全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(3)：332—336
Aeta Horticulturae Sinica
百合花发育相关MADS box基因的克隆
张 云 刘青林 欧阳青 蔡文启
( 中国农业大学观赏园艺与园林系，北京 100094； 中国科学院微生物研究所，北京 100080)
摘 要：利用 RT—PCR的方法，从百合中克隆得到了3个接近全长的花发育相关 MADS box基因片段
LfMADS1—3。其中LfMADS1和LfMADS3以往未见报道，分别与多种作物的AG、SEP同源基因具有较高的
同源性；LfMADS2与已发表的LMADS2对应区段的氨基酸同源性高达98．99％，推测可能是同一个基因。
关键词：百合；花发育；MADSbox基因；克隆
中图分类号：S 682．2 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)03-0332-05
Ooning of Flower Development Associated MADS box Gene Fragments in L／／／um
Zhang Yun ，Liu Qinglinh，Ouyang Qing ，and Cai Wenqi
( Department of Ornamental Horticulture and Landscape Archhecture，China Agricultural University，Beoing 100094，China；
Institute ofMicrobiology，Chinese Academy ofSciences，Beifng 100080，China)
Abstract：LfMADS1—3，three MADS box cDNA fragments associated with flower development were
cloned from Lilium using a RT．PCR based cloning method．LfMADS1 and LfMADS3 are new MADS box genes
n lilies．which have not been reported before．They showed high sequence homology with AG and sEP homo．
1ogs．respectively．The deduced amino acid sequence of LfMADS2 shared 98．99％ identity with the reported
￡。^ DS2．which suggested that they might be the same gene．
Key words：Lilium；Flower development；MADS box gene；Cloning
百合花姿态优美、芳香宜人，但花型较为单一，野生的百合原种均为单瓣花，目前国内市场上能
够见到的也只有单瓣百合品种。此外，百合的花粉污染花瓣，影响美观。自然突变的重瓣或无花粉的
百合很难找到，即使有也难以作为育种亲本，因此通过常规育种的途径较难解决百合花型单一和花粉
污染的问题，分子生物学与生物技术的发展则为解决这个问题提供了可能。花发育的分子机理是近年
来发育生物学的研究热点。基于对拟南芥和金鱼草突变体的研究，Coen和Meyerowltz等人提出了花
发育的ABC模型假说，该假说在随后的遗传学和分子生物学研究中得到了有力的试验支持，被进一
步完善并广泛认可。花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊4轮花器官的发育，由A、B、C 3类基因控制，每类
基因分别控制相邻两轮花器官的发育；A、c两类基因相互拮抗 ．¨2 J。此后对矮牵牛花发育的研究发
现，朋尸7／11控制胚珠和胎座的发育，于是Angenent和Colombo提出将ABC模型延伸为ABCD模型，
把控制胚珠发育的基因列为 D功能基因 】。A、B、C、D基因中的绝大部分属于 MADS box基因家
族，其中拟南芥c功能基因AG的强突变体表现为雄蕊瓣化，雌蕊则由另一朵花代替，从而呈现出重
瓣花的表型 。如果从百合中分离克隆到AG同源基因，通过基因沉默技术来抑制内源AG基因的表
