全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2006, 33 (4) : 789～793
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2005 - 09 - 01; 修回日期 : 2005 - 11 - 01
基金项目 : 国家 ‘十五’攻关项目 (2004BA525B01) ; 农业部农作物种质资源保护利用专项资助项目 (NB052070401)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: pvp sc@mail1caas1net1cn) 第一作者现工作单位江苏省淮阴工学院农业与食品工程系
百合种质资源限制生长法保存研究
陈　辉 1, 2 　陈晓玲 1 　陈龙清 2 　卢新雄 13
(1 中国农业科学院作物科学研究所 , 农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 , 国家农作物基因资源与基因
改良重大科学工程 , 北京 100081; 2 华中农业大学园艺林学学院 , 湖北武汉 430070)
摘 　要 : 对切花百合 (L ilium L. ) 品种 ‘Siberia’ (西伯利亚 ) 试管苗限制生长保存方法及保存后恢
复生长的再生植株的遗传稳定性进行了研究。结果表明 , 常温 ( 20 ±1) ℃、光照强度 1 500 lx、光照时间
12 h /d的条件下 , 在 MS或者 1 /2MS培养基中添加 110～310 mg/L的脱落酸 (ABA ) 能够有效延长百合试
管苗的继代间隔时间。离体保存百合试管苗 9个月时存活率均在 80%以上。在添加 50～90 g/L高浓度蔗糖
的培养基中能够保存百合试管苗 11个月以上 , 保存过程中植株生长缓慢 , 基部有紫色鳞茎生成。而添加
10～50 g/L甘露醇或 10～40 mg/L矮壮素 (CCC) 对百合试管苗生长没有起到明显的限制作用。各种限制
生长法保存的试管苗转移到恢复培养基上培养 1个月左右均能长成正常的植株 , 其形态特征以及可溶性蛋
白质、过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶图谱与对照相比没有明显差异。
关键词 : 百合 ; 种质资源 ; 限制生长法 ; 离体保存 ; 遗传稳定性
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2006) 0420789205
Stud ies on Germ pla sm Con serva tion of L ily ( L ilium L. ) by Restr icting
Growth M ethod
Chen Hui1, 2 , Chen Xiaoling1 , Chen Longqing2 , and Lu Xinxiong13
(1 Key Laboratory for C rop Germ plasm and B iotechnology of A gricultural M inistry, Institu te of C rop Science, Ch inese A cadem y of
A gricultural Sciences, The N ationa l Key Facility for C rop Gene R esources and Genetic Im provem ent, B eijing 100081, China;
2 College of Horticu ltura l and Forestry Sciences, Huazhong A gricultural U niversity, W uhan, Hubei 430070, Ch ina)
Abstract: Studies on conservation of in vitro shoots of lily (L ilium L. ) by restricting growth method and
genetic stability of recovered p lantlets were carried out. Results showed that 80% of in vitro shoots could be
conserved in the medium supp lemented with 110 - 310 mg/L ABA for more than 9 months at normal tempera2
ture of (20 ±1) ℃, 1 500 lx and 12 h /d photoperiod. MS or 1 /2 MS ( half strength of macronutrients and m i2
cronutrients) medium supp lemented with 50 - 90 g/L sucrose restricted the growth of in vitro shoots and p ro2
longed the subculture interval to over 11 months. In vitro shoots grew slowly and p roduced some purp le bulb
during conservation. The growth of in vitro shoots cultured in medium supp lemented with 10 - 50 g/L mannitol
or 10 - 40 mg/L trimethylammonium (CCC) was not significantly restricted. After cultured in recovering me2
dium for 1 month, all conserved in vitro shoots turned to normal p lantlets and showed no obvious difference in
morphology, soluble p rotein, isoenzynic zymogram of esterase and peroxidase compared with the control.
