全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(3)：325 327
Aa纽 Hortieultume Sinica
秋水仙素处理 ‘罗田甜柿 ’获得 12倍体再生植株
谷晓峰 罗正荣 ，2
(。华中农业大学园艺林学学院，武汉 430070； 湖北民族学院园艺系，恩施 445000)
摘 要：以 ‘罗田甜柿’试管苗离体叶片为材料，研究了秋水仙素浓度及处理时间对诱导染色体倍性
变异的影响。结果表明：0．3％秋水仙素处理 4～6 d，可诱导染色体加倍 ；与对照比较 ，再生变异植株的气
孔孔径增大，密度降低 ，根尖染色体数 2n：12x=180，叶片 DNA含量为对照的两倍。LI、LⅡ、LⅢ细胞
层均加倍的证据表明，获得的倍性变异株为同质 12倍体。
关键词：柿 ；秋水仙素 ；多倍体；再生植株
中图分类号：S 665．2 文献标识码：A 文章编号：0513—353X (2003)03．0325—03
1 目的、材料与方法
‘罗田甜柿’(Diostryros kaki Thunb．)是我国原产第 1个完全甜柿品种 ，风味浓郁，产量高，但有
果小核多的缺陷。利用 2n配子进行甜柿育种可望选育出综合性状优 良的大果无核新品种【J，2J。由于
控制被子植物许多重要经济性状的基因源自母本【3】，因此 2n雌配子在育种上具有广阔的应用前景，
但迄今还未有柿属植物天然 2n雌配子大量存在的报道。栽培柿多为 2n=6x=90的 6倍体，如果人工
诱导获得 12倍体，其减数分裂产生的雌配子与 6倍体植株 2n雌配子倍性相同，与正常 n花粉杂交，
可望获得 9倍体 (相当于种内 3倍体，通常表现 3倍体的染色体行为和伪单性结实特性)。
试材采自华中农业大学果树标本园柿圃8年生 ‘罗田甜柿’。选取枝条中上部休眠芽剥取茎尖，
接种于 1／2 MS+Zeatin 2Ⅱ L+IAA 0．05Ⅱ L培养基上，诱导分化。组培苗保存在 MS+Zeatin 1．1Ⅱ
L【 J培养基上，4～6周继代 1次。取组培苗顶部下数 2～3节的展开叶，切除叶柄和叶尖，沿中脉将叶
片切成 4～6小片，置人含有 0．1％、0．3％、0．5％、1．0％的秋水仙素溶液中，处理时间设 2、4和 6
d。从秋水仙素溶液中取出叶片，无菌水冲洗 3次。愈伤诱导及植株分化参照 Tao等【4．5】、生根参照谷
晓峰等【6】、根尖染色体倍性鉴定参照唐仙英等【7】的方法，采用碱煮法统计气孔长度及密度，采用 PA
倍性分析仪检测 DNA相对含量，分析步骤参照说明书。
2 结果与分析
2．1 倍性变异诱导
由表 1可见 ，秋水仙素对离体叶片诱导效果因处理浓度及时间不同而异。0．1％秋水仙素对离体
叶片伤害最小，但诱变效果较差，即使延长处理时间也无法获得染色体加倍的新梢 (图版，1)。随着
秋水仙素处理浓度加大，诱变效果增强，以0．3％浓度处理 4～6 d为宜。但高浓度秋水仙素对叶片毒
害作用较大，1．0％秋水仙素即使仅处理 2 d，不定芽再生率即为0，无法获得诱变新梢。
2．2 倍性鉴定
2．2．1 形态学鉴定 变异株 (图版，4)与对照 (图版，1)相比，生长缓慢，节间较短，茎粗壮。由表
2可见，变异株单位面积气孔数 目减少，大约为对照的 1／2，但气孔孔径变大 (图版，2、5)。
收稿日期：20O2—06—06；修回日期：20O2—09—19
基金项目：国家自然科学基金项目 (30啪 529)；教育部优秀青年教师资助计划项目；高等学校博士@gt专项基金项目 (1999004001)
*通讯作者。Author correspondence(E-mail：luozhr@mail．hzau．cn)．
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326 园 艺 学 报 30卷
2．2．2 细胞学鉴定 对照 6倍体 ‘罗田甜柿’根
尖染色体 2n=6x=90(图版，3)，6株变异株根尖
染色体数加倍，均为 2n=12x=180(图版，6)。秋
水仙素处理诱导的植株中还有少量非整倍体，对本
研究意义不大，在表 1中没有统计。
2．2．3 DNA含量测定 采用 PA倍性分析仪分析了
6株变异株混合叶片细胞核 DNA相对含量 (图 1)，
结果显示对照 (6倍体罗田甜柿试管苗叶片)的主
峰荧光强度为 134．63，而变异株则为 251．07，约为
对照的两倍，从而确认变异株为 12倍体。
栽培柿品种染色体数 目较多 (2n=6x=90)，
而且单宁含量丰富，培养过程中褐化严重，离体加
倍难度较大，目前仅有 ‘次郎’甜柿获得 12倍体
植株的报道【8】。本试验通过对变异株气孔、根尖染
色体数目的检测结果表明，L碾 及LⅢ层细胞染色
体已加倍。叶片由原基的 L工、LⅡ、LⅢ层细胞共
同形成，利用 PA倍性分析仪测定叶片 DNA含量，
发现变异株仅有一个主峰出现，说明3层细胞染色
体均成功加倍。因此，可以确认本试验获得的变异
株为染色体加倍的同质 l2倍体。
由于控制完全甜柿甜涩性状的基因为隐性【 ，
只有完全甜柿间相互杂交，才能获得 100％的完
