全 文 ：园 艺 学 报 2007，34(6)：1477—1484
Acta Horticuhurae Sinica
不同倍性百合杂交后代的核型及分子标记鉴定
陈 琼 ，穆 鼎 ，义鸣放 ，
(’中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；
明 军 ，刘 春
中国农业大学园林植物与观赏园艺系，北京 100094)
摘 要：以百合两个杂交组合， ‘Brunelo’ × ‘Yelow Jiant’和 ‘Prato’ ×Lilium pumilum的亲本和
杂交后代为试材，从染色体和 DNA两个方面对杂交后代进行鉴定，比较杂交后代与亲本问的遗传差异和相
似性。结果显示，两个杂交后代均为三倍体，由不同倍性的亲本杂交而来，且染色体随体丰富。用4对多
态性高的SRAP引物对试材进行扩增。结果表明：杂交后代除了含有父母本的特征带，还具有父母本没有
的谱带，且它们与母本间的遗传距离均小于其与父本间的遗传距离。核型分析和分子标记的结果一致，均
证实了两个杂交后代的真实性，且两个杂交后代在遗传上均偏向母本。
关键词：百合；杂交；染色体；多倍体；核型分析
中图分类号 ：S 682．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2007)06—1477-08
Identification and Genetic Expressions of Lily Hybrids Obtained by Diferent
Ploidy Cross Combinations
CHEN Qiong ，MU Ding ，YI Ming—fang ，MING Jun ，and LIU Chun
(’Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China； Department of Orna—
mental Horticulture，China Agricultural University，Beijing 100094，China)
Abstract：Two hybrids，‘Brunello’ × ‘Yellow Jiant’and ‘Prato’ ×Lilium pumilum，were identi—
fled by karyotype analysis and SRAP techniques．Genetic differences and similarity were compared between
the parents and the progenies．The results showed that the two hybrids were both triploids，and contain abun—
dant trabant．Four pairs of SRAP primer with higher polymorphism were used and the hybrid bands and con-
plementary bands were found in the hybrids．Pairwise genetic distances between the hybrids and their female
parents are smaller than that between the progenies and their male parents．The results of SRAP were in con—
sistent with that of karyotype analysis．The two hybrids were both true progeny of their parents，and both with
a genetic tendency to their female parents．
Key words：Lily；Hybridization；Chromosome；Polyploidy；Karyotype analysis
利用核型分析对百合野生种及其杂交后代进行鉴定，此前已有较多报道 (黄济明，1982；谢晓
阳和武全安，1993；仲裕泉 等，1993；Obata et a1．，2000；张绍斌 等，2004；岳玲和雷家军，2006a；
岳玲 等，2006b)，但鲜见对百合栽培品种杂交后代核型分析的研究。近年来，越来越多的百合育种
者采用 RAPD、AFLP标记技术对百合资源及其杂交后代进行鉴定 (赵祥云 等，1995；Yamagishi et
a1．．2002；Kim&Ahn，2002；罗凤霞 等，2005)。
本研究中对百合的两个杂交组合进行了核型分析和 SRAP (sequence—related amplifed polymor—
phism)标记分析，从染色体和 DNA水平上确定杂交后代的真实性，为百合杂交亲本选配和后代鉴定
收稿日期：2007—05—08；修回日期：2007—10一ll
基金项目：国家 ‘863’项目 (2002AA241051)；国家社会公益研究项目 (2005DIB022)；北京市花卉重点项 目 (YLHH2006001，
