全 文 ：园 艺 学 报 2008，35(9)：1317—1322
Acla Horticulturae Sinica
马铃薯花青素转录激活基因 stwd40的克隆与表达
分析
罗遵喜，刘仕芸，张树珍 ，杨本鹏，蔡文伟
(中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口571101)
摘 要：根据 GenBank中报道的茄属植物矮牵牛花青素 wd40类转录激活基因 anl1及番茄 wd40基因
113964R的mRNA序列的保守区结构．设计简并引物，从紫色马铃薯皮中克隆 r马铃薯 wd40类转录激活基
因的保守片段，再利用 RACE技术分别获得了该基因的3 端和5 端。序列分析表明，该基因核苷酸序列为
1 292 bp，具有完整的编码框，推导其编码 362个氨基酸，命名为stwd40。推测的氨基酸序列与 GenBank数
据库中大量物种的花青素转录激活蛋白 wd40有较高的同源性，其中与矮牵牛花青素转录调控基因 anl1的
相似性达 86％。RT—PCR表达分析显示stwd40在紫色马铃薯叶、茎、皮、肉及根中都有表达，其中在茎中
的表达量最高，肉中表达量最低；其在白色马铃薯的u十、皮和肉中也有表达，推测该基因为组成型表达。
关键词：马铃薯；花青索转录激活基因；克隆；RT—PCR
中图分类号：S 532 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2008)09—1317-06
Cloning and Expression Analysis of the Anthocyanin Transcripti0nal Activa-
tor Gene stwd40 of Solanun tuberosum
LUO Zun—xi，LIU Shi—yun，ZHANG Shu—zhen ，YANG Ben-peng，and CAI Wen—wei
(Institute ofTropical Bioscience and Biotechnolog) ，Chinese Academ)。ofTropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China)
Abstract：Based on the conserved sequence of Petunia hybrida anthocyain transcriptional activator gene
wd40(anl 1)and tomato wd40 mRNA (1 13964R)from GenBank，the conserved fragment of stwd40 tran—
scriptional activator gene was cloned from the purple potato coat．The 3 -end and 5 -end of this gene were
amplified by using RACE technique separately．Sequence analysis showed that the nucleotide sequence of this
gene is l 292 bp，containing a complete open reading flame and encoding 326 amino acids．The stwd40 amino
acid sequence is similar to anthocyanin transcriptional activator protein wd40 from large number of species，
and the homology is 86％ with the Petunia brida anthocyain transcriptional regulatory gene anl 1．The re—
suhs of RT—PCR expression analysis showed that stwd40 expressed in leaves，stems，tuber skins，tuber fleshes
and roots of purple potato and the leaves，tuber skins，tuber fleshes of white potato with diflerent expression
levels．It is suggested that the stwd40 is constitutive expressed in potato．
Key words：potato；anthocyanin transcriptional activator gene；clone；RT—PCR
花青素 (anthocyanin)属于类黄酮化合物，自然状态下常与各种单糖形成花色苷，具有抗氧化、
抗突变、抗增生、抗癌等重要的生理功能 (Beti，1985；赵保路，1999；Neil et a1．，2002；田云
等，2005；赵艳和吴坤，2006)。已有研究表明：不同植物的花青素生物合成受两类基因共同控制：
一 类是结构基因，编码花青素生物合成途径所需的酶；另一类是调节基因，编码的转录因子调控结构
收稿日期：2008—03—18；修回日期：2008—05—12
基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费项目
通讯作者Author for corespondence(E—mail：zhangsz．2007@yahoo．COn)．cn)
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园 艺 学 报 35卷
