全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 艺 学 报 2004 , 31 (1) : 25～28
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2003 - 05 - 22 ; 修回日期 : 2003 - 08 - 25
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (010118)
荔枝胚败育差异表达基因 cDNA 片段的克隆及序列
分析
张以顺1 向 旭2 傅家瑞1 黄上志1
(1 中山大学生命科学学院 , 广州 510275 ; 2 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640)
摘 要 : 利用抑制消减杂交 (Suppressive subtraction hybridization , SSH) 克隆荔枝败育胚的差异表达基因
cDNA 片段。分别以荔枝‘桂味’正常发育胚为 driver (驱赶子) , 败育胚为 tester (检测子) , 建立差异表达
cDNA 文库 , 代表桂味败育胚特异表达的 cDNA。经 Virtual Northern 检测 , 在桂味正常发育胚/ 败育胚差异表
达 cDNA 文库中得到 3 个阳性克隆 , 序列分析表明这 3 个克隆对应的两个序列在荔枝中为首次报道。
关键词 : 荔枝 ; 败育胚 ; 抑制消减杂交 (SSH) ; Virtual Northern blot
中图分类号 : S 66711 文献标识码 : A 文章编号 : 05132353X (2004) 0120025204
Cloning and Sequencing of cDNA Fragments Differentially Expressed between
Aborted and Normal Development Embryo in Litchi
Zhang Yishun1 , Xiang Xu2 , Fu Jiarui1 , and Huang Shangzhi1
(1 Life Science School , Zhongshan University , Guangzhou 510275 , China ; 2 Pomology Institute , Guangdong Academy of Agricultural
Science , Guangzhou 510640 , China)
Abstract : The suppressive subtraction hybridization (SSH) technique was used to clone the cDNA fragments
differentially expressed between aborted and normal development embryo of‘Guiwei’varieties. One positive differ2
ential expressing cDNA library were constructed using cDNAs of normal development embryo of Guiwei as driver and
the cDNAs of aborted embryo of Guiwei varieties as tester. This cDNA library indicated the differential expressing
cDNA fragments in Guiwei aborted embryo and Guiwei normal development embryo. By Virtual Northern blots , 3
positive clones were obtained. Subsequently sequencing analysis showed the 3 clones were corresponding 3 knew
gene sequence and the 3 cDNA fragments were first reported in litchi varieties.
Key words : Litchi ; Aborted embryo ; Suppressive subtraction hybridization (SSH) ; Virtual Northern blot
荔枝胚胎发育有正常型、败育型和部分败育型 3 类。有学者认为 , 荔枝不同类型的胚胎发育状况
是可遗传性状 , 由一个多基因系统所支配〔1〕。有关荔枝胚胎发育及胚败育的研究 , 过去大多集中在对
整体和细胞的形态描述上 , 至于生理生化机制及分子生物学方面的研究近年来已有一些报告〔2～5〕, 但
对荔枝胚胎败育相关基因的研究 , 目前国内外尚未见报道。本试验的主要目的是利用抑制消减杂交技
术 (SSH) 克隆与荔枝胚败育相关的差异表达基因 , 为进一步对荔枝胚败育的研究提供基因水平上的
依据。
1 材料与方法
111 材料及胚总 RNA的提取
供试荔枝品种‘桂味’取自广东省农业科学院果树研究所大丰基地荔枝园 , 为 7～9 年生正常挂
果果树。在盛花期选择花量较大、花穗健壮的单株 , 挂牌记录各花穗的雌花开放期 , 取谢花后 20 d