达，则有可能使单瓣百合的雌雄蕊变瓣，既可丰富百合的花型，又可解决花粉污染的问题。
1 材料与方法
百合 (Lilium xformolongo)‘雷山1号’由中国农业大学园林系俞红强老师惠赠。采收即将开放
收稿日期：2003～o6—23；修回日期：2003—10～3l
基金项目：北京市自然科学基金资助项目 (6o42o15)
通讯作者 Corresponding author：liuql@cau．edu．cn
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3期 张 云等：百台花发育相关MADS box基因的克隆
的花蕾，取雌蕊作为试材
总RNA的提取参照王关林等 的方法进行。以总RNA为模板，Oligo(dT) 为引物，在AMV反
转录酶的作用下台成eDNA第一链 参照风信子H．4G1、水稻OsM．4DS3、玉米ZM,W2等序列的MADS
box序列设计两个5’引物Pm：5’ATYGAGATC／AAAGAGGATA／CGAGAAC3’和Monl00：5’GAGCTG／
c rccGTc／cc rCTGcGA3‘。Monlo0位于Pn1的3’端，但不重叠。PCR体系中含dNTP 0．2 mmol·L ，
引物0．4 1．~mol-L～，Taq DNA聚合酶0．05 U· ～ 取1 L稀释100倍的eDNA第一链作模板，以
Oligo(dT)． 和Pm为引物，进行第一轮PCR扩增，反应程序为：95~C 5 mln；94oC 30 s，42℃90 s，
72。c 60 s，30个循环；72t 10 rain=然后以1 tL第一轮扩增产物作模板，Oligo(dT)， 和Monl00为
引物进行巢式PER扩增，反应程序为：95℃ 5 rain；94℃ 30 s．65℃ 60 s，72℃50 s，5个循环；
94℃3O s，62oC 60 s，72℃50 s，5个循环；94c 30 s，59℃60 s，72oc 50 s．5个循环；94℃30 s，
56℃60 s，72℃50 s，5个循环；94 30 s，60℃50 s．72℃50 s，25个循环；72℃ 10 rain。
巢式PCR产物用北京鼎国生物技术发展中心的DNA快速纯化／回收试剂盒。回收纯化后克隆于
pGEM—T Easy Vector上．转化大肠杆菌JM109感受态细胞 在含X—gal／IPTG的培养基上37~C培养过
夜．挑取白色菌落作茵落PCR和EcoRl酶切鉴定，筛选出含有插人片段韵克隆测序。将 芹得到的
核苷酸序列和推导的氨基酸序列分别在 NCBI上用 BLAST软件进行同源性检索 (htp；／／
www．ncbi nlm．nih．gov／blast)。序列的拼接、分析和同源性比较用DNAMAN软件完成。
2 结果与分析
2．1 百合花发育MADS box基因的克隆
将提取的百台雌蕊总RNA在AMV反转录酶
的作用下合成eDNA第一链。根据风信子、水稻、
玉米3个单子叶植物的AG同源基因的MADS box
区设计了一套引物。通过巢式PGR，从百台雌蕊
中扩增出约800～900 bp的目标带，与预期大小
相当 (图1)
将目标大小的带回收后连接到 pGEM-T Easy
载体上．转化大肠杆菌JM109细胞。从中挑选了
约50个白色菌落进行 PCR和 EcoRI酶切鉴定．
共鉴定出插入片段 (800—900 bp)的阳性克隆
30个 依据PCR和酶切鉴定结果从中挑选了12
个克隆进行测序鉴定。
：二圉
图l 百台M,ad~S box基因的PCR扩增
Gei~eRulerT DNA Ladder Mix；2 箕式PCR产物
PcRmlt~ mtion MADS№ h from“
Ge~RaterT Ⅱ ^ La~er Mix：2 怕ted PC Dr Ⅶns
ampl~ed from Lilium
2．2 百合MADS box基因片段的序列分析
将测序得到的核昔酸序列用DNAMAN软件翻译成氢基酸序列，选择能够正确读通的序列进行同
源性比较。结果表明，从百台雌蕊中至少克隆了3个近全长的MADS box基因的3‘端，分别命名为
LJM4DSI一3(Litiam~formolortgo)：利用BLAST在NCBI上进行检索层发现，这些克隆均具有MADS
box家旅基因所特有的MADS box和K box，与多种作物的MADS box家族基因有不同程度的同源性，
但未发现相同的序列。