Key words: L ily; Germp lasm resources; Restricting growth method; In vitro conservation; Genetic
stability
我国是百合 (L ilium L. ) 的分布中心 , 种质资源丰富 , 许多野生种属于珍稀濒危植物。因百
合是多年生球茎草本植物 , 无法通过低温库种子保存方式来进行种质资源保护。目前的保护途径
主要是采用田间种植保存和组织培养试管苗保存 , 前者成本高 , 且易受自然灾害的威胁 , 需对种
质材料进行频繁继代 , 因而易产生多倍体、非整倍体、染色体缺失和异位等结构、数目变异
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园 　　艺 　　学 　　报 33卷
等〔1, 2〕。限制生长离体保存是近年来新发展且较为有效的种质保存方法 , 以组织培养技术为基础 ,
通过改变试管苗的生长环境 , 使细胞生长降至最小限度 , 延长继代间隔时间 , 减少继代次数 , 以
避免频繁继代造成污染或引发种质变异 , 从而有效地保证种质的遗传稳定性 , 实现植物种质资源
的中期保存目的。
限制生长离体保存技术已成功地应用于大蒜等多种无性繁殖植物种质资源保存〔3～7〕, 但未见各类
百合离体保存技术的报道。作者通过研究百合种质资源限制生长法保存的主要影响因素及指标 , 以及
离体保存后再生植株的遗传稳定性 , 以期为百合种质资源中期保存提供理论和实践依据。
1　材料与方法
以切花百合品种 ‘Siberia’ (西伯利亚 ) 的无菌试管苗为试材。种球于 2003年 11月购于北京市
中荷惠函贸易公司。将百合鳞茎清洗干净 , 表面灭菌后接种于培养基 MS + BA 115 mg/L + NAA 011
mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7 g /L琼脂上 , 然后转移到 MS +BA 210 mg/L +NAA 011 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7
g/L琼脂上进行增殖扩繁 , 并选用继代培养 25～30 d的试管苗用于以下的保存试验。
以添加 30 g/L蔗糖 (适于百合正常生长的培养基中的蔗糖含量 ) 和 7 g/L琼脂的固体 MS培养基
为对照 , 改变 MS培养基中蔗糖的浓度 ( 15、50、70、90、110 g/L ) 后对试管苗进行保存。保存 11
个月时统计试管苗存活率。
将试管苗接在 MS + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂 , MS + 90 g /L蔗糖 + 7 g/L琼脂 , 1 /2MS1 + 30 g/L
蔗糖 + 7 g/L琼脂 , 1 /2MS1 + 90 g/L蔗糖 + 7 g /L琼脂的培养基中进行保存 , 其中 1 /2MS1 为大量元素
用量减半的 MS培养基。保存 11个月时统计试管苗存活率。
将试管苗分别接种在附加 0、015、110、210、310 mg/L ABA的 MS固体培养基 (含 30 g /L蔗糖
和 7 g/L琼脂 ) 上保存。保存 9个月时统计试管苗存活率。
将试管苗接在以下 4种培养基中进行保存 : MS +ABA 110 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂 , MS
+ABA 310 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂 , 1 /2MS2 + ABA 110 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L琼脂 ,
1 /2MS2 +ABA 310 mg/L + 30 g /L蔗糖 + 7 g /L琼脂 , 其中 1 /2MS2 为大量元素和微量元素的用量均减
半的 MS培养基。保存 9个月时统计试管苗存活率。
将试管苗分别接种在附加 0、10、20、30、40、50 g /L甘露醇的 MS固体培养基 (含 30 g /L蔗糖
和 7 g/L琼脂 ) 上保存。4个月后统计试管苗存活率。
将试管苗分别接种在附加 0、10、20、30、40 mg/L CCC的 MS固体培养基 (含 30 g/L蔗糖和 7
g/L琼脂 ) 上保存。4个月后统计试管苗存活率。
将上述各种处理保存后的试管苗接种至 MS +BA 115 mg/L +NAA 012 mg/L + 30 g/L蔗糖 + 7 g/L
琼脂培养基上进行恢复培养。1个月后调查恢复生长情况。
以上各试验均是在常温 (20 ±1) ℃、光照强度 1 500 lx、光照时间 12 h /d的条件下进行培养 , 每
隔 30 d测 1次株高。
遗传稳定性检测 : 保存后的试管苗接种至继代培养基上进行恢复培养 , 观察植株的形态变化。
以恢复生长 1个月后的植株为材料提取可溶性蛋白质、过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶进行电泳。
以正常条件下生长的试管苗作为对照。试验方法参见文献 〔8〕并略有改动。
使用 SAS和 Excel软件对试验数据进行分析。
2　结果与分析
211　不同蔗糖浓度对试管苗保存效果的影响
在 20℃, MS培养基中添加 15～110 g/L蔗糖下 ‘西伯利亚 ’试管苗均能保存至 11个月以上。
随着蔗糖浓度的增加 , 试管苗的存活率有所下降。蔗糖浓度达到 90 g /L以上时出现死亡植株。当蔗
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糖浓度为 110 g/L时存活率降至 40%。所以 , 蔗
糖浓度过高不适于百合试管苗的保存。
从试管苗的株高变化上看 , 低浓度 (15 g/L)
蔗糖对试管苗的生长没有显著的抑制作用。高浓
