全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 437 - 442
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 01 - 10; 修回日期 : 2007 - 03 - 01
基金项目 : 北京市自然科学基金项目 (6042015) ; 国家 ‘863’计划项目 (2006AA10Z187)3 同等贡献作者
百合 L f MADS基因植物表达载体的构建及其功能分析
赵印泉 1, 23 , 弥志伟 13 , 刘青林 1
(1 中国农业大学观赏园艺与园林系 , 北京 100094; 2 四川省绵阳师范学院生命科学与工程系 , 四川绵阳 621000)
摘 　要 : 为了分析百合 LfMADS1和 L fMADS3基因的功能 , 分别将其正、反义基因插入到植物组成型双
元载体 pB in438中 , 并通过根癌农杆菌 LBA4404介导转化烟草。PCR和 PCR2Southern杂交结果均证明外源
基因已经插入到烟草基因组中。转 L fMASD1反义基因植株中 1朵花的雄蕊极短、花药缺失 ; 转 LfMASD1正
义基因植株中发现 1个花萼变瓣的突变体。在转 L fMASD3反义基因植株中发现 1个植株的苞叶部分瓣化 ,
花柄变短 , 另外 1个植株上发现 1朵花缺失 1枚雄蕊 ; 而转 LfMASD3正义基因植株中没有发现变异。作者
认为 LfMASD1是百合花器官发育的 B功能基因 , LfMASD3是百合花器官发育的 SEP基因 , 这些基因在烟草
中的表现说明百合的花器官特性基因的表达模式与模式植物有所不同。
关键词 : 百合 ; L fMADS基因 ; 载体构建 ; 功能分析
中图分类号 : S 68212　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220437206
Con struction of Expression Vector and Function Ana lysis of L fM ADS Genes
from L ilium
ZHAO Yin2quan1, 23 , M I Zhi2wei13 , and L IU Q ing2lin1
(1D epartm ent of O rnam ental Horticulture and Landscape A rchitecture, China A gricultural U niversity, B eijing 100094, China;
2D epartm en t of L ife Science and Engineering, S ichuan M ianyang N orm al College, M ianyang, S ichuan 621000, Ch ina)
Abstract: In order to analyse the function of L fMADS1 and L fMADS3 from lily, their sense and antisense
p lant exp ression vectors were constructed by inserting into the pB in438 p lasm id vector, and then transformed
into tobacco by A grobacterium tum efaciens LBA4404. The results of PCR and PCR2Southern for transgenic
p lants showed that the foreign genes were introduced into the tobacco genome. Ectop ic exp ression of antisense
35S: : L fMADS1 in tobacco p roduced one of stamen truncated with anther; while the transformed tobaccoswith
sense 35S: : L fMADS1 generated a mutant in which partial sepal was converted into petal. One of the trans2
genic tobaccos with antisense 35S: : L fMADS3 showed novel phenotype by converting partial bracts into petal,
another one had a flower short of one stamen; while the transgenic tobaccos with sense 35S: : L fMADS3 were
morphologically indistinguishable from wild type. The p relim inary results suggested that L fMADS1 belongs to B
function gene, and L fMADS3 is a SEP2like gene. In comparison to the exp ression of other flower organ identity
genes in model p lants, a different gene exp ression pattern could be involved in L ilium.