LmAgSt cDNA片段长846 bp．包括编码192个氨基酸的ORF的3’端和长270 bp的3’非编码
区。BLAST结果表明，该片段与玉米、水稻等多种单子叶植物的AG同源基因具有较高的同源性 将
14MADSI的推导氨基酸序列与水稻、玉米、风信子的AG同源基因序列进行同源性比较，发现
Lfi~IADS1与这3个基因具有较高的同源性，达67％ 上，其中@AOSl与风居子HAGI的同源性虽
高，对应医段的核苷酸同源性为62．69％，氨基酸同源性为75．38％ (图2)
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334 3I卷
肼 ~4DS1 ．-．-．．．．．-．．．．．．．．-．．．．．．．．．．⋯
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1 25
1 59
1 59
1 4 6
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1 97
1 e 6
饕 N PY 墨 蠢
图2 恻 与单子叶植物c功能基因推导的氨基酸序列比较
右侧的数字代表氪基随编号．粗下划} 部廿为MADS x．钏F划线部丹为K box．黑色阴影 代袁氪基酸同源性为l∞％
灰色阴影区代表同源睡为75％．· 表白r实现最洼排列而插八的间隔．下同
Fig．2 Aliglment of deduced 8mll0 acid soquences of／d,~L4DS1 and related C functional喜en雌In n啪 o∞
The MADS x and K box domain underl⋯ w thh k and thlit lines． 一[1 &mino acids with i00％ ．75％ idenut
a shadecI in dark a．d gray．~spee Live Jy A do*indicates gap inmxiuced to optimize ahgmnent e below
LJMADS2 cDNA片段长829 bp，包括编码199 1、氡基酸的ORF的3’端和长229 bp的3’非编码区：
该片段与其他作物花发育的C、D功能基因具有较高的同源性．与Tzeng等报道的L"JADS2对应区段
氨基酸序列的同源性高达98．99％ 【图3) 陈第1 85位和第213位氨基酸发生替换外，其余氨基酸
序列完全一致。
m Z4￡ 2
￡^ 2
矾 ￡4 2
L&i4Zi~2
m 2
L~,LRD$2
L．e~ S 2
L~L4DS 2
Lpm~S 2
螂 2
l凸 2
2
MGRGKI EI KR!EN~TNRQVYFCKPRNGLLKKA
图3 啦推导的氨基酸序列与Lfv1．4DS2的同弼i性比较
Fig．3 Alignment of deduced~ilJlo acid sequences of LJMADS2 and LMADS2
7
40
47
80
87
l20
127
1 60
1 67
200
l98
231
LfMADS3 eDNA片段长797 bp．编码200个氨基酸，3’非编码区长197 bp。对其氨基酸序列进行
同源性检索后发现，该片段与葡萄、杨树、黄瓜 矮牵牛、苹果、兰花、拟南芥等多种植物的MADS
box家族基因同源性较高，但其中部分基因的功能尚未明确 在已知功能的基因中以SEP1／2／3(原
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3期 张 云等： 合拒发育相关 Ⅵ^ |)s box基因的克隆
名AGL2／4／9)同源基因为主 将推导的 ．Lk]~4OS3氨基酸序列与功能研究较为透彻的拟南芥的SEP组
基因进行同源性比较 结果表明t~t4Ds3与SEPI／2／3对应的氨基酸序列同源性分别为39．68％、
49．31％和47 71％；MADS box和K box较为保守．M区与K区之间的序列及C端变异较大 (图4)
百台~ tcos 3
拟商莽SEP1
{ 雨 SEP 2
南芹 盟 3
i ￡铆 3
诎訇 S日 l
薄 EP 2
托南芥 SEP 3
百合L~t4DS 3
拟南 SEP1
拟南 SEP 2
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拟南忭 S 2