YLHH2006002)；国家科技支撑项目 (2006BAD01A18)
通讯作者Author for corespondence(E—mail：muding@yahoo．com．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 34卷
提供参考。
l 材料与方法
1．1 材料
亲本为亚洲杂种系品种 ‘Prato’(四倍体)、‘Yelow Jiant’(二倍体)、‘Brunelo’(四倍体)及
野生种Liliumpumilum (非整倍体)。杂种 (‘Brunelo’ × ‘Yelow Jiant’)F．和 (‘Prato’ ×L．pumi．
1um)F。经切割母本花柱，授予父本花粉结实后进行胚抢救获得。杂种苗均由各 自的一个杂种胚长成
的幼苗扩繁而来，同一杂种群体内基因型一致。
试验材料均在中国农业科学院蔬菜花卉研究所获得。试验于 2006年 7—12月在中国农业科学院
蔬菜花卉研究所完成。
1．2 方法
染色体制片采用常规压片法 (朱潋，1982)。上午 9—10时取田间生长旺盛的百合植株根尖，常
规制片，镜检，用 Canon A710相机拍照成像。
每一植物材料统计30个以上可准确计数染色体的细胞，以确定该材料的染色体数。分别从 5个
以上根尖压片中选择缢痕清晰而又分散良好的5个细胞的平均值作为该材料的核型数据。核型分析按
李懋学和陈瑞阳 (1985)的标准，核型类型按 Stebbins(1971)的分类标准划分。
叶片总 DNA的提取采用 CTAB小量提取法。
按照 Li和 Quiros(2001)提出的原则设计引物，由上海生工合成 (表 1)。PCR扩增产物在6％
聚丙烯酰胺凝胶上恒功率 70 W 电泳，用 10％乙酸固定，银染得到被扩增的 DNA谱带。统计有差异、
易于识别的多态性条带，有带记为 1，无带记为 0。利用 Memg软件进行分析，获得材料间的成对遗
传距离。
表 1 SRAP引物名称及序列
Table 1 The name and sequence of SRAP primers
2 结果与分析
2．1 核型分析
根据染色体参数 (表2)得出各材料的核型公式 (表3)。从核型公式看，两个杂交后代均为三
倍体。(‘Prato’ ×L．pumilum)F。的母本为四倍体，父本为非整倍体，而 (‘Brunelo’ × ‘Yelow
Jiant’)F．的母本为四倍体，父本为二倍体。两个杂交后代的染色体总长度远小于它们两亲本之和的
一 半。从核型类型上比较，(‘Prato’ ×L．pumilum)F。为3A型，其父母本都属于3B型；(‘Brunelo’
× ‘Yelow Jiant’)F，及其父母本的最长与最短染色体的比值相近，均为3A型。
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 陈 琼等：不同倍性百合杂交后代的核型及分子标记鉴定 1479
材料
Material
T0tal length of
chromosomes
最长／最短
Longest／ 核型公式 Karyotyt~formulae
shortest
核型类型
Karyotype
维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯 http://www.cqvip.com
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 34卷
2．2 SRAP标记
本试验从32个引物组合中筛选出多态性标记
比较清晰的4个引物组合进行 SRAP分析，这4
个引物组合两次重复扩增的带型完全相同。图 3
是引物组合 em3／me6的标记，反映了本试验技术
与结果的可靠性。4个引物组合共扩增出 88条
带，其中具多态性带 79条，占89．78％。引物组
合不同，扩增的片段数也不同，em3／me6组合扩
增的带最多，为 31条，eml／me3组合最少为 15
条，平均每个组合扩增22条带。
对每个杂交组合 F 代杂种扩增出的特异带进
行统计，(‘Brunelo’ × ‘Yelow Jiant’)F 的杂
种带有82．61％来 自母本，17．39％来 自父本，几
乎没有杂种特异带出现。 (‘Prato’ ×L．pumi—
lum)F 的 39条 带 中有 43．59％ 来 自母 本，
28．21％来自父本，还有 28．21％的带是杂种特有
的，可见这个杂交组合后代存在着丰富的遗传变
异。两个组合中均存在部分亲本特异带没有在其
杂交后代中出现的现象。
3 讨论
F 早 F 早
‘Brunello’בYellow Jiant’ ‘Prato L．pumilum
图3 引物组合 em3／me6的扩增谱带
箭头示杂交后代与父本或母本的共同带。
Fig．3 Fingerprinting profile of primer combination end／me6
Arrowheads show the comlTlOn bands．
3．1 核型分析
由于去雄在母本花药尚未开裂前完成，所以可排除后代是母本自交结实的可能。其次，杂交后代