度 (50 g/L以上 ) 蔗糖显著抑制试管苗的生长。
随着蔗糖浓度的升高 , 抑制作用逐渐加强。蔗糖
浓度达到 50 g /L以上的各种培养基中相同时间间
隔内试管苗株高变化较小 , 即植株生长缓慢 (图
1)。从试管苗的表面形态上看 , 50 g/L以上的高
浓度蔗糖能够诱导百合植株基部生成紫色的小鳞
茎 (图版 , A )。
212　不同培养基基本成分和蔗糖浓度对试管苗保
存效果的影响
试管苗在基本成分和蔗糖浓度不同的 4种培
养基中保存 11个月时的存活率及株高见表 1。4
种培养基对试管苗的保存均能达到 11个月以上 ,
且存活率均在 65%以上。添加了 90 g/L蔗糖的培
养基对植株生长的限制效果较为明显 , 而培养基
中大量元素减半对植株生长速度的影响不大。添
加高浓度 (90 g/L ) 蔗糖的培养基可使植株基部
生成紫色小鳞茎 (图版 , B )。
213　不同 ABA浓度对试管苗保存效果的影响
百合试管苗在添加 0～310 mg/L ABA的 MS
培养基中保存 9个月后的存活率及株高见表 2。
试管苗存活率虽随着 ABA 浓度的升高而有所降
低 , 但是保存 9个月以后试管苗的存活率高达
80%以上 , 而且呈嫩绿色并保持着良好的长势。
保存过程中试管苗的叶色、叶型及株型等外部形
态都没有发生变化 (图版 , C)。
MS培养基中添加 110～310 mg/L ABA的百
合试管苗与对照相比在相同的时间间隔内株高变
化幅度小 , 即生长明显减慢。因此 , 用该方法保
存百合试管苗比较适宜。
214　不同培养基基本成分和 ABA浓度对试管苗
保存效果的影响
试管苗在基本成分和 ABA浓度不同的 4种培
养基中保存 9个月后的存活率及株高见表 3。保
存 9个月后生长仍然良好 , 存活率均达到 100%。
结果表明 , 减少培养基中的无机大量及微量元素 ,
能够延缓植株生长、有效保存种质。保存过程中
试管苗的外部形态没有发生较大变化 (图版 ,
D)。
图 1　试管苗植株在含不同浓度蔗糖的 M S培养基中
保存不同时间的株高变化
F ig. 1　D ynam ic of he ight of in v itro plan tlets con served in M S
med ium with d ifferent concentra tion of sucrose for d ifferent dura tion
表 1　不同培养基基本成分和不同浓度蔗糖保存百合
试管苗 11个月后的存活率及株高
Table 1　Surv iva l ra te and he ight of in v itro plan tlets con served
for 11 m on ths in the m ed ium w ith d ifferen t chem ica l elem en ts and
d ifferen t concen tra tion of sucrose
代号
Code
培养基
Medium
蔗糖浓度
Sucrose ( g/L)
存活率
Survival rate ( % )
株高
Height( cm)
1 MS 30 91188 7141 ±0179 a
2 MS 90 78157 2175 ±0142 b
3 1 /2 MS1 30 65100 7100 ±0115 a
4 1 /2 MS1 90 68189 2125 ±0113 b
　　注 :同列内相同字母表示在 0105水平上差异不显著。下表同。
Note: Means within the same column followed by the same letter
are not significantly differently at 0105 level. The same below.
表 2　百合试管苗在添加不同浓度 ABA的培养基中保存
9个月后的存活率及株高
Table 2　Surv iva l ra te and he ight of in v itro plan tlets con served
for 9 m on ths in the m ed ium w ith d ifferen t concen tra tion of ABA
ABA浓度
ABA concentration (mg/L)
存活率
Survival rate ( % )
株高
Height( cm)
0 90 8118 ±0180 a
015 100 7150 ±0110 a
110 100 1185 ±0118 b
210 90 1105 ±0107 c
310 80 1108 ±0124 c
表 3　不同培养基基本成分和不同浓度 ABA保存百合试管苗
9个月后的存活率及株高的影响
Table 3　Surv iva l ra te and he ight of in v itro plan tlets con served
for 9 m on ths in the m ed ium w ith d ifferen t chem ica l elem en ts
and d ifferen t concen tra tion of ABA
代号
Code
培养基
Medium
ABA
(mg/L)
存活率
Survival rate ( % )
株高
Height( cm)
1 MS 1 100 5140 ±1116 a
2 MS 3 100 3105 ±0162 b
3 1 /2MS2 1 100 1171 ±0140 c
4 1 /2MS2 3 100 1163 ±0156 c
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215　甘露醇及矮壮素浓度对试管苗保存效果的影响
百合试管苗在添加了不同浓度甘露醇或 CCC
的 MS培养基中保存 4个月后的株高见表 4。可以
看出在添加 20 g/L和 50 g/L甘露醇的培养基中试
管苗生长较缓慢 , 但是试管苗基部有愈伤组织生