基因的时空表达 (Hohon&Cornish，1995)。目前已分离和鉴定了三类花青素合成的转录因子：
R2R3．MYB蛋白、myc家族的bHLH蛋白和 wd40重复蛋白 (Ramsay&Glover，2005)。至今已有多种
wd40重复蛋白被鉴定，它们都在转录水平上调控花青素的生物合成 (Carey et al一 2004)。
紫色马铃薯 (Solanum tuberosum)因其富含花青素而被营养学家称为健康食品。紫色马铃薯中花
青素在不同组织中的积累模式和程度受花青素转录激活基因的表达而共同调控。因此，分离克隆紫色
马铃薯花色素生物合成的转录激活基因stwd40，并进一步鉴定其功能，可为阐明马铃薯花色素生物合
成和沉积机制提供理论依据，为培育高含量花色素的马铃薯新品种奠定理论基础。
1 材料与方法
1．1 材料
紫色马铃薯 (Solanum tuberosum)2号由云南省农业科学院经济作物研究所提供；‘克新 l9’为
白皮白肉的马铃薯品种。
RNA Plant购自TIANGEN公司，M．MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶、凝胶
回收试剂盒和 pMD一18T载体购自TaKaRa公司。受体大肠杆菌 DH5 cx由本研究室保存。
1．2 RNA的提取及逆转录反应
马铃薯根、茎、皮、叶以及块茎果肉总 RNA的提取按照TIANGEN公司 RNA Plant Kit的说明书
进行。所提取的RNA经 1％的琼脂糖凝胶电泳检测无明显降解，OD260／280为 1．8～2．0，然后进行
下列逆转录反应：2．5 ixL Oligo(dT)，5 L总 RNA，加 RNase free water补足 15 L，70℃热激 5
rain，冰浴冷却 2 min，然后加入5 L M．MLV Bufer，1．5 L 10 mmol·L—dNTP，1 txL RNase inhibi—
tor，1 L M—MLV逆转录酶 (200 U·[zL )，最后加入 RNase free water补足25 L，轻轻混匀，37
℃孵育60 min；70℃加热 15 min终止反应，反转录产物保存于一20 qC备用。
1．3 保守片段的克隆
根据 GenBank核酸数据库中报道的茄属植物矮牵牛 (Petunia hybrida Vilm)花青素wd40类转录
激活基因anl 1及番茄 (Solanum lycopersicum)wd40基因 1 13964R的mRNA序列，通过 Premier 5设计
保守区弓l物 stwd40 1F：5 ．TGAATAYTGTGcTCCTITrGAC．3 ，stwd40 2R：5 ．ccAAGCAATAGcATTCA．
CAC一3。PCR反应程序为：94 qC 5 min，94℃ 30 S，52℃45 S，72℃ 1 min，25个循环，最后72 c
延伸 10 min，产物保存于4℃。
1．4 马铃薯stwd40基因3 端以及 5 端的克隆
根据已克隆的马铃薯 stwd40保守区域片段，设计 3 RACE上游引物 stwd40 F1，再结合 TaKaRa
公司3-ful RACE Core Set试剂盒提供的3 末端锚定引物 (3 adaptor primer)5 ．CTGATCTAGAGGTAC．
CGGATCC一3’，对马铃薯stwd40基因的3’末端进行 PCR扩增。
然后根据所获得的stwd40保守片段核苷酸序列在 NCBI上与其他植物花青素 wd40重复蛋白进行
比对，寻找并设计 5 上游保守区域简并引物stwd40 5 S，根据保守片段设计下游引物 stwd40 A1。PCR
反应程序为：94 5 min，94 c 30 S，52 cC 45 S，72 c 1 min，25个循环，最后72℃延伸 10 min，
产物保存于4℃。
弓I物序歹 ：stwd40 F1：5 ．TTGCGTCCGTTTCTGCTGATG．3 ：stwd40 5 S：5 一TCACCAAACCCATA—
AAGCAC~ ；stwd40 A1：5 -GAATGAAGTGGAGCCGAGAA一3 。
1．5 序列测定
将所有 PCR产物凝胶电泳后回收目的片段，与 PGM一18T载体连接并转化 DH5o~，重组子经质粒
酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。
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9 期 罗遵喜等 ： 马铃 薯花青素转 录激活 基 因 stw d4 0 的克隆与表达 分析
1 ． 6 R T — P C R 的表达分析
分别提取 紫色马铃薯根 、 茎 、 皮 、 叶 、 果 肉以 及 白色马铃薯 的皮 、 叶 、 果 肉总 R N A ， 根据 目的
基 因 stw d4 0 的非保守 区设 计引物 ， 以马铃薯组 成 型 表达 的 G A P D H 基 因作 为 内参 (G A P D H — F ： 5
’
- A T -
G A A G G A C T G G A G A G G T G G ． 3 ’ ． G A P D H ． R ： 5
’
． G A A A A T G C T T G A C C T G C T G T -3
’)， 采用 不 同的循环 ， 进
行 R T ． P C R 表达分析 。 反 应程序如下 ： 94 ℃ 3 m in ， 94 ℃ 30 s ， 56 o【= 4 5 s ， 72 ℃ 1 m in ， 分别进 行
25 、 28 和 30 个循环 ； 72 qC 5 m in 。 其 中在 28 个循环 下扩增 出来 的条带看起来亮度 一 致 ， 将其确定为
指数扩增期 。
2 结果 与分析