Key words: L ilium ; L fMADS; Construction of exp ression vector; Function analysis
百合传统的杂交育种年限长 , 引入某一优良性状的同时往往伴随一些不良性状 , 分子育种有望定向
改良百合性状 , 受到越来越多的重视。其中对花器官发育相关基因的分离与转化 , 是创造新花型的可能
途径。百合花器官发育相关的基因 , 如 B功能基因 LMADS1 ( Tzeng & Yang, 2001)、LRDEF、LRGLOA、
LRGLOB (W inter et al. , 2002) , C功能基因 LLAG1 (Benedito et al. , 2004c) , D 功能基因 LMADS2
(Tzeng et al. , 2002) , E功能基因 LMADS3、LMADS4 ( Tzeng et al. , 2003)、LLSEP3 (Benedito et al. ,
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2004a) 等 , 已经被分离和鉴定。张云等 (2004) 从百合中分离得到了多个花发育相关的 cDNA片段。
为了鉴定其中 LfMADS1和 LfMADS3基因的功能 , 本试验构建了 LfMADS1和 L fMADS3基因的正、反义植
物表达载体 , 并通过根癌农杆菌介导转化烟草 , 对转基因植株的表型变异进行了分析。
1　材料与方法
111　质粒、工具酶和试剂盒
L fMADS1和 L fMADS3的 cDNA由张云克隆并保存在 pGEM 2T Easy载体质粒中。大肠杆菌 ( Esche2
rich ia coli) 菌株 JM109, 质粒 pB in438, A grobacterium tum efaciens LBA4404由中国科学院微生物研究所
植物基因组学国家重点实验室保存。pGEM 2T Easy载体质粒、T4 DNA连接酶和 RNase A为 Promega
公司产品 ; 各种 DNA限制性内切酶为 TaKaRa公司产品 ; 质粒快速提取试剂盒、DNA快速纯化和回
收试剂盒购自上海博能申彩公司 ; D ig H igh Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II购自 Roche
公司 ; 引物由上海 B ioA sia生物技术有限公司合成。
112　植物表达载体的构建
为了构建 LfMADS1和 LfMADS3的正义和反义表达载体 , 根据 LfMADS1和 LfMADS3克隆序列
(GeneBank序列号 : AY829227, AY826062) 和 pB in438载体质粒上酶切位点 , 分别设计了特异性引物
Z1 (5′CGGGATCCAGCATGAATCTTAACAGAG 3′)和 Z2 (5′CAGATTCAGCATAAAACCAC 3′) ; Z3 (5′CGG2
GATCCAAGGACAGTTGACTATCTG 3′)和 Z4 (5′CCAGTCAATTACAAACACTC 3′) ; F1 (5′GCGTCGACTAGAC2
TAGCTGAA ACAAC3′) 和 F2 ( 5′CGGGATCCAGATTCAGCATAAAACCAC 3′) ; F3 ( 5′GCGTCGACT
GCTCTAGTCAGCACAAAG 3′)和 F4 ( 5′CGGGATCCTCAAGAGCCTCATTACATC 3′)。以 pGEM2T Easy Lf2
MADS1和 LfMADS3的质粒 DNA为模板 , 分别进行 PCR扩增得到目的片段。PCR条件为 94℃变性 4
m in; 94℃变性 45 s, 57℃复性 45 s, 72℃延伸 45 s, 30个循环 ; 最后 72℃延伸 10 m in。分别从 PCR扩增
产物中纯化 500 bp和 400 bp左右的片段 , 纯化后扩增产物与 pGEM2T Easy vector载体连接 , 电击转化大
肠杆菌 JM109, 经蓝白斑初步筛选后 , 用 PCR、酶切和测序鉴定。测序结果正确的 pGEM2T Easy Lf2
MADS1和 LfMADS3正、反义基因质粒用 B am HⅠ和 SalⅠ分别酶切 , 回收 500 bp和 400 bp左右的片段与经
同样酶切的 pB in438质粒载体连接 , 电击法转化后挑取重组质粒用 B am HⅠ和 SalⅠ双酶切鉴定。得到的
LfMADS1和 LfMADS3的正、反义植物组成型表达载体 , 电击法导入根癌农杆菌 LBA4404中。
113　烟草的转化、PCR和 PCR2Southern杂交、移栽和表型观测
试验材料 ‘SR1’烟草 (N icotiana tabacum ‘SR1’) 为中国科学院微生物研究所植物基因组学国
家重点实验室保存。烟草转化和再生参考李太元等 (1994) 的方法进行。抗性烟草植株长至 2～3 cm
高时 , 进行 PCR检测。烟草叶组织 DNA提取采用 CTAB法 , 以提取的烟草 DNA为模板 , 相应的特异
性引物进行 PCR扩增 , 同时设水、阳性和野生型烟草作为对照 , PCR反应条件与构建载体时扩增的
条件一致。转基因烟草组培苗的根长到 2 cm左右时 , 移至苗盘中 , 置光照培养箱中 , 白天 26℃, 夜
