental result indicates that we could get
efficient transformation with both callus and leaves as accep tor. W e gained high transformation rate when the
OD600 of A grobacterium was between 015 - 110. There were better screening to callus and leaveswhen the con2
centration of Hygromycin was 40 mg·L - 1. Removing NH4NO3 from major element could remarkably enhance
transformation rate. Results of PCR p roved that the gus gene had integrated into lily genome.
Key words: L ilium ; A g robacterium tum efaciens; Genetic transformation; PCR
百合是单子叶多年生宿根花卉 , 其花朵硕大 , 色彩丰富 , 是重要的切花植物。百合的再生能力很
强 , 再生体系也比较成熟〔1〕, 但迄今为止国内尚无关于百合的遗传转化体系的报道 , 国外研究也较
少〔2, 3〕。我们利用东方百合品种 , 对影响东方百合遗传转化的几个因素进行了研究 , 建立了较高的农
杆菌遗传转化体系 , 为东方百合的基因工程育种奠定了基础。
1　目的、材料与方法
试材为东方百合系列品种 ‘西伯利亚 ’ ( Siberia) 和 ‘凝望星空 ’ ( Star Gaze)。所用基本培养基
为 MS培养基。培养基配方如下 : C021: MS + 62BA 110 mg·L - 1 + NAA 012～015 mg·L - 1 +蔗糖 30
g·L - 1 +肌醇 011 g·L - 1 +琼脂 5 g·L - 1 , pH 518; C022: MS + 62BA 210 mg·L - 1 + KT 210 mg·L - 1
+NAA 011 mg·L - 1 + 2, 42D 011 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +肌醇 011 g·L - 1 +琼脂 5 g·L - 1 , pH
518; C1: MS +NAA 012 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +肌醇 011 g·L - 1 +琼脂 5 g·L - 1 , pH 518; C2:
MS + Picloram 3 mg·L - 1 +蔗糖 20 g·L - 1 +麦芽糖 10 g·L - 1 +肌醇 011 g·L - 1 +琼脂 5 g·L - 1 , pH
518; CL3: MS + 62BA 015 mg·L - 1 + ZT 011 mg·L - 1 +NAA 110 mg·L - 1 +蔗糖 30 g·L - 1 +肌醇 011
　3期 王爱菊等 : 农杆菌介导的百合遗传转化体系的建立 　
g·L - 1 +琼脂 5 g·L - 1 , pH 518; C4: C2液体 (大量元素中去除 NH4 NO3 ) pH 512～514, 使用前加
乙酰丁香酮 (A s)。
百合球茎表面消毒后 , 接种到 C022培养基上 , 30 d左右得到组培苗 , 组培苗继代培养基为 C021
培养基。将组培苗接种到 C1培养基于黑暗条件下培养得到白化苗和叶片 , 之后取白化苗的叶片切成
段接种到脱分化培养基 C2培养基上 24℃黑暗培养得到愈伤组织。
转化载体 : 用农杆菌菌株为 LBA4404, 双元载体 pCAMB IA1301进行转化 , 通过检测报告基因
gus的表达来检测转化效率。载体质粒图谱为 :
图 1　双元载体 pCAM B IA1301中的 T2D NA区域
F ig. 1　T2D NA reg ion of the tran sforma tion vector pCAM B I1301
农杆菌介导的转化 : 收集培养好的农杆菌菌体用共培养介质 (C4 + A s) 重新悬浮至 OD600 015～
110左右 , 将愈伤组织或叶片置于悬浮液中浸染 30 m in, 用灭菌滤纸吸干表面液体 , 置共培养培养基
(C4 + A s) 中 24℃黑暗培养 3～4 d。
将转化的愈伤 (或叶片 ) 取出 , 置于筛选培养基中 (C2 + 500 mg·L - 1 Ce + 40 mg·L - 1 hyp, 叶
片用 CL3代替 C2) , 24℃暗培养 3周 , 之后再继代筛选 3周。然后将正常生长的愈伤或叶片 (阳性候
选组织 ) 移入分化培养基 (C022 + 250 mg·L - 1 Ce + 40 mg·L - 1 hyp) 中生芽 , 获得抗性苗。
转化共培养后对转化受体进行 gus染色 , 检测转化的瞬时表达率 , 可初步判断农杆菌对受体组织
的浸染效率。取转基因百合植株叶片进行 gus染色 , 检测 gus基因在转基因植株中的表达 , 取未转化
