全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (1) : 30～34
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 36; 修回日期 : 2004 - 05 - 25
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (30370981, 30471188, 30400298) ; 国家 ‘863’资助项目 (2003AA207120)
利用芥蓝 ×青花菜 DH群体构建 AFL P连锁图谱
王晓武 1 　娄　平 1 　何杭军 1, 2 　杨宝军 1 　张延国 1 　赵建军 1
(1 中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081; 2 浙江大学农业与生物技术学院园艺系 , 杭州 310029)
摘 　要 : 利用青花菜 (B rassica oleracea var. ita lica) 与芥蓝 (B rassica oleracea var. alboglabra) 杂交后代
双单倍体 (DH) 群体为材料 , 通过 AFLP技术构建了一个甘蓝类作物较高密度的遗传连锁图谱。该图谱包
括 9个主要连锁群及 2个小连锁群 , 总图距 80115 cM , 含 337个 AFLP标记 , 标记间平均距离为 316 cM ,
为甘蓝类作物基因定位、比较基因组学及重要经济性状 QTL分析提供了一个框架图谱。
关键词 : 芥蓝 ; 青花菜 ; DH群体 ; AFLP; 连锁图谱
中图分类号 : S 635　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0120030205
Construction of an AFLP2based Genetic L inkage Map Using a Doubled2haplo id
(DH) Population Der ived from a Cross between Chinese Kale and Broccoli
W ang Xiaowu1 , Lou Ping1 , He Hangjun2 , Yang Baojun1 , Zhang Yanguo1 , and Zhao J ianjun1
(1 Institu te of V egetables and Flow ers, Ch inese A cadem y of A gricu ltura l Sciences, B eijing 100081, Ch ina; 2D epartm ent of Horti2
cu lture, Zhejiang U niversity, Hangzhou 310029, Ch ina)
Abstract: A high2density genetic linkage map of B rassica oleracea was constructed using AFLP markers
based on a B rassica oleracea var. a lbog labra, B rassica oleracea var ita lica F1 2derived doubled2hap loid (DH )
population with 46 lines. The map consists of 9 major linkage group s and 2 m inor group s, which includes 337
AFLP markers, and covers 80115 cM with an average genetic interval of 316 cM. This molecular marker map
could be used for genetic mapp ing and molecular marker assisted breeding of B rassica oleracea.
Key words: Chinese kale; B roccoli; Double hap loid; AFLP; L inkage map
高密度遗传连锁图谱不仅是进行数量性状位点标记研究的基础 , 也是基于图位进行克隆基因的先
决条件 , 一张良好的分子标记连锁图谱对于比较基因组学、基因定位及分子标记辅助育种具有重要的
意义。
甘蓝类 (B rassica oleracea) 作物是十字花科芸薹属重要蔬菜作物之一 , 具有多个不同类型的栽培变
种 , 虽然相互之间存在较大的遗传变异 , 但能够相互自由授粉 , 所以通过变种间杂交可获得的多态性标
记丰富的后代分离群体。目前利用甘蓝类作物杂交获得的 F2、BC1和 DH等群体已经构建了几个遗传连
锁图谱〔1～6〕, 但构建的图谱大部分存在下列的缺陷 : 一是基于 RFLP标记或不稳定的 RAPD标记构建的