间 20℃, 光照 16 h。观察转基因烟草开花时间、营养器官和花器官的表型变异。
因为花器官的变异 , 只收获了产生变异的转 LfMADS1和 LfMADS3反义基因的烟草植株的种子。播
种于不添加激素和抗生素的 MS培养基上 , 1个月后取不同植株上的叶片提取基因组 DNA进行以地高辛标
记的 PCR2Southern检测。PCR过程中设置阳性、水和野生型烟草作为对照。操作过程参照产品说明进行。
2　结果与分析
211　L fM AD S1和 L fM AD S3植物表达载体的构建
构建了正、反义的植物表达重组质粒 pL fMADS1和 pL fMADS3, 长度均为 13 kb左右 (图 1、图
2) , 并将质粒转化入根癌农杆菌 LBA4404。
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　2期 赵印泉等 : 百合 L fMADS基因植物表达载体的构建及其功能分析 　
图 1　pL fMADS正反义基因质粒构建示意图
F ig. 1　Con struction of expression vector pL fMADS sen se and an tisen se
图 2　质粒 pL fMADS1和 pL fMADS3的 B am H I和 Sa l I双酶切鉴定
M: Gene ruler TM DNA ladder m ix; 1. pLfMADS1正义基因酶切 ; 2. pLfMADS3正义基因酶切 ;
3. pLfMADS1反义基因酶切 ; 4. pLfMADS3反义基因酶切。
F ig. 2　Electrophoreses map of pL fMADS1 and pL fMADS3 after d igested w ith B am H I and Sa l I
M: Gene ruler TM DNA ladder m ix; 1. pLfMADS1 sense; 2. pLfMADS3 sense;
3. pLfMADS1 antisense; 4. pLfMADS3 antisense.
212　烟草遗传转化与 PCR检测、PCR2Southern检测结果
经过农杆菌 LBA4404介导分别得到转正义 L fMADS1和 L fMADS3的 T1代烟草 48和 33株 , 转反义
L fMADS1和 L fMADS3的 T1代烟草 42和 36株。
PCR检测结果显示的条带大小与目的基因大小一致 (图 3) , 初步表明外源基因已经转入烟草 ,
PCR阳性植株占抗性植株的比例分别为 98%、89%、91%和 95%。
图 3　转 L fMAD S1基因 (左 1～8) 和 L fMADS3 (右 1～8) 基因烟草 PCR检测
M: 200 bp ladder分子量标记 ; 1～5. 转基因烟草 ; 6. 阳性对照 ; 7. 野生型烟草 ; 8. 水对照。
F ig. 3　PCR am plif ica tion of L fMAD S1 ( left 1 - 8) and L fMADS3 ( r ight 1 - 8) from tobacco genom ic D NA
M: 200 bp DNA ladderM ix; 1 - 5. Transgenic tobacco; 6. LfMADS1 vector ( left) ,
LfMADS3 vector ( right) ; 7. Nontransgenic tobacco; 8. H2O.
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播种烟草种子得到转基因烟草第 2代 ( T1) 植株 , 取 T1代叶片基因组 DNA进行 PCR2Southern
检测 , 结果表明外源基因 L fMADS1和 L fMADS3确实已经转入烟草基因组 DNA, 并在基因分离的基础
上能够稳定遗传 (图 4)。因为未添加抗生素 , 不含外源基因的 T1代烟草部分植株也能正常存活。所
以在检测结果中也出现了阴性植株。
图 4　转反义 L fMADS1基因 (左 ) 和反义 L fMADS3 (右 ) 基因 T1代烟草 PCR2Southern检测
1、9. 反义 LfMADS1和反义 LfMADS3阳性对照 ; 2, 10. 水对照 ; 3, 11. 野生型烟草 ;
4～8 . T1代反义 LfMADS1转基因烟草 ; 12～16. T1代反义 LfMADS3转基因烟草。
F ig. 4　PCR2Southern of L fMADS1 an tisen se gene ( left) and L fMADS3 an tisen se gene ( r ight) from T1 tobacco genom ic D NA
1, 9. LfMADS1 antisense vector and LfMADS3 antisense vector; 2, 10. H2O; 3, 11. Nontransgenic tobacco;
4 - 8. T1 transgenic tobaccos with LfMADS1 antisense; 12 - 16. T1 transgenic tobaccos with LfMADS3 antisense.