的同步材料为阴性对照。
用 SDS法提取转基因百合植株和未转化植株的 DNA。检测 hyp基因的引物序列为 H1F: 5’2
GACGGTGTCGTCCATCACAGTTT23’和 H1R: 5’2ACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAA23’; 检测 gus基
因的引物序列为 35SF: 5’2GGGATGACGCACAATCCCACTATC23’和 gus2NRC: 5’2ACGCGTGGTTA2
CAGTCTTGC23’, 扩增片段范围如图 1所示。
2　结果与分析
211　愈伤组织诱导和叶片分化
通过球茎在 C022培养基上得组培苗 , 将其转移到 C1培养基上 , 暗培养得白化苗 (同时达到扩
繁的目的 ) , 再将白化苗的叶片切成段 , 在 C2培养基上诱导得到大量的分化能力强的愈伤组织。
生长素 Picloram (4 -氨基 - 3, 5, 6 -三氯吡啶 - 2 -羧酸 ) 在作物组培方面应用不多〔4〕, 但在百
合愈伤组织诱导中引入 Picloram对诱导愈伤组织有很好的效果。在诱导培养基中加入 3 mg·L - 1 Piclo2
ram, 将 30 g·L - 1蔗糖改为 20 g·L - 1蔗糖和 10 g·L - 1麦芽糖 , 可以得到很好的愈伤组织。
百合叶片可以直接分化得苗〔1〕, 因此可以用叶片作转化受体进行转化。但是不同的百合品种间
叶片分化效率差异较大。在 CL3培养基上 , 西伯利亚百合叶片生长势比较强 , 分化效率也较高 , 故
选用西伯利亚百合叶片进行转化。
212　潮霉素对百合愈伤组织和叶片的筛选压的确定
试验结果显示 , 40 mg·L - 1的潮霉素对百合愈伤组织和叶片有很好的筛选效果 , 30 mg·L - 1对百
合的幼苗即有很好的筛选效果 , 证明潮霉素在百合的遗传转化中是很好的筛选剂。
213　NH4 NO3对转化效率的影响
在 MS基本培养基中 , 大量元素的 NH4 NO3的浓度为 2016 mmol·L - 1。农杆菌转化百合愈伤组织
和叶片时 , 用 MS基本液体培养基进行共培养 , 培养 7 d只有很少的农杆菌生长 , 转化效率为零 ; 而
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
在共培养液体培养基的大量元素中去除了 NH4 NO3后进行共培养 , 培养 3 d农杆菌即有大量生长 , 瞬
时转化效率可达 50%。农杆菌的生长和对受体的附着是农杆菌转化的前提 , NH4 NO3对转化效率的显
著的影响可能是因为在百合转化中 , 较高的氨离子浓度会显著抑制农杆菌的生长。这与 Hoshi等的结
果〔5〕也是一致的。
214　受体材料对转化效率的影响
分别以愈伤和叶片为受体材料进行转化 , 比较转化效率的差别。结果发现愈伤组织的转化效率高
于叶片。叶片的转化效率与百合品种有密切关系 , 西伯利亚叶片转化效率较高 , 而凝望星空的则很
低 , 可能与西伯利亚的叶片生长势比较强 , 由叶片生成愈伤组织并进一步分化成苗的效率较高有关。
215　菌液浓度对转化效率的影响
改变转化时菌液浓度 , 测得 OD600分别为 012、014、016、018、110、112, 转化后对转化受体进
行 gus染色 , 结果表明 : 随着 OD600的增加 , 瞬时表达率呈先升后降的趋势 , 当 OD600为 018时 , 叶片
和愈伤组织的瞬时表达率最高 , 均达到 50%。
216　转基因百合 D NA提取和 PCR检测
经农杆菌转化筛选后 , 抗性愈伤组织或叶片进行分化得到转基因植株。试验中共得到 12个潮霉
素抗性转基因株系 , 我们对其中的 5个株系 (凝望星空 3个株系 , 编号为 T21～T23, 西伯利亚两个株
系 , 编号为 T24和 T25) 做进一步检测。
用 SDS法提取转基因百合植株的 DNA, 稀释后进行 PCR反应 , 其中对潮霉素基因检测用其特异
引物 H1F和 H1R, 扩增出约 500 bp的片段 , 表明潮霉素基因已整合到转基因百合基因组中 ; 同时 ,
我们用 35S启动子的引物和 gus基因的引物相结合进行扩增 , 得到约 900 bp的片段 , 由于 35S启动子
是病毒的启动子 , 在植物中没有同源序列 , PCR结果证实 gus基因整合到转基因百合基因组中。
图 2　转基因百合潮霉素基因 (左 ) 和 gus基因 (右 ) 的 PCR检测
M: DL2000; CK1: 水 ; CK2: 非转基因百合 ; CK + : 质粒 pCAMB IA1301; T21～T25: 5个转基因百合株系。
F ig. 2　PCR of tran sgen ic lily w ith hygrom yc in gene ( left) and gus gene ( r ight)
M. DL2000; CK1. H2O; CK2. untransgenic lily; CK + . p lasm id pCAMB IA1301; T21 - T25. five lines of transgenic lily.
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