连锁图谱较多 , 利用 AFLP标记构建的甘蓝类作物连锁图谱相对较少 ; 二是以往构建的甘蓝类连锁图谱
大多数是基于 F2代或 BC1代建立的临时性作图群体 , 材料不易保存和不利于国际间相互交流。
利用 DH群体构建的图谱不仅有利于对一些数量性状多年多点数据进行标记分析 , 而且有利于不
同实验室之间标记信息共享及图谱后续研究。本研究利用起源于中国的芥蓝和起源于欧洲的青花菜杂
交获得的 DH群体构建了一个较高密度的 AFLP连锁图谱。
1　材料与方法
111　材料
DH群体由英国国际园艺研究所 Graham King博士提供 , 为芥蓝 A12和青花菜 GD杂交的 F1 代经
　1期 王晓武等 : 利用芥蓝 ×青花菜 DH群体构建 AFLP连锁图谱 　
小孢子培养获得 , 选用 46个稳定遗传的 DH系构建作图群体。亲本和 DH系种子消毒后在 MS培养基
中发芽 , 长成小植株后 , 取少量叶片用于提取 DNA。
112　D NA提取
采用 CTAB微量提取法 , 用 115 mL Eppendorf管盖扣取相同大小的叶片 , 碾磨破碎 , 加 CTAB溶
液 400μL混匀 , 65℃水浴 60 m in, 加等量氯仿 13000 r/m in离心 10 m in, 取上清 200μL, 加入 400
μL无水乙醇沉淀 DNA, 后加入 100μL超纯水 , 溶解 DNA。
113　AFL P分析
参考娄平等〔7〕报道的远红外荧光 AFLP分析 , 选用远红外荧光标记 IRD 700或 IRD 800标记的
EcoR I + 3引物与 M se I + 3引物共 96对组合筛选双亲间多态性条带 , 并确认用于作图的最佳引物组合。
114　连锁分析
数据分析及连锁图构建采用 Joinmap 310版本
软件〔8〕。
2　结果与分析
211　AFL P标记亲本间多态性分析
利用 96对引物组合对双亲进行 AFLP多态性
分析 , 共扩增出 4367条带 , 每对引物平均扩增
4514条带左右 , 根据扩增多态性条带的数目、强
弱、及重复性共选择 46对引物用于遗传连锁图谱
的构建。通过 46对引物组合在群体中的选择性扩
增 , 共获得 421条多态性条带 , 平均每对引物组
合产生 9115条多态性带 , 其中引物组合 E2AAG/
M 2CAG产生多态性带最多 , 为 22条 (表 1)。
212　AFL P连锁图谱的构建
利用 Joinmap 310软件对 421个标记进行分
析 , 除 LG9以 LOD 310分组外 , 其余均以 LOD
410分组。结果 337个标记属于 9个主要的连锁
群 , 12个标记在 2个较小的连锁群上 , 84个标记
未进入任何 1个连锁群。各连锁群中标记最少的
只有 6个 , 最长的连锁群达含 57个标记 , 且各连
锁群均有零标记存在 , 最多的 1个连锁群 LG3含
18个零标记。9个主要连锁群的标记数均在 20个
以上 , 每个连锁群覆盖的基因组长度从 4412 cM
至 15719 cM , 覆盖总基因组长度为 80115 cM (表
2)。
从 DH 群体连锁图谱中可以看出 (图 1 ) ,
LG1含标记数多达 57个标记 , 长度达 15719 cM ,
标记间最大图距为 910 cM , 标记间平均距离为
319 cM; 在 9个主要连锁群中是最大的连锁群 ,
标记分布均匀 ; LG2、LG3、LG4、LG5和 LG7连
锁群标记位点数均在 20个以上 , 每个连锁群覆盖
基因组长度 70 cM以上 , 标记分布较均匀 , 但两
表 1　芥蓝 ×青花菜 D H群体 AFL P分析引物组合筛选
Table 1　Screen ing pr im er com b ina tion s for AFL P ana lysis w ith
D H popula tion from a cross between Ch inese ka le and broccoli
引物组合
Primer combinations
多态性条带
Num. markers
引物组合
Primer combinations
多态性条带
Num. markers
E2AAA /M2CAA 4 E2ACA /M2CAT 13
E2AAA /M2CAC 10 E2ACA /M2CCA 3
E2AAA /M2CAG 19 E2ACA /M2CCT 7
E2AAA /M2CAT 11 E2ACG/M2CAA 6
E2AAA /M2CCA 14 E2ACG/M2CAC 4
E2AAA /M2CCC 4 E2ACG/M2CAG 1
E2AAC /M2CAA 12 E2ACG/M2CAT 7
E2AAC /M2CAC 14 E2ACT/M2CAA 4
E2AAC /M2CAG 13 E2ACT/M2CAC 7
E2AAC /M2CAT 7 E2AAG/M2CCA 13
E2AAC /M2CCA 14 E2AAG/M2CCC 12
E2AAC /M2CCC 6 E2AAG/M2CTC 15
E2AAC /M2CCT 7 E2AAG/M2CTG 8