为三倍体，而不是二倍体或者四倍体，也可以排除母本发生无融合生殖或产生 2n配子的可能性。但
是，母本为同源四倍体，其减数分裂会出现异常情况，杂种却都为三倍体而不是非整倍体。出现这种
现象的原因可能是同源四倍体母本在减数分裂过程中未发生引起配子染色体数变化的变异，至于杂交
组合 ‘Prato’ ×L．pumilum的非整倍体父本 L．pumilum多出来的那条染色体 ，很可能在减数分裂过
程中丢失了。如果这种假设成立的话，杂种苗又都是由各自的一个杂种胚长成的幼苗扩繁而来，同一
杂种群体内基因型一致，那么获得的杂种胚很可能都是由母本没有发生染色体数目变异的配子受精形
成。
两个杂交后代的染色体总长度均小于两亲本染色体总长之和的一半，且它们的相对长度和臂比值
范围均没有完全处在两亲本之内。导致这种结果的原因有三：第一，染色体总长度的变化是由于杂种
继承了母本长度较小的两套染色体；第二，染色体相对长度变化可能是由小片段染色体的插入或丢失
引起，而臂比值的变化可能是由异源小片段的插入或染色体倒位引起的 (王晶 等，2003)，百合属植
物属于大染色体类群，且染色体基数较高，因此染色体在有丝分裂过程中易发生交错纠缠，导致断
裂、缺失、易位重复、倒位等结构变异 (周朝鸿，1997)；第三，由于预处理条件和染色体缩短的程
度不同，同一个材料不同细胞测出的染色体绝对长度也有明显差异，这就造成相对长度和臂比值也会
出现误差。
在核型分析时，次缢痕和随体分布常常是研究的重要内容之一。根据Stewart(1947)的研究，
L．pumilum的第3、第6对染色体长臂上共具有4个近端随体，而本试验结果显示的4个随体分别在
第9、第 11和第 12对上，与上述观察不符。杂种 (‘Prato’ ×L．pumilum)F 第6、第 8对染色体长
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 陈 琼等 ：不同倍性百合杂交后代的核型及分子标记鉴定
臂上共有4个类似的随体，这种随体在 ‘Prato’上并未发现，那么这 4个随体是由于变异产生的，
还是全部来源于 L．pumilum，亦或是其中两个确实来源于 ‘Prato’，只是在 ‘Prato’里由于种种原因
未被发现，这一问题，有待进一步研究。同样，(‘Brunelo’ בYelow Jiant’)F 的第7对染色体长
臂上也发现了父母本都没有的近端随体。通常，随体在有丝分裂过程中表现不稳定，它可以分解、合
并，极易受外界条件的影响，特别由于制片的原因或后期处理的误差，对于随体的有无，很可能发生
错判，或者在随体染色体按大小排序时发生错配，导致在判断杂种随体来源时出现困难。关于随体的
不稳定性，Moore(1982)指出，一个种的核仁形成中心可能对另一个种是显性，所以，在杂种中，
较弱染色体组可能不显示亲本中存在的随体。两个杂种与亲本随体的不一致，是由于变异，还是由于
它们的亲本在形成过程中受核仁影响，导致随体显示不完全，值得深入探讨。
3．2 SRAP标记
SRAP标记通过独特的引物设计，对内含子、启动子与间隔区长度不等而产生多态性。这种分子
标记是在较为严格的条件下，PCR扩增获得多态性位点，具有简便、稳定、产率中等、在基因组中
分布均匀等优点。本研究发现，杂种 (‘Brunelo’ בYelow Jiant’)F 的特征带全都来 自于父母本，
没有杂种自己的特征带出现；而杂种 (‘Prato’ ×L．pumilum)F 的特征带中有 43．59％来 自母本，
28．21％来自父本，这无疑可以证明该杂种的真实性 (于拴仓 等，2005)。
杂交后代扩增条带中除了具有与亲本互补的带以外，还出现了亲本没有的扩增条带。据有关研究
报道，它们可能来源于不同长度的等位核苷酸序列之间形成的异源双链体 (Riedy et a1．，1992；Ay．
1ife et a1．，1994)。至于双亲有而杂交后代没有的条带，可能是配子形成过程中，染色体的交换及
DNA分子碱基修饰引起的突变等原因所造成的位点丢失 (房经贵 等，2000)。有人认为这些例外情
况发生是由于竞争性抑制作用，杂合双链 DNA可能表现对某些引物结合的空间干扰或竞争作用，使
得杂种本应显现的条带受到了完全的或部分的抑制，或者使杂种出现双亲都不具有的扩增带 (Riedy
et a1．，1992)。出现这些现象的确切原因还有待进一步研究。
综合对杂交后代的核型分析和 SRAP标记的结果，可以推断，前述两个杂种都包含了双亲的遗传
物质，但其中一个亲本所占的比例大于另一亲本。一方面可能是一个亲本有 2个染色体组参与了杂种
的形成，另一方面可能还有细胞质遗传的问题。
References
Ayliffe M A．Lawrence G J，Elis J G．1994．Heteroduplex molecules formed between alelic sequences cause non-parental RAPD bands．Nucleic．
Acids．Res．，22(9)：1632—1636．