213　转基因烟草表型变异与分析
转 L fMADS1反义基因的阳性开花植株中发现其中 1朵花中雄蕊变的极短 , 并且花药缺失 (图 5,
B)。这种雄蕊异常现象 , 可能是 L fMADS1反义基因对内源基因的抑制所致。因为从 ABC模型中 3类
基因表达模式来看 , 在雄蕊 (第 Ⅲ轮 ) 中表达的主要是 B或 C功能基因 , B功能基因的缺失会使雄
蕊变为心皮 (第 Ⅳ轮 ) , C功能基因的缺失会使雄蕊变为花瓣 (第 Ⅱ轮 )。
图 5　转基因烟草花器官变异表型
A. 野生型烟草 ; B. 转 LfMADS1反义基因花药缺失 ; C. 转 LfMADS1正义基因花萼瓣化 ; D. 转 LfMADS3
反义基因雄蕊部分缺失 ; E. 转 LfMADS3反义基因苞叶瓣化正面图 ; F. 转 LfMADS3反义基因苞叶瓣化反面图。
F ig. 5　The m uta tion phenotypes of tran sgen ic tobacco flora l organ s
A. W ild tobacco; B. Phenotypes of the stamen truncated with anther by exp ression of 35S: : LfMADS1 antisense; C. Phenotypes of the
partial sepal converted into petals by exp ressing 35S: : LfMADS1 sense; D. Phenotypes of the flowers truncated stamen by exp ression of 35S: :
LfMADS3 antisense; E. Obverse phenotypes of the partial bracts converted into petals by exp ressing 35S: : LfMADS3 antisense; F. Inverse
phenotypes of the partial bracts converted into petals by exp ressing 35S: : LfMADS3 antisense.
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　2期 赵印泉等 : 百合 L fMADS基因植物表达载体的构建及其功能分析 　
在转 L fMADS1正义基因的阳性开花植株中发现 1个花萼与花瓣嵌合的花朵 , 嵌合体部分具有花
瓣的特征 (图 5, C) , 这种花瓣和花萼的嵌合体现象 , 只可能是 B功能基因在第 Ⅰ轮的异位表达所
致。从转 L fMADS1正、反义基因的烟草表型变异来看 , 推测 L fMADS1为百合花发育的 B功能基因 ,
而非序列分析表明的 C功能基因 (张云 等 , 2004)。
在转 L fMADS3反义基因阳性植株中发现 1株的 1枚雄蕊完全缺失 (图 5, D ) , 另外 1株苞叶部
分瓣化 , 花柄变短 (图 5, E、F)。在转 L fMADS3正义基因的阳性植株中没有发现变异现象。苞叶发
生瓣化 , 是营养器官向生殖器官过渡的现象 , 表明 L fMADS3基因既能够在营养分生组织又能够在花
分生组织中发挥作用。迄今为止已经分离的花发育相关基因中 , 能够在营养分生组织和花分生组织中
都表达的只有 E功能基因 ; 而 1株转基因烟草的 1枚雄蕊完全缺失 , 可能是因为缺少了 E功能基因
的参与 , 雄蕊无法正常形成。结合序列分析的结果 (张云 等 , 2004) , 我们认为 L fMADS3为 SEP基
因的同源基因。
3　讨论
311　百合 L fM AD S1可能属于 B功能基因而非 C功能基因
对 L fMADS1基因序列分析的结果表明 , 该基因为 AG同源基因 (张云 等 , 2004) , 但未能在转基
因烟草的表型变异中得到证实。目前已经分离得到的百合 AG同源基因有 LLAG1, 其在拟南芥中的异
位表达导致外两轮花器官的变异 , 比如花萼上具有雌蕊柱头的乳突 , 一些植株的第 Ⅱ轮花器官完全转
变为雄蕊 , 类似 ap2强突变体 (Benedito et al. , 2004c)。
转 L fMADS1正义基因导致 1株烟草的花萼部分瓣化 , 转 L fMADS1反义基因造成 1株烟草的雄蕊
部分缺失 , 与 LLAG1基因在拟南芥中的表现有所不同 , 反而更接近理论上 B功能基因的作用。因为