E2AAG/M2CAA 14 E2AAG/M2CTT 14
E2AAG/M2CAC 15 E2AAT/M2CAC 11
E2AAG/M2CAG 22 E2ACT/M2CAT 5
E2AAT/M2CAG 9 E2ACT/M2CGT 2
E2AAT/M2CAT 7 E2ACT/M2CTT 8
E2ACC /M2CAC 5 E2AGC /M2CAA 9
E2ACC /M2CAG 7 E2AGC /M2CAC 9
E2ACC /M2CAT 7 E2AGC /M2CAG 9
E2AAG/M2CAT 7 E2AGC /M2CAT 8
E2ACA /M2CAC 8 E2AGC /M2CCA 10
表 2　D H群体遗传图谱中各连锁群标记数及图距
Table 2　M arker num ber and map d istance per linkage
group of the D H popula tion
连锁群
L inkage
group
标记数 (位点数 )
Num. markers
( loci)
图距
Length
( cM)
平均图距
Mean
length
LOD
LG1 57 (40) 15719 319 410
LG2 42 (27) 9819 317 410
LG3 41 (23) 7116 311 410
LG4 38 (26) 10119 319 410
LG5 37 (23) 8415 317 410
LG6 32 (18) 4412 215 410
LG7 31 (25) 7912 312 410
LG8 25 (17) 5812 314 410
LG9 22 (16) 6513 410 310
LG10 　6 (5) 2711 514 410
LG11 　6 (4) 1217 312 410
总计 Total 337 (224) 80115 316
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端标记分布密度较稀 ; 连锁群 LG6、LG8和 LG9相对较小 , 分别覆盖 4412 cM、5812 cM与 6513 cM;
另外还有两个小连锁群 , 各包含 6个标记 , 长度为 2711 cM和 1217 cM。
图 1　芥蓝 ×青花菜 D H群体 AFL P遗传图谱
连锁群右 : 各标记的位点 ; 左 : 摩尔根图距 ( cM) ; LG1～LG11: 连锁群 1～11。
F ig. 1　The linkage map of the D H popula tion der ived from B rassica o leracea var. ita lica ×B rassica o leracea var. a lboglabra
L inkage group s are numbered LG1 through to LG11; Markers are indicated at the right of each linkage group. Recombination distances are
in Kosambipis cM and indicated at the left of each linkage group.
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　1期 王晓武等 : 利用芥蓝 ×青花菜 DH群体构建 AFLP连锁图谱 　
213　AFL P标记在遗传图谱上的分布特点
连锁图谱中存在多个标记簇与空隙。共有 65个标记为超过 4个标记、大小不等的簇 , 分布在第
1、2、3、4、5、6和 9连锁群中。其中最大的标记簇包含 10个不同标记 , 位于第 3连锁群 50 cM处。
与标记簇相反 , 部分连锁区域标记密度则较低 , 许多的连锁群存在大小不等的空隙 , 超过 10 cM以上
的空隙存在于连锁群 LG1、LG3、LG4、LG7、LG8、LG9中。其中最大空隙为 22 cM , 位于第 4连锁
群标记 E40M4723与标记 E32M4821之间。
利用 Joinmap软件对标记的偏分离进行分析 , 79%的标记在群体中符合 1∶1 ( P < 0105) 的分离
比例 , 而 21%的条带呈现不同程度的偏分离。在偏分离的条带中 , 41条带偏向青花菜亲本而 46条带
偏向芥蓝亲本。在连锁图中存在 1个异常分离热点 , 与第 6连锁群 28 cM处的标记簇对应 , 该标记簇
中 9个标记中有 6个为偏分离标记。
3　讨论
本研究采用了荧光 AFLP技术筛选了 96对 E + 3、M + 3引物组合 , 获得了大量新的 AFLP标记 ,
显著地增加了甘蓝类作物分子遗传图谱的标记密度。Sebastian等〔9〕报道了利用两个不同甘蓝类作物的
分子标记图谱整合形成的高密度图谱 , 该图谱标记密度达到 441个标记。其中使用了 8对 E + 2、M +
3的 AFLP引物对 , 获得了 212个 AFLP标记。本研究由于使用了不同的 E + 3、M + 3引物组合 , 这些