Fang Jing—gui，Zhang Zhen，Ma Zheng-qiang，Liu Da~un，Wang San-hong，Lavi U．2000．The polymorphism and segregation patterns of AFIJP
markers in the FI progenies from the CroSS oftwo mango cuhivars．Scientia A cuhura Sinica，33(3)：l9—24．(in Chinese)
房经贵，章 镇，马正强，刘大钧，王三红，Lavi U．2000．AFIJP标记在两个芒果品种间杂交 Fl代的多态性及分离方式．中国农
业科学，33(3)：19—24．
Huang Ji．ming．1982．Hybridization between Lilium spp．(Lilium regale Wils．×L．davidⅡvar．Unicolor Coton)．Acta Horticuhurae Sinica，
9(3)：51—56．(in Chinese)
黄济明．1982．王百合 ×大卫百合种间远缘杂种的育成．园艺学报，9(3)：51—56．
Kim S．Ahn B．2002．RAPD—mediated determination of genetic related ness in oriental lilies．Korean Joumal of Horticultural Science＆ Technolo-
gy，20 (3)：246—251．
“G．Quiros c F．2001．Sequence．related amplifed polymorphism(SRAP) a new marker system based on a simple PCR reaction its application
to mapping and gene tagging in Bras&a．Theor．App1．Genet．，103(2—3)：455—461-
I』i Ma0．xue．Chen Rui—yang． 1985．A suggestion on the standardization of karyotype analysis in plants．Journal of Wuhan Botan ical Research，3
(4)：297—302．(in Chinese)
李懋学，陈瑞阳．1985．关于植物核型分析的标准化问题．武汉植物学研究，3(4)：297—302．
维普资讯 http://www.cqvip.com
l484 园 艺 学 报 34卷
Luo Feng-xia，Sun Xiao—mei，Mu Ding．2005．Identification of intraspecific hybridization between oriantal hybrids‘Sorbonne’and ‘Marco Polo’
using RAPD marker．Annals of Chinese Bulbar Flower．(in Chinese)
罗凤霞，孙晓梅，穆 鼎．2005．东方百合 Sorbonne与 Marco Polo品种间杂交及其后代的 RAPD标记鉴定．中国球根花卉年报．
Moore D M．1982．Genetics of plant cel1．Mo Hui—ying trans．Beijing：Science Press：5-56．(in Chinese)
More D M．1982．植物细胞遗传学．莫慧英译．北京：科学出版社：5—56．
Obata Y，Niimi Y，Nakano M．2000．Interspecific hybrids between Lilium nobilissimum and L．regale produced via ovules—with—placental—tissue
culture．Scientia Horticuhurae，84(1／2)：191—204．
Riedy M F，Hamilton W J．Aquadro C F． 1992．Excess of non—parental bands in ofspring from known primate pedigrees assayed using RAPD
PCR．Nucleic Acids．Res．，20(2)：918—924．
Stebbins G L．1971．Chromosomal evolution in higher plants．London：Edward Arnold：130—131．
Stewart R N．1947．The morphology of somatic chromosomes in Lilium．American Journal of Botany．34：9—26．
Wang Jing，Xiang Feng—ning，Xia Guang—min，Chen Sui—yun，Chen Hui—min．2003．Karyotype analysis of the F5 somatic hybrids betwen Tr／t／c—