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AQAQPGNG望I PGWM
G0 S0eGNG葛I PGWM
NYMLGWLP~—DTNSI
囤4 LIMaOS3推导的彝基酸序列与SEPI／2／3肿同诼性比鞍
P ．4 Alignment of d~uced amino acid sequences of IdMADS3 and SEPI／Z／3
3 讨论
控制花发育的基因大部分属于MADS box基因家族，该家族基因编码转录因子都具有一个保守的
DNA结合域——MADs box．功能【皂较为相似 上游基因能与下游基因的保守DNA结合域结合，从而
启动下游基因的转录=在GenBank中可查到数百个MADS box家族基因，而且一种作物中就可能存在
几十个MADS box家族基因 这些基因的序列除MADS box外．其它区域的变化较大．亚家族基因序
列的特异性并不十分明显 GenBank中公布的大多数 MADS box基因的功能尚不明了。即使在模式檀
物拟南芥上．也只是对个别基因的功能有了较为清楚的认识．仍有数十个基因的功能需要进一步研
究，基因间的互作关系则知之更少 面对MADS box这样一个庞大的基因家族，要克隆鉴定某个特定
的基因有相当的难度。
由于C功能基因只在花器官的第三、四轮．即雄、雌蕊中表达；而第三轮雄蕊中还表达有B功
能等多个基因，因此我们从雌蕊中克隆了／~／．-IDSI～3等3个基因片段。它们都具有典型的MADS
box和K box，因而可认为是百合中的MADS box基因．(4~fADS1与许多植物的c功能基因具有较好的
同源性，与同科的风信子的c功能基因HAG1的同源性最高 对LflIADS1的推导氢基酸序列分析还发
现，其3’端具有保守结构基序 “LQLG”，这与其它已知的c功能基因的结构特点一致，据此推测
LflfADS1有可能是百合中的AG同源基因。拟南芥c功能基因的强突变体 的表型为重瓣花，抑制
内源AG基因的表达可产生类似于突变体的表型 如果LfdADS1与拟南芥的AG基因功能相同，
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则通过抑制百合内源LfMADS1基因的表达可以使百合的花器官发生同源异型突变，呈现出重瓣花的
表型。LfMADS2与已知的c功能和D功能基因的同源性均较高，与LMADS2的氨基酸序列相同区段
的同源性高达98．99％，只有两个氨基酸发生了突变 ，推测可能是同一个基因。LMADS2克隆自百
合另外一个品种 ‘雪后’，氨基酸序列的差异可能是品种差异造成的。Tzeng等的试验结果表明，
LMADS2在雌蕊中表达，以35S为启动子在拟南芥中异位表达产生了类似于 和ap2的表型，推测其
可能是D功能基因 。LfMADS3与SEP1／2／3组基因的序列同源性较高，初步推测LfMADS3有可能是
百合中的SEP同源基因。SEP基因的序列及表达模式与AG十分相近，因而原名是AG—like2／4~9。这
三个基因虽较早被克隆，但直到2000年后才对其功能有了较为清楚的认识。SEP1／2／3与花瓣、雄
蕊、雌蕊的发育有关，功能部分冗余。单个基因突变体的表型变化轻微，sepl／2／3三重突变体的花器
官则全部转变为花萼 。SEP组基因与 B、c功能基因的翻译产物结合形成转录复合物后，与DNA
结合域结合，启动下游基因的转录 ¨。百合属植物的萼瓣不分，如果LfMADS3与拟南芥的SEP组基
因的功能相似，则抑制百合内源LfMADS3的表达有可能使花器官部分转变为花萼，即类似于重瓣花
的形态。
我们的最终 目标是改良百合的花型，因而更加关注转基因植物花的表型变化。近年来，双链
RNA干扰技术 (dsRNAi)的发展为基因功能研究提供了更为有效的手段，RNAi效率高、特异性强，
可使90％～100％转化株的目的基因沉默⋯j。Chuang等 ¨将含有AG基因的3’端序列反向重复串连
后，构建表达载体转化拟南芥，结果转化株的花器官呈现出 突变体的表型，即重瓣花；且突变体
的表型变化程度与AG mRNA的被抑制的水平相关。可见，双链RNA干扰技术不需要全长基因。如果
将我们克隆到的3个基因片段的5’端 MADS box去掉后，利用RNAi即可对内源目的基因的表达进行
干扰，有可能得到一系列花型发生不同程度变异的百合花。
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