组合获得的大量新标记可以通过图谱整合 , 增加原有图谱的标记密度 , 预计整合后的遗传图谱标记数
将超过 600个。
构建甘蓝类高密度遗传图谱是芸薹属基因组学、比较基因组学研究的重要内容之一 , 评价遗传图
谱质量的 1个重要指标就是图谱对所研究植物基因组的覆盖情况。在甘蓝类作物以往遗传连锁图研究
中 , Slocum等〔6〕利用 F2 群体构建的 B. oleracea图谱 , 有 258个 RFLP标记 , 覆盖 820 cM; Kinnian等
利用亚种间杂种构建了 B. oleracea图谱 , 得到了 92个 RFLP标记 , 16个同工酶标记 , 覆盖基因组长
度 747 cM; Camargo等〔1〕构建 159个 RFLP标记 , 长度为 921 cM的 B. oleracea连锁图。本研究采用
DH的群体目前已经成为国际上共享的永久性群体 , 围绕该群体一些连锁图谱构建及基因定位工作已
经展开。Sebastian等〔9〕报道的整合后的甘蓝类连锁图谱长约 890 cM; 本研究利用 AFLP标记构建了具
有 337个标记 , 覆盖 80115 cM的遗传连锁图 , 与已报道的 B. oleracea的连锁图覆盖的基因组长度基
本吻合。
AFLP标记在构建连锁图中具有信息量丰富的特色 , 但基于 AFLP标记构建遗传连锁图同样存在
标记分布不均匀的问题 , 在获得的 9个主要连锁群中 , AFLP标记经常以标记簇形式分布于连锁群的
中间或两头 , 这种现象在番茄、大麦、玉米、甜菜、马铃薯、大豆等其它图谱中均有报道 , 可能与该
位置接近着丝点或异染色质区有关 ; 与标记簇相反 , 在连锁群的两端存在大小不等的空隙 , 可能该区
域该染色体区段有较高水平重组发生或 EcoR I与 M se I内切酶切点较少的缘故。对这样的空隙需要更
多 AFLP引物组合或使用不同的酶切组合 , 如 Pst I和 M se I酶切组合去填充 , 或选用其他类型的标记 ,
如 SSR标记和 RFLP标记等。熊立仲等在水稻连锁图谱构建中也发现标记簇分布的现象 , 并提出
AFLP标记分布在染色体两端且认为 AFLP标记对图谱中较大空白的补空功能有限〔10〕。本研究结果显
示并未有标记集中在两端的现象 , 可能是与所选引物组合的基因组倾向性有关 , 但并不能说明 AFLP
标记填补空白作用有限。标记簇的存在虽然降低了 AFLP标记构建图谱的高效性 , 但另一方面位点相
同的 AFLP标记为进一步筛选共显性标记提供了基础 , 通常此类位点具有不同连锁相的 AFLP标记可
以作为共显性标记使用。
偏分离现象普遍存在遗传连锁图谱中 , 目前研究认为产生偏分离的主要原因决定于孢子体及配子
体的选择 , 目前在水稻中已经定位了 11个导致偏分离的雄配子体基因 , 在玉米中也定位了 5个配子
体基因。标记在连锁图中偏分离的比例一般在 618% ～3118%之间 , 这与所用标记类型及选用群体相
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关 , 本研究中采用双单倍体群体 , 其偏分离很可能与花药培养反应能力有关 , 在花药培养过程中 , 通
常标记易于偏向高反应能力的亲本。
通常情况下群体越小 , 图谱距离精度越低 , 图谱的分辨率则越差。作图群体的大小主要决定于可
检测到最大图距、两个标记间可分辨的最小图距及有效位点率和作图位点率。理论上作图群体大 , 产
生各种偏分离位点的概率越小 , 因而有效位点率就越高 , 同样作图位点率也会随之增大。试验中虽然
只有 46个 DH株系 , 但由于挑选株系时基于该群体 RFLP图谱的基础上 , 能够以较高的频率检测出交
换单株 , 能够满足构建框架图谱的需要。
将遗传连锁图谱群与经典遗传图联系起来 , 并将其归属到相应的染色体上 , 是构建一个比较饱和
的连锁图谱的重要工作。该图谱建成后 , 可进一步利用该群体已知信息将目标连锁群进行相应染色体
定位 , 定位后对连锁群体中一些重要经济性状及植物学性状的调查 , 可以进一步对一批重要基因或
QTL主效基因进行染色体定位 , 同时还可通过与双亲回交后建立不同的质量性状基因或 QTL的近等
基因系 , 进而对这些基因进行精细定位。
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更正 果树的 “变则主干形 ”
“变则主干形 ”是果树专业特有名词 , 指果树冬季修剪时的主要树形之一 , 其特点是主枝沿中心干错落着生 (一
般 4～5个主枝 , 待主枝配备完成后 , 常将原中心干的延长头 “落头 ”)、不分层。常用于干性较强的核桃、板栗、
柿、枣等果树。已发表的 “完全甜柿新品种 ‘鄂柿 1号 ’”〔2004, 31 (5) : 699〕中 “冬季则变为主干形整形 ”应为
“冬季变则主干形整形 ”。
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