2． 1 马铃薯花青素转 录激活基 因 stw d4 0 全长 cD N A 序 列的克隆
以马铃薯紫皮 R N A 为模板 ， 以 stw d4 0 1 F 和 stw d4 0 2R 为 引物 ， 进 行保守 区域 的 P C R 扩增 (图
1 )， 经 测 序 其 核 苷 酸 序 列 大 小 为 4 30 bp， 同源 比对 结 果 显 示 ， 其 与 番茄 (L ycopersion enculentum )
w d4 0 基 因 同源性 高达 94 ％ ， 与矮牵牛 的相似性 为 87％ ， 命名为 stw d4 0 — 1 。
根据该保守区域片段 ， 利用 3 ’R A C E 上 游引物 stw d4 0 F 1 ， 进 行 3 ’R A C E 扩增 (图 2 )， D N A 序列
测定表 明该 3 ’R A C E 产物大小为 659 bp， 含有 14 个 P olyA 尾 。 比对 发现 其与番茄 w d4 0 基 因 1 13964 R
同源性 高达 92％ ， 命名为 stw d4 0 — 2 。
再根据 stw d4 0 ． 1 序列在 NC B I 上 与其他植 物花青 素 w d4 0 重 复蛋 白进行 比对 ， 寻找并设计 5 ’上 游
保守 区域引物 stw d4 0 5 ’S ， 结合保守 片段 所设计 的下 游引物 stw d4 0 A 1 ， 进行 5 ’端 P C R 扩增 (图 3 )，
经测序该 5 ’端核苷酸序列大小为 507 bp。
B lastn 比对结果显 示 ， 该 片段核苷酸序列与番茄 w d4 0 基 因 1 13964 R 同源性 高达 94 ％ ， 与矮牵牛
相似性 为 87％ ， 且 包 含起始密码 子 A T G ， 命名 为 stw d4 0 - 3 。
最后将 克隆到 的 cD N A 片段 的 stw d4 0 ． 1 与 3 ’末端 的核苷酸序列 stw d4 0 - 2 及 5 ’端序列 stw d4 0— 3 进行
拼接 ， 获得 了紫色马铃薯花青素转录激活基 因 stw d4 0 1 292 bp 的全 长 cD N A 。
? - - — — 2 000 bp
— — 1 000 bp
_ _ _ _ — — 500 bp
2 000 bp - - - - - — —
1 000 bp ． - - - — —
500 bp ． ． ． ． ． — —
图 l stw d4 0 保 守 区 域 的克 隆及 酶切 鉴定
1 ． M arker 2000 ； a ． P C R 扩增 ； b． 重组 质粒 酶切 鉴 定 。
F ig． 1 T he R T — P C R results ofconserved region ofstw d4 0 and
its identification for B am H I ／日抽 dm
1 ． M arker 2000 ； a ． T he P C R production ofstw d4 0 ；
b． R ecom binan tplasm id identified
by restriction enzym e digestion ．
2 000 bp
1 000 bp
500 bp
图 2 stw d4 0 3 ’端 的克隆及 酶切 鉴 定
1 ． M arker 2000 ； a ． 3
’R A C E 扩增产物 ； b． 重组 质粒 酶切鉴定 。
F ig． 2 T he R T - P C R results of3
’R A C E and its
identifica tion fo r B arn H I ／H in dm
1 ． M ar ker 2000 ； a ． T he 3
’R A C E production ofstw d4 0 ；
b． R ecom binantplasm id identified
by restriction enzym e digestion ．
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1320 园 艺 学 报 35 卷
2 000 bp — —
1 000 bp — —
500 bp - - - - — —
2 000 bp — —
1 000 bp - - - — —
500 bp - - - — —
b
图 3 stw d4 0 5 ’端 的克 隆及 酶切 鉴定
1 ． M arker 2 000 ； a ． 5
’端 P C R 扩增 ； b． 重 组 质粒酶切 鉴 定 。
F ig． 3 T he R T - P C R results of5
’
encoding cD N A fragm entand its identification for B arn H I ／H indm
1 ． M arker 2 000 ； a ． T he 5
’
encodin g eD N A fragm en tofstw d4 0 ：
b． R ecom binan tplasm id identified by restriction enzym e digestion ．
2． 2 马 铃薯花青素转录激活基 因 stw d4 0 的序 列分 析
经 序列 分析 ， stw d4 0 基 因核苷 酸 序列 大小 为 l 292 bp， 开 放 阅读框 分析显 示 ， 其读 码 框 为 66 ～
1 154 bp， 推导其编码 362 个氨基 酸 。 结果 如 图 4 所示 。
1
66
138
210
282
354
4 26
4 98
570
64 2
714
786
T C A C C A A A ffC A T A A A 6fA C A A A C A T A C A T A A C T T C A A T 丁T T A C 丁丁C A A T T A A T C T C T A C T A A A A
