全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1485—1490
Acta Horticulturae Sinica
ERF转录因子新成员JERF3提高百合的耐盐性
杨宇红 ，尹丽蓉 ，葛 红 ，黄荣峰 ，肖启明 ，谢丙炎
(’中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081； 湖南农业大学
生物安全科技学院，长沙 410128)
摘 要：以麝香百合鳞片愈伤组织为受体，通过对农杆菌浓度、培养时间及抗生素敏感性的比较试验，
建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化的优化体系，并利用该体系将 ERF转录因子JERF3基因导
入百合中，通过 PCR、RT-PCR及Southern blot检测，证明JERF3已整合到百合基因组中并在转录水平上表
达。对11D代转基因株系耐盐性鉴定表明，与未经转化的对照相比，转基因百合的耐盐性能明显提高，说明
JERF3基因的超表达能有效提高转基因百合抵抗盐害的能力。
关键词：百合；转录因子；JERF3基因；耐盐性
中图分类号：S 682．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2007)06．1485-06
oVerexpressi0n of a Novel Member of ERF Transcription Factor JERF3 in
Lily Enhances the Tolerance to Salt
YANG Yu．hong。
，
YIN Li—rong ，GE Hong ，HUANG Rong—feng2
， XIAO Qi—ming ，and XIE Bing—yan。
(’Institute ofVegetables and Flowers，Chinese Academy ofAgncu~ural Sciences，Beijing 100081，China； Institute ofBiotechnol—
ogy Research，Chinese Academy ofAgricultural Sciences，Beijing 100081，China； College ofBio—safety Science and Technology，
Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)
Abstract：Using the callus of Lilium scales，we established an optimum Agrobacterium—mediated trans—
formation system after comparative assays among Agrobacterium concentration，cultivation time and antibiotics
sensitivity．With this system，an ERF family novel member JERF3 was transferred into lily．Identification
using PCR amplification．RT—PCR and Southern blot assay indicated that the JERF3 gene was integrated into
lily’S genome and transcriptionaly expressed．And overexpression of JERF3 in lily effectively enhanced the tol-
erance to salt．
Key words：Lily；Transcription factor；JERF3 gene；Tolerance to salt
百合属于盐敏感性植物，对土壤的盐碱度要求非常高。目前百合品系中尚无耐盐碱的品种，阻碍
了百合在盐渍化问题严重的北方地区的种植及发展，培育抗逆耐盐品种是百合育种的重要内容。ERF
转录因子分别与细胞发育、激素、抗病、低温及干旱、高盐等信号的传递有关 (刘强 等，2000；
Singh et a1．，2002)，许多功能得到确证的抗逆、抗病相关转录因子都属于此家族，如 CBF、DREB、
Pti和Ts1‘等 (Ohme—Takagi&Shinshi，1995；Hao et a1．，1998；Singh et a1．，2002)。其中转录因子
CBF1或 CBF3在拟南芥、烟草、番茄及草莓中的超表达可以诱导多种低温胁迫应答基因 COR的强表
达，从而提高植物的抗冻性 (Jaglo—Otosen et al ，1998；Gilmour et a1．，2000；Thomashow et a1．，
2001：Owens et a1．，2002)；DREBIA在拟南芥、烟草中的超表达增强了包括 rd29A在内的多种干旱
胁迫应答基因以及多种低温胁迫应答基因COR的表达，表现出对干旱、高盐和冻害的抗性能力增强
收稿日期：2007—04—26；修回日期：2007—06—24
基金项目：国家自然科学基金项 目 (30671475)
通讯作者 Author for corespondence(E—mail：xieby@mail．CSaS．net．cn)