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的幼果 , 置冰壶中带回实验室 , 于 - 20 ℃低温冰箱保存备用。
SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 和 CLONTECH PCR2SelectTM cDNA Subtraction Kit 购自 CLONTECH公
司 ; ExTaq DNA 聚合酶购自 Takara 公司 ; p GEM○R - T Vector 购自 Promega 公司 ; 3 S Total RNA Miniprep
Super Kit 购自上海博彩生物科技有限公司 ; 标记试剂盒购自 Sigma 公司 ; 〔α- 32P〕dCTP 购自北京亚辉
生物医学公司 ; 转化受体 DH5α为本实验室保存 ; 尼龙膜购自 Sigma 公司。
剥取正常发育胚和败育胚 , 分别用 3 S Total RNA Miniprep Super Kit 提取 , 具体操作参照说明书进
行。提取完成后 , 样品 RNA 用紫外分光光度计及甲醛变性凝胶检测 , - 70 ℃下保存备用。
112 SMART cDNA合成、抑制消减杂交及 PCR产物克隆
正常发育胚及败育胚的 SMART cDNA 参照 CLONTECH SMARTTM PCR cDNA Synthesis Kit 说明书进
行 , 抑制消减杂交按 CLONTECH PCR2SelectTM cDNA Subtraction Kit 说明书的方法进行。分别以桂味败育
胚 Rsa I酶消化 cDNA 为 tester (检测子) 、正常发育胚 Rsa I 酶消化 cDNA 为 driver (驱赶子) , 进行连
续的两次消减杂交及两次 PCR , 将富含败育胚差异表达序列的第二次 PCR 产物克隆到 p GEM○R - T Vec2
tor 中 , 建立正向差异 cDNA 文库 , 代表桂味败育胚的特异表达 cDNA。PCR 产物与 p GEM○R - T Vector
的连接和转化参照 p GEM○R - T Vector 说明书的建议进行。
113 克隆的序列测定及分析
随机挑选差异 cDNA 文库的 150 个克隆 , 提取质粒 DNA , 对每个克隆的质粒 DNA 进行 EcoR I/
Hind III双酶切及单引物 PCR 扩增 , 以淘汰部分假阳性克隆。酶切参照 EcoR I 及 Hind III 试剂盒说明
进行 , 单引物扩增按 CLONTECH PCR2SelectTM cDNA Subtraction Kit 的第二次 PCR 扩增体系及相关说明进
行。最后 , 挑选能够进行质粒 DNA 酶切和只能进行质粒 DNA 双引物 PCR 扩增的 54 个克隆 (编号
G1 - 54) 送上海生工生物工程服务有限公司进行序列测定 , 测定序列用 GeneBank BLAST进行搜索比较 ,
分析每个插入 cDNA 片段序列与对应的已知基因序列的同源性。
114 Virtual Northern 分析
分别取 15μL driver (驱赶子) 和 tester (检测子) SMART cDNAs , 用 110 %的琼脂糖凝胶进行电
泳 , cDNA 经过变性及中和后 , 转移到尼龙膜上 , 将尼龙膜带有 DNA 的一面朝上放置于滤纸上 , 放入
紫外交联仪中进行交联 , 时间为 3 min , 待尼龙膜干燥后 , 置于两层滤纸之间 , 室温下保存备用。取
25～50 ng 的克隆质粒 DNA 用 Rad Prime DNA Labeling System 进行标记 , 标记操作参照 Rad Prime DNA
Labeling System 说明进行。预杂交、杂交、洗膜及放射自显影按文献 〔6〕的方法进行。
2 结果与分析
211 消减杂交 cDNA文库的构建及克隆的初步鉴定
经正向消减杂交 , 即以桂味败育胚酶消化 cDNA 为 tester (检测子) 、正常发育胚酶消化 cDNA 为
driver (驱赶子) 进行两次消减杂交 , 建立正向消减差异 cDNA 文库 , 理论上分别代表桂味败育胚与正
常发育胚的特异表达 cDNA。从差异 cDNA 文库中
挑选经过 IPTG和 X2Gal 蓝 - 白斑筛选的白斑单菌
落 150 个 , 进行质粒DNA 的提取、质粒DNA 的单
引物和双引物 PCR 扩增以及酶切分析 , 结果表
明 , 大部分克隆能提取到质粒 DNA (图 1) , 部分
克隆的质粒DNA 能进行单引物 PCR 扩增 (假阳性
克隆) (图 2) ; 酶切结果显示 , 绝大部分克隆具
有特异 cDNA 插入片段 , 而且片段大小各不相同
(图 3) 。
图 1 消减文库中部分克隆的质粒 DNA琼脂糖电泳
Fig. 1 Plasmid DNA of portion clones in cDNA library
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图 2 消减文库中部分克隆的质粒 DNA单引物扩增
Fig. 2 Single primer PCR amplification of portion
clones in cDNA library
图 3 消减文库中部分克隆的 EcoR I/
Hind III双酶切分析
Fig. 3 Analysis of digestion with EcoR I/ Hind III for portion
