全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 1) : 75~ 77
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 05- 08; 修回日期: 2001- 07- 04
基金项目: 广东省自然科学基金资助项目 (960467)
* 通讯作者, Email: XiuLin ye@ yahoo. com
墨兰、春兰变种和品种间同工酶分析
孙彩云 张明永 梁承邺 叶秀 *
(中国科学院华南植物研究所, 广州 510650)
摘 要: 通过酯酶 ( EST )、苹果酸酶 ( ME)、磷酸葡萄糖异构酶 PGI ( NADP) 、磷酸葡萄糖变位酶
PGM( NAD) 、超氧化物歧化酶 ( SOD) 5 种酶系统研究墨兰和春兰 17 个变种及品种的同工酶多样性, 并探
讨这些材料间的亲缘关系。5 种酶系统所得的 11个位点中 7 个是多态性位点。EST、PGM( NAD) 和 SOD 具
有多态性。上述 5种酶系统能够把供试品种和变种区分开, 并划分为墨兰和春兰类。
关键词: 墨兰; 春兰; 同工酶; 亲缘关系
中图分类号: S 68 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 01007503
1 目的、材料与方法
墨兰 ( Cymbidium sinense ) 和春兰 ( Cymbidium goeringii ) 广泛分布于我国西部和华南地区, 由于
各种变种、品种以及自然杂交种的存在, 仅凭植株的形态特征进行种质鉴定较为困难。应用同工酶技
术研究兰属植物种间或品种间亲缘关系, 已有报道1, 2 。作者以墨兰和春兰为材料, 选用 EST、ME、
PGI( NAPD)、PGM(NAD)、SOD等 5种酶系统进行研究, 目的是扩大兰属植物遗传多样性研究中可选
用的酶系统, 为扩展研究方法提供有益思路。
研究材料均为活体植株, 其中墨兰 3个品种: 黑墨、白墨和海南墨兰, 6个变种: 桃姬、文山奇
蝶、日月红、凤凰、玉狮子、状元红, 均来自华南植物研究所; 春兰5个品种: 朵香、豆瓣兰、云南
小雪素、黄花莲瓣兰、莲瓣兰, 3个野生单株: 野生春兰 A、B、C, 均来自云南。取当年生嫩叶 0. 1
g, 加 0. 5 mL 复杂磷酸提取液3 用于酯酶 (Esterase. E. C. 3. 1. 1 )、苹果酸酶 ( Malic Enzyme. E. C. 1.
1. 1. 40 ) 的提取, 或 TrisHCl提取缓冲液3 用于磷酸葡萄糖异构酶 ( Phosphoglucoisomerase. E. C. 5. 3.
1. 1. 9 )、磷酸葡萄糖变位酶 ( Phosphglucomutase. E. C. 5. 4. 2. 2 )、超氧化物歧化酶 ( Superoxe dismutase.
E.C. 1. 15. 1. 1 ) 的提取。充分研磨后, 8 000~ 10 000 r/ min离心 2 min, 分装于 5个小离心管 ( 0. 5
mL) , - 30 ! 保存备用。保存时间不超过两周。以 11. 1 %的 Sigma ( S4501) 水解淀粉制胶。EST 和
ME用硼酸锂/Tris- 柠檬酸 ( Lithiumborate, pH 8. 3 )3 , PGI( NADP) , PGM( NAD) 和 SOD用硼酸锂/
Tris- 柠檬酸 ( Lithiumborate, pH 8. 0 ) 3 电泳缓冲液系统进行电泳。在LKB电泳仪上, 4 ! , 260~ 280
V, 150 mA, 电泳 6~ 8 h。各种酶的染色方法参考文献 4 。每种酶重复 3次。用彩色负片拍照记录。
供试材料每一种酶谱的基因型用 POPGENE version 1. 3分析, 计算 Nei的遗传一致度和遗传距离, 用
UPGMA进行聚类分析和Treeview version 1. 50软件处理, 得出树状分枝图。
2 结果与分析
2. 1 酶谱情况
对供试的 17个材料分析了 5种同工酶, 其中 EST, PGM( NAD) 和 SOD具有多态性。酶谱显示:
ME只有 1个位点, EST 和 SOD各获得 3个位点, PGI( NADP) 和 PGM( NAD) 各获得 2个位点, 总共
为11个位点。其中 Me, Pgi1、Pgi2、SOD3 为保守位点, 其余为多态性位点, 多态性位点百分率为
60%。5种酶不同位点酶谱的谱带模式见图 1。由于有的酶 (如酯酶) 在不同材料间酶谱差异较大,
酶谱类型较多, 不可能全部列出。所以, 模式图中列出的是各种酶在不同位点酶谱的类型。某一材料
在某种酶不同位点处酶谱类型的组合就成为该材料的酶谱类型。同工酶谱照片见图 2。
图 1 墨兰、春兰变种和品种的同工酶谱带模式图
图中 Rm指相对迁移率 ( Relat ive mobility)。对于多位点酶,
最靠近阳极的位点记为 ∀ 1# , 其余依次记为 ∀ 2、3∃∃#。
∀ A、B、C∃∃# 代表某种酶在不同位点的酶谱类型。
Fig. 1 Schematic illustration of Isozyme in varieties and
cultivars of C. sinense, C. goeringii
Rm is the abbreviated from Relat ive mobility. For some is
ozymes w ith polymorphic loci, the most anodal locus is designated
∀ 1# , and slower migrat ing loci are assigned progressively
as ∀ 2、3∃∃# higher numbers. ∀ A, B, C∃∃# represent
the phenotype of certain isozyme in different loci.