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园 艺 学 报 34卷
(Liu et a1．，1998；Kasuga et a1．，1999；刘强 等，2000)；Pti4、Pti5或 Pti6可激活多种抗病相关的
P尺基因的表达，提高了转基因烟草和番茄等对细菌 、真菌性病害的抗性 (He et a1．，2001；Gu et a1．，
2002；Wu et a1．，2002)；Tsil通过其ERF结合域与顺式元件GCC．box和DRE互作，同时提高了转基
因烟草的耐盐性和抗病性 (Park et a1．，2001)，其在辣椒中的异源超表达也表现出转基因辣椒对病害
的广谱抗病性 (Shin et a1．，2002)。以上多项研究表明 ERF在植株的防卫反应中起着重要的调控作
用，在植物中的超表达能够提高植物的抗逆、抗病能力 (Kasuga et a1．，1999；Park et a1．，2001；
Shin et a1．，2002)。
JERF3是从番茄 cDNA表达文库中筛选得到的新的 ERF类转录因子，其表达受 JA、乙烯、脱落
酸、低温的诱导，能够与顺式作用元件 GCC—box、DRE(水分缺失应答相关的元件)结合。抗逆试验
初步证明超表达JERF3能提高转基因烟草的耐旱和耐盐性 (Wang et a1．，2004)及转基因辣椒抗疫
病、疮痂病的能力 (杨国顺 ，2003)，说明JERF3通过识别多个胁迫相关的顺式作用元件激活大量抗
逆、抗病相关下游功能基因的表达，从而提高植物对生物和非生物胁迫的抗性。
本研究是在建立百合遗传转化优化体系的基础上，利用农杆菌介导法将 JERF3基因转入百合，
获得了超表达的转基因植株，以探讨通过分子手段培育耐盐百合新品种的可行性，并为JERF3基因
耐盐机理的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1 材料
麝香百合组培苗由中国农业科学院蔬菜花卉研究所花卉组培室提供，其愈伤组织由鳞片诱导产
生。JERF3基因、供试质粒 pBI121(含 CaMV35S启动子以及抗卡那霉素的，vP Ⅱ基因)和农杆菌菌
株 LBA4404 由中国农业科学院生物技术研究所黄荣峰博士实验室提供。pROK2表达载体构建如图 1。
*-NOS—Pro__NPTⅡfKanR)--NOS-ter--qSaMV35S Pro—I1ERF3一 NoS—ter+一
图 1 重组植物表达载体 pROK2-JERF3结构图
Fig．1 Construction of recombinant plant expression vecmr pROK2-JERF3
1．2 转化体系优化筛选
预培养时间的筛选：取 1 cm 大小的百合愈伤组织，在预培养基 (MS+2，4一D 2．0 mg／L+6-BA
0．3 mg／L+蔗糖 3．O％ +琼脂 0．65％)上培养。预培养时间分别设为 0、12、24、48、72 h。30 d后
统计愈伤组织的褐化率。
农杆菌浓度的筛选：将1 cm 大小的百合愈伤组织浸于农杆菌菌液中，菌液浓度分别稀释至OD鲫
值为0．4、0．6、0．8和 1．0，感染时间为 10 min，共培养 3 d，转入芽分化选择培养基 (MS+6一BA
1．0 mg／L+NAA 0．1 mg／L+Kan 100 mg／L+Carb 300 mg／L+蔗糖 3．O％ +琼脂 0．65％)中诱导培养，
30 d后统计愈伤组织的褐化率。
共培养时间的筛选：将百合愈伤组织切成1 cm 大小，在OD鲫为0．4的农杆菌菌液中感染10 min
后，在灭菌滤纸上沥干菌液，置共培养基 (MS+2，4一D 2．0 mg／L+6-BA 0．3 mg／L+蔗糖 3．O％ +琼
脂0．65％ +AS 100 mol／L)上，每皿 1O个，正面朝上，在 25~C黑暗条件下培养。共培养时间设 1、
2、3、4、5、6和7 d。然后转入芽分化筛选培养基 (同上)中，30 d后统计愈伤组织的褐化率。
1．3 抗生素敏感性试验
卡那霉素 (Km)梯度筛选：将 1 cm 大小的愈伤组织分别接种在含 Km 0、25、50、75和 100
mg／L的分化培养基上 (Ms+6．BA 1．0 mg／L+NAA 0．1 mg／L)培养，或切取百合无菌鳞片分化的长
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约 1 cm的幼芽，分别接种于含上述浓度的卡那霉素生根培养基 (1／2 MS+IBA 0．3 mg／L)中，30 d
后统计愈伤组织的褐化率或检查生根情况。
羧苄青霉素 (Carb)抑菌浓度筛选 ：将 1 cm 大小愈伤组织在 LBA4404菌液中浸泡 10 min后分别
置于含0、150、300、450、600 mg／L Carb的分化培养基 (同上)上，15 d后统计抑菌情况。
1．4 百合的转化与再生
将预培养48 h的愈伤组织浸于农杆菌菌液中 10 min，在灭菌滤纸上沥干菌液后置共培养基上，
于25℃暗培养 3 d，然后转入芽分化培养基中。待小苗长至 2—3 cm长时，从愈伤组织上切割小苗转
人生根培养基中，15 d左右继代 1次。当经 PCR检测为阳性的试管苗长至 5—6 cm时，切取小鳞片，