clones in cDNA library
1 - 8 : Clones ; 9 : p GEM○R - T
212 Virtual Northern 分析结果
54 个克隆序列经 GeneBank BLAST进行搜索比对 , 共有 14 个克隆的部分序列与相关的已知基因部
分序列有较高的同源性。对同源性较高的克隆序列进行 Virtual Northern 分析 , 结果显示 , 14 个克隆中
只有 G49、G53、G54为阳性克隆 (图 4) 。
213 败育差异表达基因 cDNA 片段序列分析及同
源性对比
21311 cDNA 片段的序列分析 利用 ABI PRISM
377296 DNA 序列测定仪对 3 个阳性克隆 (图 4)
进行序列分析 , G49、G53、G54分别由 342 bp、599
bp 和 391 bp 的特定序列组成 , 如图 5 所示。这些
cDNA 序列为研究荔枝胚胎败育提供了 DNA 参考
依据。
图 4 部分 Virtual Northern blots 结果
Fig. 4 The results of portion Virtual Northern blots
1. Tester SMART cDNA ; 2. Driver SMART cDNA ; G49 ,
G53 , G54 , clones from cDNA library
图 5 阳性克隆序列
Fig. 5 Sequences of positive clones
21312 cDNA 序列同源性对比分析 经对获得的 cDNA 序列用 GeneBank BLAST 搜索比较 , G49与已知
的甘蓝泛素结合酶基因同源性为 86 % , G53与已知的芥菜 S - 腺苷甲硫氨酸合成酶基因同源性为 85 % ,
G54与已知的拟南芥 S - 腺苷甲硫氨酸合成酶基因同源性为 85 %。
721 期 张以顺等 : 荔枝胚败育差异表达基因 cDNA 片段的克隆及序列分析
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3 讨论
抑制消减杂交是目前快速克隆差异表达基因 cDNA 的有效方法 , 与其它分离差异表达 cDNA 片段
的方法相比 , SSH具有假阳性少、重复性高等优点 , 并能对低丰度 mRNA 进行显示。本文利用 SSH 对
谢花后 20 d 的桂味败育胚及正常发育胚间差异表达进行研究 , 希望分离到与胚败育相关的 cDNA 片
段。本研究由于败育胚取材的限制 , 对阳性克隆的鉴定采用 Virtual Northern 分析 , 并证明此方法是可
行的。Northern 杂交需要较大量的总 RNA 或 mRNA , 反式 Northern blot 只有高丰度 mRNA (即 mRNA 占
探针总 cDNA 的 012 %以上) 才可产生杂交信号 , 低丰度的 mRNA 不可检测 , Virtual Northern 杂交不但
可给出与 Northern 杂交相似的信息 , 而且需要的总 RNA 或 mRNA 量较少 , 操作较方便〔7〕。
S - 腺苷甲硫氨酸合成酶基因编码 S - 腺苷甲硫氨酸合成酶 ( E1C12151116) , S - 腺苷甲硫氨酸合
成酶催化甲硫氨酸和 ATP 反应生成 S - 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 。在生物学上 , SAM 不仅是植物体内转
甲基反应的甲基供体 , 还是植物生长调节物质多胺和乙烯合成的前体〔8 ,9〕。在与已知基因部分序列同
源性较高的 3 个克隆中 , G53和 G54的部分插入 cDNA 序列分别与已知的芥菜和拟南芥的 S - 腺苷甲硫
氨酸合成酶基因的部分序列有较高的同源性 (均为 85 %) 。多胺和乙烯的生物合成与植物胚胎的发育
密切相关 , 因此 , S - 腺苷甲硫氨酸合成酶基因在荔枝败育胚中大量表达可能在某种程度上参与了其
体内乙烯合成的调控 , 最终导致荔枝胚胎的败育。
编号为 G49的 cDNA 片段 , 其推导的碱基序列与已知的甘蓝泛素结合酶基因的部分序列有较高同
源性 (86 %) 。泛素结合酶 ( E2s) 是泛素系统中的 3 个标记酶之一 , 是泛素途径中种类最多的酶系 ,
分子量在 14～35 kD 之间 , E2s 参与多种真核生物的代谢过程的调控。Ciechanover 用酵母进行突变分
析 , 较详细地研究了 E2s 的功能 , 初步证明了 E2s 介导了多种生理功能 : 参与细胞的分裂调控 , 它的
突变会影响 G1 期向 S 期的过度 , 影响 DNA 的复制和纺锥体中心粒的分离 , 使细胞停留在 G2 - M 期 ;
参与细胞内大量短寿命蛋白以及异常蛋白的降解 ; 参与 MATα2 的降解 ; 参与 DNA 修复、突变诱导、
孢子形成的抑制 ; 细胞程序性死亡等〔10〕。泛素结合酶基因是否与植物的胚胎败育有关 , 目前还缺乏
相应的依据。
本研究初步获得 3 个阳性克隆 , 并揭示了 S - 腺苷甲硫氨酸合成酶基因和泛素结合酶基因可能与
桂味荔枝品种的胚败育之间存在某种关联 , 但这两个基因到底在胚败育过程中是如何进行调控 , 还有
待进一步研究 , 其余 40 个与已知基因部分序列同源性较低的克隆的鉴定工作也在进行中。
参考文献 :
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