2. 2 遗传距离和树状图
墨兰各品种间遗传距离主要集中在 0. 110 ~
0. 400之间, 平均为 0. 378。春兰品种间遗传距离
集中在 0. 015 ~ 0. 200之间, 平均为 0. 124。墨兰
和春兰材料间的遗传距离主要在 0. 130 ~ 0. 500之
间, 平均为 0. 347。树状分枝图见图 3。
从树状图上看, 春兰的 8个品种聚在一起:
豆瓣兰和云南小雪素, 野生春兰 B和 C先分别聚
图 3 墨兰、春兰变种和品种间同工酶的 UPGMA 聚类树状图
Fig. 3 UPGMA dendrogram of varieties and cultivars
of C. sinense and C. goeringii based on Nei% s
genetic distance obtained from five isozymes
图 2 墨兰、春兰变种和品种间叶片同工酶酶谱
图中材料编号与正文中材料先后顺序对应。
Fig. 2 Isozyme maps of cultivars and varieties leaves of
C. sinense and C. goeringii
The No. of samples in pictures correspond to
those in the text.
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合在一起, 黄花莲瓣兰和莲瓣兰进一步聚合, 野生春兰 A 与它们的亲缘关系最远, 其次是朵香兰。
这样的划分结果与这些品种形态特征的相似程度相符。墨兰的供试材料中, 海南墨兰和凤凰与春兰类
亲缘关系最近, 黑墨和白墨与它们亲缘关系最远。其余的 5个变种中, 桃姬和日月红, 文山奇蝶和玉
狮子聚成一组, 表明四者亲缘关系较近。状元红与黑墨和白墨的关系最近。墨兰的供试材料未象春兰
的各个品种一样直接聚成一组。联系前面的遗传距离, 墨兰9个品种之间的遗传距离远高于春兰 8个
品种间的遗传距离, 前者虽同属墨兰, 但彼此间亲缘关系不如春兰各品种间那么近, 因而未直接聚成
一个独立的分支组。形成这种情况的原因之一是桃姬、日月红、文山奇蝶、玉狮子、状元红是墨兰的
变种, 春兰的材料都是品种。本试验所用材料中, 只有白墨、海南墨兰、朵香和莲瓣兰被梁红健
等1 、叶庆生等2 选用。从本文的树状图上看, 莲瓣兰属于春兰的一个品种, 这与陈心启等5 的观点
一致。梁红健等1 则认为莲瓣兰与春兰和墨兰是平行关系。白墨、海南墨兰和朵香在本文中的分类学
位置与梁红健等1 的研究结果相符。
综上所述, 5种同工酶能够把供试材料清楚划分为墨兰类和春兰类。树状图表明了各材料间的亲
缘关系与传统分类所得的基本相同。当然, 本试验所选的酶种类和所得位点数不够多, 现有结果不能
将所有供试个体两两区分, 说明用同工酶研究兰属的类群间亲缘关系, 需要多选择酶系统以获得足够
多的多态性位点, 才能使研究结果更具科学性。与此同时, 有理由相信, 随着更多位点数多、多态性
高的酶系统的选用, 将很有可能弥补传统形态分类方法的不足, 更准确地反映出分类群间真实的亲缘
关系。
参考文献:
1 梁红健, 刘 敏, 张纯花, 等. 中国兰花 ( Chinese Cymbidium ) 部分品种的叶片同工酶分析. 实验生物学报, 1997, 30 ( 3) : 343~ 348
2 叶庆生, 文 李, 潘瑞炽. 利用同工酶和 SDSPAGE 技术对一些兰属 ( Cymbidium) 品种的分析 (简报 ) . 热带亚热带植物学报,
1999, 7 ( 4) : 337~ 341
3 王中仁. 植物等位酶分析. 北京: 科学出版社, 1996. 82~ 90
4 Weeden N F, Wendel J F. Visualization and interpretat ion of plant isozyme. In: Isozymes in Plant Biology. London: Chapman and Hall Ltd. 1990.
5~ 46
5 陈心启, 吉占和. 中国兰花全书. 北京: 中国林业出版社, 1998. 96~ 97
Analysis of Isozyme in Varieties and Cultivars of Cymbidium sinense and Cym
bidium goeringii
Sun Caiyun, Zhang Mingyong, Liang Chengye, and Ye Xiulin
( South China Institute of Botany , Academia Sinica, Guangzhou 510650)
Abstract: Five isozyme systems, EST, ME, PGI( NADP) , PGM( NAD) and SOD, were used to study the
variation of isozyme in varieties and cult ivars of Cymbidium sinense andC. goeringii as well as the relationships a
mong these taxa. Eleven loci were generated. Seven of them were polymorphic. EST, PGM( NAD) , SOD were
polymorphic, two of them could be used to distinguish all of varieties and cultivars. The result showed that these
isozyme systems could be used to distinguish cult ivars and varieties clearly, and these cultivars and varieties were
divided into C. goeringii and C. sinense .
Key words: Cymbidium sinense ; Cymbidium goeringii ; Isozyme; Variation; Relat ionship
771 期 孙彩云等: 墨兰、春兰变种和品种间同工酶分析