转入鳞片快繁培养基 (MS+6-BA 1．0 mg／L+NAA 0．1 mg／L+蔗糖3．O％ +琼脂 0．7％)，待小苗长至
5—6 cm长时再次进行扩繁。
1．5 转基因百合的分子检测
PCR及 RT—PCR检测：取5 g转基因植株和对照植株叶片，用 SDS法提取百合基因组 DNA，根据
JERF3基因的 cDNA序列设计引物，进行 PCR扩增反应。引物序列：J3：5 一TCACCGCCGAGTITC．
TATG一3 ；J4：5 一rAATGGTcATccTccAcGc-3 ，由上海生工合成。扩增条件为 94℃预变性 3 min；
94℃变性30 S，62℃退火30 S，72℃延伸1 rain，共1O个循环；继续在94℃30 s，58℃30 S，72℃ 1
min的条件下循环25次；最后72℃延伸 10 min。扩增产物在 1．2％的琼脂凝胶电泳上进行检测，并对
阳性扩增菌液测序，用 NCBI的 BLAST程序和 DNAMAN软件进行序列比较，分析其同源性。或取
100 mg叶组织 ，采用 TRIZOL Reagent试剂盒提取总RNA，用 RQ1 RNase—Free DNase进行 DNA消化处
理，然后使用 SuperScriptlI逆转录酶合成第 1链 cDNA，取 1 IxL cDNA用上述引物及 PCR程序进行
RT—PCR扩增并分析序列的同源性。
Southern blot分析：选取部分 PCR为阳性的植株进行 Southern杂交分析。将 l5 g转基因植株和
对照植株总 DNA用EcoR I酶切，经电泳分离转移到尼龙膜上，以J3和J4为引物，用纯化的pROK~
JERF3质粒 PCR产物做探针标记，用试剂盒 (DIG High Prime Labeling and Detection Starter Kit I)标
记探针。进行 Southern blot分析。
1．6 转基因百合的耐盐性鉴定
取经过分子鉴定的1D代转基因植株和对照的生根小鳞球分别接种于含 100、200、300、400和
500 mmol／L NaC1的 MS+IBA 0．3 mg／L+糖 10％的培养基中分化培养，45 d后统计再生率和死亡率。
2 结果与分析
2．1 百合转化体系的确立
2．1．1 预培养时间、茵液浓度及共培养时间的确立 表 1表明，对愈伤组织实行预培养可减少农杆
菌感染后愈伤组织的褐化率，以预培养48 h的效果最好，褐化率最低 (40％)；农杆菌菌液浸染浓度
表 1 预培养时间、菌液浓度及共培养时间对愈伤组织褐变率的影响
Table 1 The efect of pre．culture duration。Agrobacterium concentration and co -cultivation time on callus induction browning
预培养时间
Pre—culture
duration(h)
愈伤 变率 菌液浓度 愈伤组织褐变率 共培养时间 愈伤组织褐变率
Callus induction Agrobacterium Callus induction Co—cultivation Callus induction
browning(％) concentration(OD) bro
—
w
—ning l ) — — !! 2 竖! 2
O
12
24
48
72 67 5
6
7
70
97
10o
3 7 7 3
9 8 3 4
1 2 3 4
3 4 7 3
4 5 8 9
4 6 8 O
O O O 1
加 ∞
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以OD6o为0．4时愈伤组织褐变较轻，浓度越高，愈伤组织褐变越严重；共培养时间 3～4 d较好，共
培养时间减少或增加，均加重愈伤组织的褐变率。
2．1．2 卡那霉素 (Km)和羧苄青霉素 (Carb)浓度的确定 表2表明，百合愈伤组织对Km较为敏
感，浓度为25 mg／L时褐变率就已达到67％，100 mg／L时基本全部褐化；而鳞片分化的幼芽根部对
Km的耐受力稍强，Km浓度为50 mg／L时仍有54％的生根率。在实际研究中，一般确定筛选浓度略
低于全致死浓度。本试验确定愈伤组织和小苗生根系统的Km筛选浓度为 100 mg／L。
由表 3可知，Carb浓度为300 mg／L时可达到恰好能完全抑制农杆菌生长又不影响植物细胞生长
的要求，是保证百合转化成功的最佳浓度选择。
表2 不同浓度卡那霉素 (Km)对百合愈伤组织的影响
Table 2 E of different Km concentrations
on lily callus of explant
表3 羧苄青霉素 (Carb)的抑菌效果
Table 3 Effect of Carb concentrations on
control of bacterinm
2．2 分子检测结果
2．2．1 PCR及 RT—PCR检测结果 分别对5个株系的转基因植株和未转化植株的 PCR扩增产物进行
电泳检测，可见转基因植株在 500～600 bp之间均稳定地扩增出 1条清晰的条带，对照植株则没有扩
增出相应条带 (图2，A)；扩增产物经测序分析表明与 JERF3核苷酸序列完全一致；进一步经 RT—
PCR扩增，从转基因植株中亦扩增出一段约 590 bp的特异片段 (图2，B)，与阳性对照的片段一致，
而非转化对照株无此 目标带。由此说明JERF3基因已整合到百合的基因组中并得以表达。