在百合中 , B功能基因在花萼、花瓣和雄蕊 Ⅲ轮花器官中表达 (Benedito et al. , 2004b) , 假设 L f2
MADS1基因为 B功能基因 , 其异位表达可以造成花萼瓣化 , 其缺失或突变会导致雄蕊的不健全。
目前已知的 B功能基因有 A P3同源基因 LMADS1, 缺少 MADS box区的 LMADS1 cDNA在拟南芥
上异位表达导致了花瓣萼化和雄蕊转变成雌蕊状 , 类似 ap3强突变体 , 酵母双杂交的结果表明这段不
完整的 cDNA可以与拟南芥的 B功能基因如 P I形成二聚体 , 从而抑制 B功能基因的表达 , 可能属于
一种比较原始的基因调节形式 ( Tzeng & Yang, 2001)。本试验中构建的植物表达载体 pL fMADS1也只
截取了 L fMADS1基因中第 249～745 bp之间的区域 , 缺少 MADS box区和部分 C区序列 , 但却发挥了
B功能基因的功能 , 其作用机制还有待进一步的研究。
312　百合 L fM AD S3属于 E功能基因
对 L fMADS3序列分析的结果表明 , 该基因为 S EP同源基因。SEP同源基因在叶转变成花器官的
过程中起了重要的作用 , 拟南芥 S EP1、SEP2、SEP3三突变体的所有花器官均被花萼取代 , 花分生
组织失去终止性 ( Goto et al. , 2001)。S EP同源基因属于 E功能基因 , 目前已经分离得到的百合 E功
能基因有 LMADS3、LMADS4和 LLSEP3, 其中转 LMADS3的拟南芥植株开花时间提早 , 花分生组织失
去终止性 , 转 LMADS4的拟南芥无变化 ( Tzeng et al. , 2003) ; 转 LLS EP3的拟南芥提早开花 (Benedi2
to et al. , 2004a) , 但三者都未发生花器官的同源异型变化。
本试验中构建的植物表达载体 pL fMAD3截取了 L fMADS3第 249～623 bp之间的区域 , 缺失 MADS
box区和部分 C区。与 LMADS3和 LLS EP3转基因植株的表型不同 , 转 L fMASD3反义基因的烟草植株
中 , 1株的苞叶发生部分花瓣化 , 另外 1株缺失 1枚雄蕊 , 这可能与花瓣、雄蕊和雌蕊的表达都需要
S EP基因的参与有关 ( Goto et al. , 2001)。
313　百合花器官发育基因的表达不同于典型 ABC模型
在 ABC模型中 , 任何一个花器官基因发生突变 , 就会导致相邻的两轮花器官发生变异。百合花
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器官发育基因的表达模式比较独特 , 其花朵在第 Ⅰ和第 Ⅱ轮没有明显区别 , 花瓣和花萼通称花被片 ;
Benedito等 (2004b) 在麝香百合上发现了独特的突变体 festiva , 其花朵中雄蕊瓣化而其他花器官没有
任何改变。这似乎可以解释 L fMADS1和 L fMADS3正、反义基因转化的烟草中为什么仅有 1轮花器官
发生了变化。而且这种仅 1轮花器官发生变异的现象在其他转基因花卉中也曾有发现 (M izukam i &
Ma, 1995; Yang et al. , 2003)。
经序列比较和表型变异分析我们推断 L fMADS3是百合的 SEP同源基因 , 而 L fMADS1更倾向是 B
功能基因。下一步的试验中我们会将 LMADS1和 L fMADS3的正、反义基因植物表达载体甚至构建双
向植物表达载体通过农杆菌或基因枪技术转化到百合中 , 期望能够确认基因功能 , 并且获得表型变异
丰富的转基因百合 , 为百合育种提供更多的种质资源。
References
Benedito V A, V isser P B, Angenent G C, Krens F A. 2004a. Overexp ression of aMADS2box gene from L ilium longiflorum homologous to SEPA2
LLATA3 is able to induce early flowering in A rabidopsis. In: Zhang Q i2xiang ed. Advances in O rnamental Horticulture of China. Beijing:
China Forestry Press: 172 - 180.