成 , 而且植株明显玻璃化 (图版 , E) , 所以添加
10～50 g/L的甘露醇保存百合试管苗的效果不理
想 ; 同样也可以看出添加 10～40 mg/L CCC的培养
基对百合试管苗的生长没有抑制作用 (图版 , F)。
表 4　百合试管苗在添加不同浓度甘露醇或 CCC的培养基中
保存 4个月后的株高
Table 4　Height of in v itro plan tlets con served for 4 m on ths in the
m ed ium w ith d ifferen t and CCC concen tra tion of mann itol
甘露醇 Mannitol
concentration ( g/L)
株高
Height ( cm)
CCC
(mg/L)
株高
Height ( cm)
0 8150 0 8150
10 8133 10 8135
20 3100 20 8100
30 6125 30 8130
40 6175 40 8140
50 2127
216　恢复培养
上述前 4种处理保存后存活的试管苗恢复培养 1个月后均成长为正常植株 , 与正常生长的对照试
管苗相比 , 形态上没有发生变异 (图版 , G)。
217　限制生长法保存百合种质的遗传稳定性
限制生长法保存后的百合试管苗转移至正常的继代培养基上恢复生长 , 1个月后其表面形态与正
常生长的试管苗没有差异。进一步通过可溶性蛋白质、过氧化物酶同工酶及酯酶同工酶电泳条带的比
较 , 也没有发现以上各种处理保存的材料与对照植株之间的差异 (图版 , H～J)。
图版说明 : A. 含有不同浓度蔗糖的培养基中百合试管苗的生长状况 ; B. 基本成分和蔗糖浓度变化的培养基中百合试管苗的生长状
况 ; C. 含有不同浓度 ABA的培养基中百合试管苗的生长状况 ; D. 基本成分和 ABA浓度变化的培养基中百合试管苗的生长状况 ; E.
含有不同浓度甘露醇的培养基中百合试管苗的生长状况 ; F. 含有不同浓度 CCC的培养基中百合试管苗的生长状况 ; G. 限制生长保存
后的再生试管苗 ; H. 可溶性蛋白质图谱 ; I. 酯酶同工酶图谱 ; J. 过氧化物酶同工酶图谱。
Explana tion of pla tes: A. Growth of lily in the medium with different sucrose concentration; B. Growth of lily in the medium with different com2
ponents and sucrose concentration; C. Growth of lily in the medium with different ABA concentration; D. Growth of lily in the medium with differ2
ent components and ABA concentration; E. Growth of lily in the medium with different mannitol concentration; F. Growth of lily in the medium
with different CCC concentration; G. Regenerative p lants conserved by restricting growth conservation; H. Image of soluble p rotein; I. Image of
isoenzynic zymogram of esterase; J. Image of isoenzynic zymogram of peroxidase.
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3　讨论
在培养基中添加高浓度蔗糖会限制植株生长 , 故使用该方法保存百合试管苗 , 应将蔗糖浓度控制
在 50～90 g/L。在 MS或者无机元素减半的 1 /2MS培养基中添加 110～310 mg/L ABA能够保存百合试
管苗长达 11个月以上 , 植株形态未变化 , 保存后的植株保持了良好的遗传稳定性。因此 , 在培养基
中添加适量的 ABA是较为理想的保存方法 , 但在葡萄、柿等果树植物离体保存时 , 其限制生长的效
果不理想〔5, 6〕, 这可能与 ABA具有促进植株休眠和衰老的作用或各种植物生长特性有关。MS基本培
养基中仅无机大量减半对百合试管苗生长没有明显的限制作用 , 而大量元素和微量元素均减半的 MS
培养基对百合生长的抑制作用明显。可见 , MS培养基中的微量元素对百合试管苗的保存有重要影响。
因此 , 有必要进一步探索通过调整微量元素的用量来实现百合种质的中期保存。
试验结果表明 , 培养基中甘露醇浓度为 20～50 g/L时 , 百合试管苗株高变化呈抛物线型 , 这可
能与百合对抗渗透压胁迫的生理变化以及其它生理机制相关。该浓度是百合种质保存的最适浓度 , 该
现象中的确切规律和科学解释还有待于进一步探讨和验证。
限制生长保存过程中 , 部分百合试管苗出现形态上的变化 , 如基部生成鳞茎 , 植株变成紫红色 ,
根冠比明显变化等。这是植物在逆境条件下对环境刺激产生的生理变化 , 而非遗传上的变异。本试验
中限制生长保存的百合试管苗经过正常环境条件下的恢复再生培养 , 均能逆转保存时的生理变化 , 并
且经过检测在蛋白质水平上初步验证了以上方法保存的试管苗保持了良好的遗传稳定性。这与前人的
试验结果〔9〕一致。但由于试验材料生理状态不同 , 保存效果存在一定程度的不稳定。因此 , 有必要
进一步应用细胞学、生物化学及分子生物学等方法 , 从细胞结构、染色体及分子水平对其保存种质和
再生植株进行系统检测和分析 , 以获得最佳的百合种质资源限制生长法保存技术。
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