Ltm aestivum and Elytrigia elongata(Host)Nevski．Journal of Triticeae Crops，23(1)：12—16．(in Chinese)
王 晶，向风宁，夏光敏，陈穗云，陈惠民．2003．普通小麦与高冰草体细胞杂种 F 代株系的核型分析．麦类作物学报，23
(1)：12—16．
Xie Xiao—yang，wu Quan—an．1993．The determination of karyotype and isesterase on triploid Lilium david lI．Acta Botanica Yunnanica，15
(1)：57—60．(in Chinese)
谢晓阳，武全安．1993．三倍体川百合的核型与酯酶同功酶鉴定．云南植物研究，15(1)：57—6O．
Yamagishi M，Abe H．Nakano M．2002．PCR—based molecular markers in Asiatic hybrid lily．Scientia Horticuhurae，96(1／4)：225—234．
Yu Shuan—cang，Chai Min，Zhao Hong，Jiang Li—gang．2005．Fingerprinting identifcation of inter—specifc hybrid from Lycopersicon esculentum x
L peruvianum．Molecular Plant Breeding，3(1)：61—65．(in Chinese)
于拴仓，柴 敏，赵 泓，姜立纲．2005．栽培番茄与秘鲁番茄种间杂种的DNA指纹鉴定．分子植物育种，3(1)：61-65．
Yue Ling．Lei Jia-jun．2006a．Study on the genetic diversity of Lilium h,~ifolium Thunb．Journal of Anhui Agricultural Sciences，34(22)：5802
— 5803，5852．(in Chinese)
岳 玲，雷家军．2006a．卷丹种内居群的遗传多样性研究．安徽农业科学，34(22)：5802—5803，5852．
Yue Ling，Lei Jia-jun，Wang Xin．2006b．Study on karyotypes of 4 species of lily in Liaoning Province．Liaoning Agricultural Sciences，4：5—
8．(in Chinese)
岳 玲，雷家军，王 欣．2006b．辽宁的4种野生百合 Lilium spp．的核型研究．辽宁农业科学，4：5—8．
Zhang Shao—bin，Xu Jie—mei，Yu Hong．2004．Studies on karyotypes of 10 populations in Lilium sulphureum from Yunnan．Acta Botanica Yunnan—
ica，26(4)：413—420．(in Chinese)
张绍斌，许介眉，虞 泓．2004．云南淡黄花百合 1O居群核型研究．云南植物研究，26 (4)：413-420．
Zhao Xiang—yun，Chen Xin—lu，Fang Hai，Zhang Yun—fang．1995．Using RAPD marker to evaluate the genetic relationship among genus Lilium．
Journal of Beijing Agncultural Colege，10(2)：58—63．(in Chinese)
赵祥云，陈新露，方 海，张云芳．1995．用 RAPD标记评价百合品种间遗传关系．北京农学院学报，10(2)：58—63．
Zhong Yu—quan，Li Hao—bing，Wang Ke-juan．1993．Analysis of karyotype and C-banding patern ofZijinshan lily．Jiangsu Journal ofAgricultural
Sciences，9(3)：8—12．(in Chinese)
仲裕泉，李浩兵，王克娟．1993．南京紫金山百合的核型和 c一带带型分析．江苏农业学报，9(3)：8—12．
Zhou Chao—Kong．1997．Chromosomal numerical variations in regenerated plants of3 species in Lilium．Forest Research，10(6)：663—667．(in
Chinese)
周朝鸿．1997．三种百合属植物再生植株的染色体数量变异．林业科学研究，10(6)：663—667．
Zhu Cheng．1982．Chromosome and dyeing technique in plants．Beijing：Science Press：43—83．(in Chinese)
朱 激．1982．植物染色体及染色体技术．北京：科学出版社：43～83．
维普资讯 http://www.cqvip.com