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1 290 ^ ^ ^ ^ ^ ^ G G A T C C G G T A C C T C T A G A T C A G
图 4 马铃薯 stw d4 0 基 因编码 的阅读框 及对 应 的核酸 和 氨基酸序 列
单 下 划线 部 分为 w d4 0 结 构域 ； 双 下 划线 部分为起 始密 码 子和终止 密码 子 。
F ig． 4 T he O R F and the dedu ced am ino acid sequence ofstw d4 0 gen e
T he single underlin ed fragm en ts w ere w d4 0 dom ain ；
T he double underlined fragm ents w ere the initiation codon and term ination codon
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9 期 罗遵喜等 ： 马铃薯花青素转 录激 活 基 因 stw d4 0 的克隆与表达 分析 1321
2． 3 stw d4 0 蛋 白质的 同源性分析及 系统树构 建
stw d4 0 基 因推测所 编码蛋 白的同源 性 比对结果显 示 它具有典 型 的 w d4 0 结 构域 ， 位 于 第 78 — 273
位氨基酸 ； 且 与矮牵牛 和苹果 (M alus × dom estica ) 的 w d4 0 蛋 白间有较 高的 同源 性 ， 分别 为 86％ 和
80％ 。 构建 的系统进化树如图 5 ， 可 以看 出其分子 进化树分为两 个分支 。 stw d4 0 基 因与苹果 的 T tgl基
因和棉花 (G ossypium hirsutum ) 的 G hT T G 3 、 G hT T G l基 因聚为 一 类 ， 其 中与苹果 rtgl基 因亲缘关 系
最近 。
0 2
图 5 stw d4 0 的 系统进 化 树
F ig． 5 P hylogenetic tree ofstw d4 0
2． 4 stw d4 0 在不 同马铃薯品种不 同组 织 部位 的 R T - P C R 表达分析
在指数扩增期下 (28 个循环 ) 通过 内参基 因 幽 肋 日 的表达量调节 cD N A 模板加入 量 ， 进行 R T —
P C R 分析 (图 6 )。
A
。删 O
G A P D H
B
stw d4 0
G A P D H
l 2 3 4
2 3 4 6
图 6 stw d4 0 基 因在 马铃薯不 同组 织 部位 的 R T - P C R 表达 分 析
A ． 1 ～ 5 分别 为 ： 紫叶 、 紫茎 、 紫皮 、 紫肉 、 紫根 ；
B ． 1 — 6 分 别 为 ： 紫叶 、 紫皮 、 紫肉 、 白叶 、 白皮 、 白肉 。
F ig． 6 R T - P C R expression analysis ofstw d4 0 in various tissue in patato
A ． 1 — 5 ： P urple leaves ， purp le stem s ， purp le tuber skins ， purp le tuber fleshes ． purp le roots ；
B ． 1 — 6 ： P urp le leaves ． purp le tu ber skins ， pu rp le tuber fleshes ，
w hite 1eaves ． w hite tuber skins ． w hite tuber fleshes．
?
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l322 园 艺 学 报 35卷
基因stwd40在紫色马铃薯的不同组织部位中都有表达，其中以紫茎中的表达量为最高，紫肉中
表达量最低 (图6，A)；且该基因在白色马铃薯的皮、叶和果肉中都表达，但表达量相对都低于紫
色马铃薯的对应相同部位 (图6，B)，说明该基因在马铃薯中呈组成型表达。
3 讨论
wd40重复蛋白最早发现于植物细胞质中，它具有 13螺旋桨蛋白组结构，其核心区域由40个氨基
酸残基组成，该区域包含苷氨酸一组氨酸二肽和色氨酸一天门冬氨酸二肽。最典型的 wd40重复蛋白
是 G13亚基，G13亚单位由7个桨叶组成 9一螺旋桨结构，包含着7个 wd40重复 (Ramsay&Glover，
2005)。目前已有多种 wd40重复蛋白得到鉴定，如矮牵牛的 anl1(Veten et a1．，1997)、拟南芥的
TFG1(Walker et a1．，1999)、紫苏的PFWD (Yamazaki et a1．，2003)和玉米的 PAC1(Carey et a1．
2004)等，它们都在转录水平上调控花青素的生物合成途径。
本研究获得的stwd40基因具有完整的阅读框，其核酸序列与 GenBank数据库中wd40类花青素转
录激活基因高度同源，尤其是和同属植物矮牵牛的花青素转录调控基因anl1的相似性达 86％；蛋白
质功能预测该基因具有wd40典型的结构域，位于该蛋白序列的第78～273位，推测该基因为wd40类
基因。
RT—PCR表达分析显示 stwd40在紫色马铃薯的叶、茎、皮、肉及根组织中都有表达，只是强弱不
且该基因在白色马铃薯的叶、皮、肉中也有表达，但其表达量都低于紫色马铃薯的相应部位，所
以认为该基因在马铃薯中属于组成型表达。
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