全甜柿后代。而迄今所知的甜柿 2n花粉大多是在
不完全甜柿品种中发现的。通过 2n花粉授粉并结
合胚抢救虽然已经获得 9倍体【1 ，但程序复杂且
得率很低。完全甜柿 l2倍体的诱导成功，通过正
常花粉授粉即可方便地获得 9倍体新种质。因此 ，
值。
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表 1 秋水仙素处理对 ‘罗田甜柿’叶片外植体新梢
再生和变异株形成的影响
Table 1 Efects of coichicine on shoot regeneration and
nmtated phmaet fornmtion of ‘Luotian T．m璐 ’ peru
表2 变异植株与正常植株气孔密度和长度比较
Table 2 Cu parUm ofdensity and length of
stomata amongmutated and normal plant
注：同列相同字母表示经邓肯氏新复极差法检验在 O．Ol水
平上差异不显著。Note：Mean seI’aratimwithin columns by DulCSrl’s
multiple rangetest at P=O．O1．
本试验结果在完全甜柿倍性育种中有重大的应用价
荧光盘度Fluorescence intensity 荧光强度 Fluorescence intensity
圈 1 罗田甜柿 (2n=6x=90 J和诱变植株 (2n=I~X-180 J核 DNA流式细胞光度分析
l · 1 Flow cytemary ofnudear DNA conteat of ‘Imotian Thnsh
—l’pershmnm (2Ⅱ=6x=90)and mutated ptantiet(2n--12x=180)
参考文献：
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∞j _3t-口 —o _口jo
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Regeneration of Dodecapioid Plants
Persimmon Treated with C0lchicine
Gu Xiaofeng and Luo Zhengrong ，2
( cD E of and Forestry，Huazhong Agr／cu／turd Urdvers／ty，
Hube／Inst／aaefor Nat／ona／t／es，Ensh／445000，Ch／na)
A ；h ：A study of inducing polyploidy by treating ‘l_~ofian Tianshi’persimmon in vitro leaflet explants with
colchicine solution was~fonned．11Ie results indieated that mutated planflets can be induced by treating the leaflet
iI1 0．3％ colchicines solution for 4—6 d．Stomata of the mutated planflets were significantly larger than those of the
normal planflets．but the density of stomata wel~reduced signmca~tly．111e chromosome number of root—tip cell of
mutated planflets was 2n=12x=180， and nuclear DNA content of the mutated planflets were twice as much as nor-
mal hexaploid planflets．These results suggest that the ploidy of mutated planflets was autododecaploid．
Key words：Persimmon；Colchicine； Dodecaploid；Regeneration
圈版说明：1 3．罗田甜柿 6倍体 (1．组培苗；2．气孔，×120；3．根尖染色体 2n=6x=90，×800)；4—6．诱变产生的 l2倍体
(4．组培苗；5．气孔，×120；6．根尖染色体2n=12x=180，×80o)。
I ●_n 0fplm ：1—3．Hexaploid(1．Planflet；2．Stomata，×120；3．Oaromosoa~ of root—tips，2n=6x=90， ×800)；4—6．Do—
deeaploid(4．Plant．1et；5．Stomata，×120；6．a ml01 [Iles of root—t ，2n=12x=180，×800)．
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