Benedito V A, Angenent G C, van Tuyl J M. 2004b. L ilium longiflorum and molecular floral development: the ABCDE model. Acta Hort. , 651:
83 - 89.
Benedito V A, V isser P B, van Tuyl J M, Angenent G C, de V ries S C, Krens F A. 2004c. Ectop ic exp ression of LLAG1, an AGAMOUS homo2
logue from lily (L ilium longiflorum Thunb. ) , cause floral hometic modification in A rabidopsis. Journal of Experimentsl Experimental Botany,
55 (401) : 1391 - 1399.
Goto K, Kyozuka J, Bowman J L. 2001. Turning floral organs into leaves, leaves into floral organs. Current Op inion in Genetics & Development,
11: 449 - 456.
L i Tai2yuan, Tian Ying2chuan, Q in Xiao2feng, Mang Ke2qiang, L iW en2gu, He Yong2gang, Shen Lei. 1994. Study on high effective insect2re2
sistant tobacco. Science in China ( Series B) , 37: 1479 - 1488. ( in Chinese)
李太元 , 田颖川 , 秦晓峰 , 莽克强 , 李文谷 , 何永刚 , 沈　蕾. 1994. 高抗虫性的转基因烟草研究. 中国科学 (B辑 ) , 37: 1479
- 1488.
M izukam i Y, Ma H. 1995. Separation of AG function in floral meristem determ inacy from that in rep roductive organ identity by exp ressing anti2
sense AG RNA. PlantMolecular B iology, 28: 767 - 784.
Tzeng T Y, Chen H Y, Yang C H. 2002. Ectop ic exp ression of carpel2specific MADS box genes from lily and lisianthus causes sim ilar homeotic
conversion of sepal and petal in A rabidopsis. Plant Physiol, 130: 1827 - 1836.
Tzeng T Y, H siao C C, Chi P J, Yang C H. 2003. Two lily SEPALLATA2like genes cause different effects on floral formation and floral transiton
in A rabidopsis. Plant Physiology, 133 (3) : 1091 - 1101.
Tzeng T Y, Yang C H. 2001. A MADS box gene from lily (L ilium longiflorum ) is sufficient to generate dom inant negative mutation by interacting
with P ISTILLATA ( P I) in A rabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol. , 42 (10) : 1156 - 1168.
W inter K U, W eiser C, Kaufmann K, Bohne A, Kirchner C, Kanno A, Saedler H, TheiBen G. 2002. Evolution of class B floral homeotic p ro2
teins: obligate heterodimerization originated from homodimerization. Mol. B iol. Evol. , 19: 587 - 596.
Yang Y Z, Xiang H J, Jack T. 2003. Pistillata25 an A rabidopsis B class mutant with strong defects in petal but not in stamen development. Plant
Journal, 33: 177 - 188.
Zhang Yun, L iu Q ing2lin, Ouyang Q ing, CaiW en2qi. 2004. Cloning of flower development associated MADS box gene fragments in L ilium. Acta
Horticulturae Sinica, 31 (3) : 332 - 336. ( in Chinese)
张　云 , 刘青林 , 欧阳青 , 蔡文启. 2004. 百合花发育相关 MADS box基因的克隆. 园艺学报 , 31 (3) : 332 - 336.
244
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