M CKt CK一 1 2 3 4 5 M CK CK- 1 2 3 4 5
图2 转基因植株 PCR检测 (A)和RT-PCR检测 (B)
M：分子量标记；CK ：质粒阳性对照；CK一：未转基因植株；1～5：转基因植株。
Fig．2 PCR analysis(A)and RT-PCR analysis(B)of transgenic plants
M：Marker；CK ：Plasmid positive control；CK一：Non-transgenic negative plants 1—5：Transgenic plants
2．2．2 Southern blot分析结果 为了进一步了解
外源基因在百合基因组中的整合情况、插入拷贝
数等，对部分经J3、J4引物PCR检测呈阳性的百
合植株 的基因组 DNA用 EcoR I酶切，以质粒
JERF3基因PCR扩增回收纯化产物作探针，任选
一 株转基因植株进行 Southern杂交，结果可见转
基因组织有两个条带，而非转基因的则没有 (图
3)，进一步证实了JERF3基因已整合进百合基因
4
图 3 转基因植株 Southern杂交检测
CK ：阳性对照；CK一：未转基因植株；4：转基因植株。
Fig．3 Southern blot analysis of transgenic Lilium plants
CK ：Positive control；CK一：Non—transgenie negative
plants；4：Transgenie planis．
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组中，其拷贝数为2。 ’
2．3 耐盐性测定结果
对50株转基因百合和对照的生根小鳞茎进行不同浓度 NaC1盐胁迫处理，培养45 d后 (图4)，
可见在含NaC1 100 mmol／L的培养基中，转基因百合小鳞茎萌发的新叶鲜绿色，株高较未转化的对照
植株增高40％ 一50％，生长势与对照在无盐培养
基中生长情况类似；而对照萌发率低，小鳞茎颜
色变淡，生长受到抑制。
在含 NaC1 200 mmol／L培养基中，转基因百
合的存活率仍高达 100％ (表4)，小鳞茎颜色稍
变淡，但生长势与无盐培养的对照百合基本类似；
而对照植株存活率仅 30％，小鳞茎变黄且不萌
发。NaC1浓度增至400 mmol／L时，转化株与对
照株均不萌发，但转化株的存活率仍有30％，而
对照株全部变褐死亡。
3 讨论
表4 转 JERF3基因植株耐盐性测定结果
Table 4 Salt tolerance ofJERF3 transgenic plants (％)
NaCl 100mmol／L NaCI200mmol／L NaCI 300mmol／L
图4 NaCI处理的转基因植株 (左)与非转基因植株 (右)
Fig．4 Transgenlc plants (1eft)and non—transgenlc plants (right)in NaCI
本研究通过对与转化相关的参数的筛选与比较，建立了农杆菌介导的麝香百合愈伤组织遗传转化
的优化体系：先将 1 cm 大小的百合愈伤组织预培养4 h，浸染菌液浓度 OD鲫为 0．4，浸染时间 10
min，选择培养的 Km适宜浓度为 100 mg／L， Carb浓度为 300 mg／L，共培养 3 d后转人选择性芽分化
培养基中诱导培养；当不定芽长至2 cm左右时切下接人选择性生根培养基中进行生根筛选；最后将
阳性的转化苗在鳞片快繁培养基上扩繁获得转基因再生苗。该体系提高了百合的转化效率。
在植物抗病、抗逆反应体系中，由于转录因子具有调控与同类性状相关的多个基因表达的特点而
被广泛运用于改良作物的抗病、抗逆性状方面，并取得了很多可喜的进展 (Sambrook et a1．，1989；
Liu et a1．，1998；Eulgem et a1．，2000；Yu et a1．，2001)。JERF3作为ERF转录因子家族的新成员，在
烟草、辣椒中的超表达已表现出显著的耐旱、耐盐及抗病性 (杨国顺，2003；Wang et a1．，2004)，因
此应用植物基因工程技术，将 JERF3基因导人百合现代栽培品种中，可为百合的品种改良及获得抗
逆百合新品系开拓新的途径。
本研究将 JERF3基因导人百合中获得卡那霉素抗性再生株，经 PCR、RT—PCR及 Southern检测，
表明目的基因已整合到百合基因组中，并显著提高了转基因百合的耐盐性。这些结果表明JERF3可
能作为一种正调控因子参与了百合的耐盐反应。由于植物的抗逆反应是一个非常复杂的生理过程，如
植物的抗盐性不仅取决于糖醇、四价铵离子等溶解质和渗透保护物质等效应剂 (efector)的积累，
也取决于抗盐性调节因子如转录因子、信号传导因子等对与耐盐相关下游因子的调控作用 (Hasegawa
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et a1．，2000)，因此抗盐信号传导过程更具复杂性 (Gong et a1．，2001)。虽然 JERF3能够与顺式作用
元件 GCC-box、DRE(水分缺失应答相关的元件)结合，但 JERF3基因调控何种下游基因的表达提
高百合的耐盐性，还需进一步深入研究。
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